מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם
11 בנובמבר 2016
כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא הערכה מקבילה של ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאים אנדוקריניים ראשוניים אנושיים שגודלו ומסונכרנים במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לחקור את הדפוס הטמפורלי של הפרשת התאים וכיצד ניתן לווסת אותו על ידי שעונים ביולוגיים אוטונומיים בתא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לנו לעקוב אחר הלוציפרינים הצירקדיים כפעילות מדווחת, ובמקביל לאסוף מדיום זרימה למדידת רמות ההורמונים והמיוקינים המופרשים. כדי להכניס מדווחים ביולומינסנציה צירקדית לתאים ראשוניים על ידי התמרה לנטיויראלית, ראשית, העבירו את צלחות הפטרי בגודל 3.5 ס"מ המכילות מיובלסטים אנושיים במפגש של 30% עד 50% לארון זרימה למינרית. החלף את מדיום המיובלסט האנושי ב -2 מ"ל של מדיום גידול. לאחר מכן התמיר את תרבית התאים הראשונית על ידי פיפטינג תמיסת lentivirus לתוך הצלחת כדי להשיג ריבוי זיהום השווה לשלושה. דגרו את התאים למשך הלילה באינקובטור תרבית רקמות. החלף מדיום למחרת. כדי להשיג סנכרון במבחנה, הוסף 10 מפעיל אדניליל ציקלאז מיקרו-מולרי ב-2 מ"ל של מדיום לכל צלחת פטרי של 3.5 ס"מ המכילה את התאים הראשוניים שהועברו בעבר. דגירה על התאים למשך 60 דקות בגיל 37
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתאר שיטות לניטור ביו-לומינצנציה צירקדית לצד הפעילות ההפרשית של תאי איים של בני אדם ושפורי שריר ראשוניים. הגישה כוללת העברה של רפורטר לשעון הליבה המבוסס על לוקיפרז באמצעות וקטורים לנטיביריאליים, ולאחריה סנכרון in vitro ופריפוזיה תאית רציפה לצורך איסוף המדיום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- כרונוביולוגיה
רקע
- מקצבים צירקדיים ממלאים תפקיד מכריע בתפקודים תאיים.
- ניטור ביולומינצנציה יכול לספק תובנות לגבי פעילות תאית.
- תאי אי לבלב אנושיים חיוניים להפרשת אינסולין.
- מיוטובים ראשוניים חשובים לחקר פיזיולוגיה של השריר.
מטרת המחקר
- לבחינת הקשר בין מקצבים צירקדיים לבין פעילות הפרשה.
- לפיתוח שיטה לניטור בזמן אמת של תפקודי תא.
- להעמקת ההבנה של תהליכים מטבוליים בתאי אנוש.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העברת גנים באמצעות לנטי-וירוס לביטוי של רפורטר לוסיפראז.
- סנכרון של תרביות תאים בתנאי in vitro.
- פריפוזיה רציפה לאיסוף מצע גידול.
- מדידת ביו-לומנסינציה להערכת מקצבים צירקדיים.
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של ביולומינסנציה צירקדית בתאי איים אנושיים.
- הדגמה של פעילות הפרשה של מיוטובים ראשוניים.
- ביסוס של שיטה מהימנה לחקר מקצבים תאיים.
- מתן תובנות לגבי הגומלין בין ביולוגיה צירקדית לתפקוד תאי.
מסקנות
- המחקר מציע גישה חדשנית לניטור פעילויות תאיים בזמן אמת.
- הממצאים תורמים להבנת ההשפעות הצירקדיות על המטבוליזם.
- יישומים פוטנציאליים במחקר על סוכרת ובפיזיולוגיה של השריר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה מקבילית של ביטוי גנים של השעון הצירקדי והפרשת הורמונים בתרביות של תאי אדם ראשוניים מאפשרת בחינה ישירה של הבקרה הזמנית במערכות האנדוקריניות ובמערכת השרירים של בני אדם. גישה זו מגבירה את רמת הביטחון החזויה בתיקוף המטרה על ידי קישור של מתנדים צירקדיים מולקולריים לתפוקות הפרשתיות תפקודיות. שילוב של מדידות אלו בשלב הגילוי תומך בקידום מבוסס ניהול סיכונים של תוכניות למחקר מטבולי וכרונוביולוגי לאורך הפורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור פעילות גני השעון להפרשת הורמונים ומיוקינים בתאי אדם ראשוניים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שיבוש גני שעון מרכזיים וכימות השפעות הפרשה במורד המסלול.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מסלולים עבור מטרות מטבólicas ואנדוקריניות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקיים מערכות תאי מקור מסונכרנות ומאומתות לפיתוח בדיקות (assays) חסונות.
- מספק קריאות כמותיות במחלוף זמן הן של ביטוי גנים והן של פעילות הפרשה.
- מאפשר הערכה הדירה של השפעות תרכובות או הפרעות גנטיות על תפוקים המווסתים על ידי השעון הביולוגי (circadian).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים in vitro לפיזיולוגיה אנושית רלוונטית למחלה באמצעות שימוש בתאי שריר ובתאי איים ראשוניים.
- תומכת בגילוי ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור שיבוש בשעון המולקולרי לפנוטיפים של הפרשה תפקודית.
- מספקת רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני במחקרים בתחומי המטבוליזם והכרונוביולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבחינת השערות בנוגע לוויסות צירקדי בתאים ראשוניים של בני אדם, ובכך היא תומכת הן בתיקוף של מטרות (target validation) והן בהמשכיות תרגומית.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקה ישירה של תפקוד גנים צירקדיים והשפעתם על מסלולים הפרשתיים.
- סריקה: מספקת מודלים של תאי מקור מסונכרנים ומוכנים לבדיקה, עם פלטים כמותיים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני הפרשה וביולומינסנציה ברזולוציית זמן להשוואה סטטיסטית חסונה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הפרעה בשעון המולקולרי לפנוטיפים הפרשתיים רלוונטיים למחלה בתאי אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת בקרה צירקדית במגוון סוגי תאי מקור ומטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי מדידה מקבילים וארוכי טווח בתאי אדם ראשוניים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי קישור בין פלטים מולקולריים ופונקציונליים במערכות רלוונטיות למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות למחקר מטבולי וכרונו-ביולוגי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטרנסדוקציה לנטיווירלית, תרביות תאים ראשוניים ומדידת ביולומינסנציה.
- נדרשת גישה למערכות פריפוזיה מסונכרנות ובדיקות רגישות להורמונים/מיוקינים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך איסוף נתונים רב-זמני (time-course) הניתן לשחזור.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור סוגי תאים ראשוניים שונים או נקודות קצה הפרשתיות שונות.
- יש לתקף את יציבות הדיווח (reporter) ואת התרבית לטווח ארוך עבור כל יישום.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
