Arteriovenous (AV) Loop במודל בעלי חיים קטנים לחקר אנגיוגנזה והנדסת רקמות כלי דם
2 בנובמבר 2016
אנו מתארים גישה מיקרו עבור הדור של בלופ arteriovenous (AV) כמודל לניתוח כלי דם in vivo בסביבה מבודדת היטב מאופיין. מודל זה הוא לא רק שימושי עבור חקירת אנגיוגנזה, אלא גם מתאים באופן אופטימלי עבור הנדסה vascularized axially ורקמות להשתלה.
המטרה הכללית של גישה מיקרו-כירורגית זו היא ליצור לולאה עורקית-ורידית (arteriovenous loop) לצורך הנדסת רקמות עם אספקה דמית צירית (axioli), מיוvסקולריזציה, ויכולת השתלה, וכן לניתוח של וסקולריזציה in vivo ובסביבה מבודדת ומאופיינת היטב. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להשתמש בגופנו כביוריאקטורים חיים ליצירת סוגים שונים של רקמות עם וסקולריזציה צירית המותאמות לדרישותיו של המטופל האינדיבידואלי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתיל את הרקמה הנוצרת יחד עם הגישה הוסקולרית שלה ולחברה אותה לכלי דם מקומיים בצד המקבל, כדי להבטיח אספקה מיידית של חמצן וחומרי הזנה.
בנוסף למחקרי הנדסת רקמות, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תהליכי angiostenosis באורגניזם חי. ניתן ליישמה גם במצבים פתולוגיים, כגון angiogenesis בסרטן. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בביצועה בשל המורכבות הגבוהה של הניתוח, כגון מיקרו-אנסטומוזיס (micro anastomosis) של כלי דם תת-מילימטרי.
הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר נתקלנו במקרים קליניים עם פגמים רחבי היקף ברקמה, אשר דרשו השתלה של רקמה עם אספקת דם (vascularized tissue) ויצרו מורביליות משמעותית בצד התורם. לאחר אישור של הרדמה תקינה, שקלו את החולדה כדי לחשב את מינוני התרופות. לאחר מכן, מרחו משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות בזמן ההרדמה.
לאחר מתן תרופות לשיכוך כאבים ואנטיביוטיקה, הניחו את החולדה על פד חימום והחילו איזופלורן ברציפות. לאחר מכן, ודאו שוב את רמת ההרדמה באמצעות צביטה בבהומה. במידת האפשר, השתמשו גם באוקסימטריית דופק כדי לבדוק את רמת ההרדמה של החולדה.
המשיכו בגילוח הצדדים הפנימיים של הגפיים האחוריות. לאחר מכן, חטאו את אזור הניתוח באמצעות שפשופים לסירוגין של betadine ואלכוהול. לאחר מכן, פרסו את הגפיים האחוריות וקבעו אותן באמצעות סרט דביק.
לבסוף, מקמו את החולדה תחת מיקרוסקופ כירורגי וכסו אותה בבד סטרילי. המשיכו בניתוח תוך שימוש בנהלי סטריליזציה. פתחו את העור במרכז הירך השמאלית באמצעות חתך אורכי מהברך העליונה ועד למפשעה בעזרת סקאלפל.
בשלב הבא, בעזרת מספרי ניתוח ופינצטה מיקרוסקופית, גזרו את הרקמה התת-עורית והפציה בשכבות באורך של כ שלושה סנטימטרים. הפסיקו כאשר צרור כלי הדם הפמורלי נחשף מהעורק האובסיתי במפשעה ועד לברך. לאחר מכן, בעזרת מספרי רקמה ופינצטה מיקרוסקופית, הפרידו את כלי הדם והסירו את רקמת השומן.
במידת הצורך, בצעו קואגולציה לענפים הצדדיים באמצעות קואגולציה חשמלית. עם סיום הפעולה, כסו את שטח הניתוח בקומפרס לח וחזרו על הפרוצדורה בצדו הימני של החולדה. כעת, כאשר הפרוצדורה הראשונה הושלמה באופן סימטרי, התחילו בקציר של השתל הוורידי.
ראשית, קשרו את הווריד הפמורלי הימני באמצעות קואגולציה חשמלית בקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים כדי להשיג גרפה של כ-1 עד 1.5 סנטימטרים. לאחר מכן, הסירו את גרפת הווריד באמצעות פינצטה מיקרוסקופית. להרחבת פתחה של גרפת הווריד, השתמשו במרחיב כלי דם.
לאחר מכן, שטפו את השתל הוורידי באמצעות תמיסת heparin בעזרת קנולה להשקיה. העבירו את השתל השטוף לירך שמאל וכסו את שדה הניתוח בצד ימין בקומפרס לח. לאחר מכן, קשרו את הווריד הפמורלי בצד שמאל, באופן פרוקסימלי באזור המפשעה, באמצעות תפס כלי דם מיקרוסקופי.
לאחר מכן, בצעו קואגולציה לווריד הפמורלי (femoral vein) באופן דיסטלי בחלק העליון של הברך, לפני הפיצול. עבור האנסטומוזה, חברו את הקצה הפרוקסימלי של השתל הוורידי לקצה הפרוקסימלי של הווריד באמצעות טכניקת קצה-לקצה (end to end) עם תפר 11-0. התחילו בהנחת שני התפרים הראשונים במיקומי השעה 12 והשעה 6.
לאחר מכן, יש להניח שתיים עד שלוש תפרים נוספים בין נקודות אלו בצד הקדמי. לאחר מכן, יש להניח שתיים עד שלוש תפרים נוספים בצד האחורי. האנסטומוזיס של כלי הדם בלולאה הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול.
חשוב לוודא שהתפרים מבוצעים במדויק ככל האפשר כדי להפחית את הסיכון לסגירה של כלי הדם בלולאה. לאחר מכן, קשרו את העורק הפמורלי באמצעות תפס מיקרו-כלי דם והשתמשו בקוואגולציה אלקטרונית, באופן דומה לקשירת הווריד הפמורלי. לפני ההמשך, ודאו שכלי הדם בלולאה אינם פיתולים.
לאחר מכן, בצעו אנסטומוזה בין הקצה הדיסטלי של השתל הוורידי לבין הקצה הפרוקסימלי של העורק, תוך שימוש בטכניקת התפירה שהודגמה קודם לכן. לאחר האנסטומוזה השנייה, הגישו 25 iu של heparan באופן תוורידי. כעת, ודאו שוב שכלי הדם בלולאה אינם מסובבים ולאחר מכן הסירו את התפסנים.
עקבו אחר הלולאה במשך כחמש דקות, ובדקו אם קיימת דליפה והאם היא פתוחה. אם הלולאה פתוחה, היא תתרחב ודופק העורק יהיה נראה. במהלך התצפית, טפטפו papaverine על כלי הדם כדי למנוע עוויתות של כלי הדם.
לאחר מכן, מלאו מראש את תא ההשתלה עם החצי הראשון של תערובת המטריקס, כ-half a millileter. לאחר מכן, השקיעו את הלולאה בתוך תא ההשתלה. סגרו את פתח התא באמצעות שני קרישי פיברין ומלאו את התא עם החצי השני של תערובת המטריקס, לנפח כולל של one millileter.
כעת, הצמידו את התא לירך, אטמו את התא באמצעות המכסה שלו, ואבטחו את המכסה באמצעות תפר 6-0 שאינו נספג. לאחר מכן, קבעו את תא ההשתלה לירך באמצעות תפר 6-0 נוסף שאינו נספג. עצרו כל דימום באמצעות קואגולציה חשמלית.
לבסוף, סגרו את העור באמצעות תפרים נספגים 4-0 וכסו את הפצע בתרסיס אלומיניום. למטרות הנדסת רקמת עצם, הושתלו מספר תחליפי עצם שונים במודל לולאת A-V בחולדה. הווסקולריזציה נבדקה באמצעות מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת בתלת-ממד.
ווסקולריזציה מקדימה של מטריקס עצם ספוגית בקר מעובדת למשך שישה שבועות הובילה להישרדות גבוהה יותר של האוסטאובלסטים שהוזרקו. לולאות נאספו, נחתכו ונצבעו בנקודות זמן שונות לאחר ההשתלה. לדוגמה, צביעת H and E הראתה כי שימוש בתחליף עצם של בטא טריקאלציום פוספט הידרוקסיאפטיט עם תאי גזע מזנכימליים הביא להיווצרות של חיבורים כליים רבים בתוך שישה שבועות.
לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בחמישה עד שישה שעות, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן להשתיל מגוון רחב של גורמי תאים או נוגנים שונים כדי לחקור קשת רחבה של תנאים. טכניקה זו יעילה גם במודל לולאת וריד כבשים בבעלי חיים גדולים.
לכן, הדבר אמור לאפשר לחוקרים לייצר רקמות מועורקות בכמויות גדולות בעלות רלוונטיות קלינית. מודל זה עשוי לספק הזדמנות לבחון עורקות (vascularization) בתנאים פתולוגיים. לדוגמה, ניתן יהיה לחקור את השפעתם של גורמי גדילה ותאים שונים במהלך היווצרות רשת כלי דם בגידול
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר גישה מיקרו-כירורגית ליצירת לולאה עורקית-ורידית (AV loop), המשמשת כמודל לניתוח וסקולריזציה in vivo. טכניקה זו מועילה לחקר אנגיוגנזה ולפיתוח רקמות ניתנות להשתלה בעלות וסקולריזציה אקסיאלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- הנדסת רקמות
- ביולוגיה של כלי דם
רקע
- מודל לולאת ה-AV מאפשר לחקור וסקולריזציה בסביבה מבוקרת.
- שיטה זו יכולה להשתמש בגופו של המטופל כביוריאקטור ליצירת רקמות.
- הוא מספק גישה כלי דם מיידית לאספקת חמצן וחומרי הזנה.
- ניתן להפיק תובנות לגבי אנגיוגנזה ומצבים פתולוגיים כגון סרטן.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת רקמות מvaskulized.
- ניתוח תהליכי וסקולריזציה באורגניזמים חיים.
- חקירת המורכבות של אנגיוגנזה במצב בריאותי ובמצב מחלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות מיקרו-כירורגיות ליצירת לולאת AV.
- מיקרו-אנסטומוזיס של כלי דם פחות ממילמטר.
- ניתוח של וסקולריזציה in vivo.
- יישום המודל לחקר אנגיוגנזה של סרטן.
תוצאות עיקריות
- לולאת AV תומכת בהצלחה בהנדסת רקמות בעלות כלי דם.
- חיבור מיידי לכלי דם מקומיים משפר את אספקת הרכיבים התזונתיים.
- התקבלו תובנות לגבי תהליכי angiostenosis.
- השיטה הדגימה פוטנציאל להנדסת רקמות מותאמת אישית.
מסקנות
- גישה מיקרו-כירורגית זו היא כלי בעל ערך למחקר כלי דם.
- היא מקלה על הנדסת רקמות להשתלה המותאמות לצרכים אינדיבידואליים.
- מחקרים נוספים עשויים להרחיב את יישומיה במצבים פתולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מודל הלולאה העורקית-ורידית (AV) מספק סביבת in vivo מבוקרת לחקר אנגיוגנזה ויצירת רקמה מכווסכת, ובכך הוא נותן מענה לצורך קריטי במחקר פרה-קליני למודלים של וסקולריזציה הניתנים לשחזור. על ידי בידוד תהליכים וסקולריים מהשפעות סיסטמיות, המודל תומך בהסרה של סיכונים מכניסטיים עבור מועמדים פרו-אנגיוגניים ואנטי-אנגיוגניים. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים עבור טיפולים וסקולריים ויישומים ברפואה רגנרטיבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולים אנגיוגניים ואנטי-אנגיוגניים במערכת רלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מספק מודל סטנדרטי לתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות ויזואליזציה ישירה של היווצרות רשת כלי דם.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי יצירת נתונים כמותיים של וסקולריזציה להפחתת סיכונים הנובעים מעמימות מכניסטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות וסקולריות מתוקפות לסריקת תרכובות וניתוח סמנים ביולוגיים בהמשך התהליך.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות של הבדיקה באמצעות מיקרו-סביבה מבודדת ותא השתלה מבוקר.
- قابליות הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה על פני תנאים ניסיוניים מרובים על ידי שינוי המטריצות, התאים וגורמי הגדילה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך בהנדסה של רקמות מvaskularized שניתן להוציא מהגוף ולחבר במיקרוכירורגיה למערכת כלי הדם של המארח לצורך פרפוזיה מיידית.
- מודל פרה-קליני: מאפשר הערכה של מבנים מהנדסי-רקמה במערכת הרלוונטית למחלה לפני ביצוע מחקרים בבעלי חיים גדולים יותר.
- קידום מותאם סיכונים: מספק בסיס להחלטות go/no-go באמצעות הערכת השילוב הווסקולרי והישרדות תאים או רקמות מושתלים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
מודל לולאת ה-AV משתלב ברצף הגילוי החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים (leads), ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור תוכניות של ביולוגיה של כלי דם והנדסת רקמות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי אפשור ויזואליזציה בזמן אמת של אנגיוגנזה באמצעות דימיון תלת-ממדי ואימונוהיסטולוגיה.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה ותוצרים כמותיים באמצעות מדידת צפיפות כלי דם ופרפוזיה בתוך תא הלולאה המבודד.
- אנליטיקה: מספקת תוצרי סטטיסטיקה ממורפומטריה של כלי דם ומדדי פרפוזיה המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני באמצעות יצירת רקמות שניתן להשתילן, המקובלות עם וסקולריזציה מוקדמת וגישה וסקולרית מיידית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר למחקר של מודולטורים אנגיוגניים שונים וסוגי רקמות שונים לאורך פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתגובות כלי דם.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות דיוק מיקרו-כירורגי וסביבת תא מבוקרת.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות כלי דם וצמצום כישלונות בשלבים מאוחרים בתוכניות להנדסת רקמות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעוד ותיעדוף מותאם-סיכון של טיפולים בכלי דם ומועמדים למשחזרים, בהתבסס על פוטנציאל וסקולריזציה מתוקף.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות מיקרו-כירורגיות, ובמיוחד במיקרו-אנסטומוזה של כלי דם תת-מילימטריים.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מיקרוסקופים כירורגיים, מרחיבי כלי דם וכלי קואגולציה.
- מחייב סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של פרוטוקולים כירורגיים וניטור לאחר הניתוח כדי לוודא את פתוחות הלולאה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום המודל לסוגי רקמות שונים, מקורות תאים או פורמולציות של מטריצה.
- מוגבל על ידי המורכבות הכירורגית ועקומ הלמידה, אשר עשויים להשפיע על התפוקה והעקביות בין מנתחים שונים.
