Name: ניצול במגרש משחררים אתילן, 2-Chloroethylphosphonic חומצה, ככלי לחקר תגובה אתילן בחיידקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: חקור תגובות חיידקים לאתילן באמצעות CEPA לייצור אתילן במקום. שיטה זו מאפשרת חקר בטוח של אינטראקציות צמח-מיקרואורגניזם ותפקיד האתילן בהדבקה ובייצור תאית בקטריאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר דריו בונטה על אספקת זרעי Arabidopsis thaliana ועל הסיוע הטכני בנוגע לבדיקת התגובה המשולשת, כמו גם לסימון קווארנטה על העזרה ב-FT-IR. עבודה זו נתמכה על ידי מענק תגלית של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC-DG) ל-JLS, מלגת אונטריו לתארים מתקדמים (OGS) ל-RVA, ומלגת המלכה אליזבת השנייה לתואר שני במדע וטכנולוגיה (QEII-GSST) ל-AJV.

<ol><li>Guzmán, P., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+triple+response+of+Arabidopsis+to+identify+ethylene-related+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants.</a> Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).</li>
<li>Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+research+on+the+plant+hormone+ethylene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">History of research on the plant hormone ethylene.</a> J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).</li>
<li>Schaller, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+and+the+regulation+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethylene and the regulation of plant development.</a> BMC Biol. 10 (1), (2012).</li>
<li>Hua, J., Sakai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EIN4+and+ERS2+are+members+of+the+putative+ethylene+receptor+gene+family+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).</li>
<li>Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insensitivity+to+ethylene+conferred+by+a+dominant+Mutation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana.</a> Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).</li>
<li>Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tomato+gene+for+the+ethylene-forming+enzyme+by+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).</li>
<li>Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ethylene+removal+with+Pseudomonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Mater%22%5BJournal%5D)">Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains.</a> J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).</li>
<li>Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+chemotaxis+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+other+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Environ%22%5BJournal%5D)">Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species.</a> Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).</li>
<li>Augimeri, R. V., Strap, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytohormone+ethylene+enhances+bacterial+cellulose+production%2C+regulates+CRP%2FFNRKx+transcription+and+causes+differential+gene+expression+within+the+cellulose+synthesis+operon+of+Komagataeibacter+%28Gluconacetobacter%29+xylinus+ATCC+53582%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582.</a> Front. Microbiol. 6, 1459(2015).</li>
<li>Zhang, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ethylene+gas+and+comparison+of+ethylene+responses+induced+by+ethylene%2C+ACC%2C+and+ethephon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon.</a> Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).</li>
<li>Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+preparation+and+its+application+to+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal.+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethylene preparation and its application to physiological experiments.</a> Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).</li>
<li>Warner, H. L., Leopold, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+evolution+from+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).</li>
<li>Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution.</a> Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).</li>
<li>Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+water+vapor+pressure+on+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Schramm, M., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+production+of+cellulose+at+the+air%2Fliquid+interface+of+a+culture+of+Acetobacter+xylinum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum.</a> J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+cellulose-structure+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cellul.+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Amorphous cellulose-structure and characterization.</a> Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטות שתוארו כאן מתארות את בייצור באתרו של אתילן CEPA לחקר תגובת אתילן חיידקים באמצעות האורגניזם המודל, ק xylinus. שיטה זו מאוד שימושי כמו אתילן יכול להיות מיוצר על ידי השלמת כל בתווך מימי כי יש pH גדול מ 3.5 10,11 עם CEPA מבטל את הצורך גז אתילן טהור או ציוד מעבדה מתמחה. שיטה זו אינה מוגבלת לומד את ההשפעות של אתילן הנגזרות CEPA על חיידקים אבל יכול להיות גם להיות מותאם ללמוד בתגובה אתילן באורגניזמים איקריוטיים. חשוב כי ניסויים שליטים במקביל להתבצע עם פ...

האתילן אולפינים (C 2 H 4) התגלה לראשונה כהורמון צמח בשנת 1901 כאשר נצפתה כי השתילים אפונה, שגודלו במעבדה כי השתמשו במנורות גז פחם, הציג מורפולוגיה לא תקינה אשר נובעת (hypocotyls) היו קצרים, עבה והתכופף הצידה לעומת שתילי אפונה נורמלים; פנוטיפ מאוחר יותר כינה את 1,2 בתגובה המשולש. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי אתילן הוא phytohormone חיוני המווסת תהליכים התפתחותיים רבים כגון צמיחה, תגובת הלחץ, הבשלת הפרי והזדקנות 3. ארבידופסיס thaliana, אורגניזם מודל למחקר בביולוגיה צמח, נחקרה גם לגבי תגובתה אתילן. מוטנטים בתגובת אתילן כמה בודדו על ידי ניצול פנוטיפ בתגובה המשולש שנצפה א כהה המבוגר שתילי thaliana בנוכחות אתילן 1,4,5. מבשר biosynthetic לייצור אתילן בצמחים הוא 1-אחומצת קרבוקסילית minocyclopropane (ACC) 6 והוא נפוץ במהלך assay בתגובה המשולש להגדיל ייצור אתילן אנדוגני שמוביל 1,4,5 פנוטיפ בתגובה המשולש. למרות התגובה אתילן הוא למד נרחב בצמחים, ההשפעה של אתילן אקסוגניים על חיידקים אילתר בהרבה למרות מקירבת חיידקים עם צמחים. מחקר אחד דיווח כי זנים מסוימים Pseudomonas יכולים לשרוד באמצעות אתילן כמקור בלעדי של פחמן ואנרגיה 7. עם זאת, רק שני מחקרים הראו כי חיידקים להגיב אתילן. המחקר הראשון הראה כי זנים של Pseudomonas aeruginosa, פ fluorescens, פ putida, ופ &#39; syringae היו chemotactic כלפי אתילן באמצעות assay התקע agarose שבו agarose מותכת עורבב עם חיץ chemotaxis equilibrated בגז אתילן טהור 8. עם זאת, למיטב ידיעתנו, לא חל Furthדוחות אה באמצעות גז אתילן טהור לאפיין בתגובת אתילן חיידקים, ככל הנראה בשל המתקשים להתמודד עם גזים במעבדה ללא ציוד מיוחד. הדו&quot;ח השני של תגובת אתילן חיידקים הראה כי גדל אתילן ייצור תאי חיידקי ביטוי גנים מושפע חיידק הפרות קשורים, Komagataeibacter (לשעבר Gluconacetobacter) xylinus 9. במקרה זה, במתחם שחרור אתילן, חומצה 2-chloroethylphosphonic (CEPA) שימש ליצירת אתילן באתרם בתוך המדיום התפתחות חיידקים, תוך עקיפת הצורך גז אתילן טהור או ציוד מיוחד. CEPA מייצרת אתילן ביחס של 1: 1 יחס טוחן מעל pH 3.5 10,11 באמצעות תגובת בסיס-זרז, מסדר הראשון 12 - 14. השפלתו של CEPA מתואם חיובית עם pH וטמפרטורה 13,14 ותוצאות בייצור אתילפנטן, כלוריד ופוספט. CEPA מספקת לחוקרים המעוניינים ללמוד תגובות חיידקים אתילן עם אלטרנטיבה נוחה אתילן גזים. המטרה הכללית של הפרוטוקולים הבאים היא לספק שיטה פשוטה ויעילה ללמוד בתגובה אתילן בקטריאלי כולל אימות של רמות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של ייצור אתילן מן הפירוק CEPA במדיום התפתחות חיידקים, ניתוח של pH תרבות על מנת להבטיח CEPA הפירוק אינו פגום במהלך התפתחות חיידקים, והערכת ההשפעה של אתילן על מורפולוגיה פנוטיפ חיידקים. אנו מדגימים פרוטוקולים אלה באמצעות ק xylinus, לעומת זאת, יכולים להיות מותאם הפרוטוקולים הללו ללמוד בתגובה אתילן בחיידקים אחרים על ידי שימוש במדיום הגידול המתאים פנוטיפ המנתח.

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropane חומצה קרבוקסילית (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>מבשר ביוסינתטי של אתילן בצמחים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 4 מגזר</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>לבדיקת תגובה משולשת</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>למיצוק מצלמת</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR</td> בינונית <td>Canon</td><td>3818B004</td><td>לתמונות של פליקלים</td></tr><tr><td>צלולאז מ- Trichoderma reesei ATCC 26921&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>תמיסה מימית</td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>עבור SH</td></tr><tr><td>בינוני אקונומיקה מסחרית</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>אקונומיקה לעיקור זרעים</td></tr><tr><td>מרוכז HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>חומצה הידרוכלורית להתאמת pH</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ USB דיגיטלי</td><td>ניתן לחיבור</td><td>N / A</td><td>לתמונות של מושבות</td></tr><tr><td>אתפון (&ge; 96%; 2-chloroethylphosphonic acid)</td> <td>Sigma</td><td>C0143</td><td>תרכובת משחררת אתילן</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>עבור SH</td></tr><tr><td>בינוני Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td> צינור מיקרוצנטריפוגה <td>המייצר תאית חיידקית</td></tr><tr><td></td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td></tr><tr><td>Murashige ו- Skoog (MS) בסיסי בינוני&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana מדיום גידול</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7 ש'<תת>2</תת>O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>נתרן פוספט, הפטהידראט דו-בסיסי ל-SH בינוני</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>נתרן כלורי לתמיסת מלח ובקרה</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>נתרן פוספט, מונוהידראט מונו-בסיסי לתמיסת בקרה</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>נתרן הידרוקסיד להתאמת pH</td></tr><tr><td>סרט פרפין</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>לאיטום צלחות וצלוחיות</td></tr><tr><td>פפטון (בקטריולוגי)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>עבור SH בינוני</td></tr><tr><td>תא ספירה פטרוף-האוסר</td><td>Hausser מדעי</td><td>3900</td><td>תא ספירת תאים חיידקיים</td></tr><tr><td>מסנן עיקור פוליאתרסולפון 0.2 ומיקרו; m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>לעיקור צלולאז</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>סוכרוז עבור MS בינוני</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>עבור SH בינוני</td></tr></tbody></table>

ניצול במגרש משחררים אתילן, 2-chloroethylphosphonic חומצה, ככלי לחקר תגובה אתילן בחיידקים

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

אתילן (C2H4) הוא פיטוהורמון גזי המעורב בהיבטים רבים של התפתחות הצמח, וממלא תפקיד דומיננטי בהזדקנות ובהבשלת הפירות. אתילן אקסוגני המיושם במהלך התפתחות הצמח המוקדמת מפעיל את פנוטיפ התגובה המשולשת; היפוקוטיל קצר ועבה יותר עם וו אפיקלי מוגזם. למרות הקשר האינטימי בין צמחים לחיידקים, ההשפעה של אתילן אקסוגני על חיידקים זכתה להתעלמות רבה. זה נובע בחלקו מהקושי לשלוט באתילן גזי בתוך המעבדה ללא ציוד מיוחד. חומצה 2-כלורואתיל פוספונית (CEPA) היא תרכובת המתפרקת לאתילן, כלור ופוספט ביחס מולרי של 1:1:1:1 כאשר היא מומסת במדיום מימי של pH 3.5 ומעלה. כאן אנו מתארים את השימוש ב-CEPA לייצור אתילן באתרו לחקירת תגובת אתילן בחיידקים באמצעות החיידק Komagataeibacter xylinus הקשור לפרי ומייצר תאית כאורגניזם מודל. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים הן את אימות ייצור האתילן מ-CEPA באמצעות בדיקת התגובה המשולשת של Arabidopsis thaliana והן את ההשפעות של אתילן אקסוגני על ייצור התאית K. xylinus, תכונות הפליקל והמורפולוגיה הקולוניאלית. ניתן להתאים פרוטוקולים אלה כדי לבחון את השפעת האתילן על חיידקים אחרים באמצעות מצעי גידול מתאימים וניתוחי פנוטיפ. השימוש ב-CEPA מספק לחוקרים אלטרנטיבה פשוטה ויעילה לגז אתילן טהור לקביעה שגרתית של תגובת אתילן חיידקית.

התקנת צלחת סכמטי עבור אימות שחרור אתילן CEPA במדיום SH (pH 7) על ידי assay בתגובה המשולש מוצגת באיור 1 א - ג. זרם-תרשים המתאר את הפרוטוקול הקרומי מוצג באיור 2. Dark-מבוגר א שתילי thaliana להפגין את הפנוטיפ בתגובה המשולשת (קצר ורחב יותר hypocotyl עם וו מוגזם פסגה) בנוכחות של ACC ובנוכחות של אתילן מיוצר דרך הפירוק של CEPA על מדיום SH (pH 7), אך לא בתנאים לא מטופל ...

הפרוטוקולים המתוארים כאן מקלים על החקירה הנוחה של תגובות אתילן חיידקיות על ידי שימוש בחומצה 2-כלורואתילפוספונית (CEPA). אתילן מיוצר באתרו באמצעות פירוק CEPA במצע גידול חיידקים מימי, תוך עקיפת הדרישה לגז אתילן טהור.

ניצול במגרש משחררים אתילן, 2-Chloroethylphosphonic חומצה, ככלי לחקר תגובה אתילן בחיידקים

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק שיטה פשוטה ובטוחה ללימוד התגובה הבקטריאלית לאתילן. שיטה זו תענה על שאלות מפתח בנוגע לאינטראקציות בין צמחים למיקרובים, כגון התפקיד שאתילן ממלא בהידבקות ובקוילוניזציה של בקטריות בצמחים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאינה דורשת ציוד מיוחד והיא בטוחה הרבה יותר מטיפול באתילן גזי במעבדה.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האופן שבו ייצור תאית חיידקית מושפע מאתילן, ניתן ליישמה גם על מיקרואורגניזמים אחרים הקשורים לצמחים לצורך מחקר in vitro של האופן שבו תהליכים המתווכים על ידי אתילן מעורבים בקומיזציה של הצמח. כהכנה, הכינו 100 milliliters של מצע גידול לנבטי Arabidopsis והכינו 100 milliliters של מצע גידול חיידקי לפירוק CEPA. לאחר שמצע ה-arabidopsis הגיע לטמפרטורת החדר, העבירו 40 milliliters לבקבוק סטרילי והוסיפו למנה 40 microliters של ACC בריכוז 10 millimolar.כעת, מלאו את רבעי הצלחת בחמישה מיליליטרים של מצע ותנו לאגר להתמצק. ברבעים מנוגדים בכל הצלחות נמצאים מצע גידול חיידקים ומצע arabidopsis. השתמשו בשלושה תצורהות שונות של מצעים.טיפול ה-CEPA יתבצע בשלב מאוחר יותר בפרוטוקול. הכינו כל תצורת מצע בשלוש חזרות. לאחר שהאגר התקרר, פזרו באופן שווה כ-50 זרעים על כל רבע של מצע הארבידופסיס.לאחר מכן, דגרו את הצלחות בחושך בטמפרטורה של 4 °C למשך שלושה עד ארבעה ימים. בהמשך, לאחר דגירת הגרעינים, חשפו אותם לאור פלואורסצנטי למשך שעתיים. לאחר מכן, פזרו 10 µL של תמיססת מלאי CEPA בריכוז 500 mM על גבי האגר הבקטריאלי של תצורת צלחת אחת.ריכוז ה-CEPA הסופי באגר יהיה 1 mM. כעת, אטמו את כל הצלחות באמצעות נייר דבק למעבדה ועטפו אותן בנייר אלומיניום. לאחר מכן, הניחו את הצלחות בסביבה חשוכה בטמפרטורה של 23 °C כאשר צד האגר פונה כלפי מטה, והשאירו אותן לדגירה במשך שלושה ימים להנבטת הזרעים.לאחר נביטת הזרעים, השתמשו בפינצטה שעברה סטריליזציה בלהבה כדי להוציא שתילים השייכים לכל טיפול. בחרו 30 שתילים מכל רבע, לסך של 180 שתילים לכל טיפול. צלמו את השתילים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי או באמצעות מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה על רקע שחור, לצד סרגל לצורך קביעת קנה מידה.לאחר מכן, מדדו את אורך ההיפוקוטיל שלהם באמצעות תוכנת ImageJ. באמצעות כלי ה-straight, מדדו 10 millimeters ובחרו ב-Set Scale תחת לשונית Analyze כדי להגדיר את קנה המידה. לאחר מכן, השתמשו בכלי ה-Segmented תחת כלי ה-Straight Line כדי למדוד כל היפוקוטיל ולחצו על M כדי לחשב את אורכם.בדיקת הפליקל (pellicle assay) היא כלי ניתוח סטנדרטי לייצור תאית חיידקית. ניתוח ה-PH והניתוח המורפולוגי מפורטים בפרוטוקול זה. כהכנה, קצרו תאים מתרביות התחלה בשלוש חזרות וכמתו את התאים באמצעות תא ספירה של פטרוף-האוזר (Petroff-Hauser Counting Chamber).לאחר מכן, הכינו ארבע תערובות מאסטר של מצע בריכוזי CEPA שונים. עבור כל תערובת מאסטר, מזיגו 60 milliliters של מצע SH ב-pH 7 והוסיפו 120 microliters של תמיסת סטוק של CEPA בריכוז של אפס, חמישה, 50 או 500 millimolar, כדי להגיע לריכוזי CEPA סופיים של אפס, 0.01, 0.1 או 1.0 millimolar. ערבבו את המצעים על ידי סיבוב של הבקבוקים.נדרשת מערכת אחת של מצע עבור כל אחת משלוש החזרות, ומערכת רביעית נדרשת כדי לשמש כביקורת סטרילית. לכן, חלקו כל הכנה של 60 מ"ל מצע לארבעה אליקוואטים של 14 מ"ל. לאחר מכן, קררו מראש את האליקוואטים של 14 מ"ל לפני ההדבקה בתרביות הסטרטר המתאימות, כדי להגיע לריכוז סופי של 100,000 תאים למ"ל.שמרו את כל המבחנות המוחדרות על קרח כדי למנוע ייצור תאית. השתמשו ב-14 מיליליטר שאיריים של תמיסות ה-eliquates עבור בארות בקרה סטריליות. כעת, מכל תערובת מאסטר (master mix) של 14 מיליליטר, טענו תמיסות eliquates של שני מיליליטרים לשש בארות בלוח סטרילי בעל 24 בארות, כך שיהיו סך הכל ארבעה לוחות טעונים עבור כל תרבית התנשאה המנותחת.אטמו בזהירות את הפלטות באמצעות סרט פראפין והדגירו אותן ללא תנועה למשך שבעה ימים בטמפרטורה של 30 °C. במהלך ההדגרה, הדגירו במקביל תרבית נוזלית של 25 milliliter כדי למדוד מעת לעת את חומציות המצע. אם החומציות תרד מתחת ל-pH של 5, צמיחת האורגניזם תעכב את פירוק ה-CEPA לאתילן, ולפיכך הוא אינו מתאים לבדיקה זו.לאחר שבוע, קצרו ומדדו את המשקל הרטוב, העובי, המשקל היבש והגבישיות של הפליקל (pellicle). כדי לאסוף פליקל מהצלחת, לחצו על צד אחד של הפליקל כדי להרים את הקצה הנגדי והרימו אותו בעזרת פינצטה. תוך כדי שמירה על האחיזה, הניחו אותו על נייר סופג נקי למשך שלוש שניות כדי להסיר עודפי מצע.לאחר מכן, שקלו כל פליקל (pellicle) ורשמו זאת כמשקל רטוב. לאחר מכן, סדרו את הפליקלים לצד סרגל וצלמו אותם מהצד באמצעות מצלמה דיגיטלית בעלת רזולוציה גבוהה. נתחו תמונות אלו כדי לקבוע את העביות של הפליקלים.בשלב הבא, העבירו באופן פרטני את הפליקולות (pellicles) אל בארי של פלטה בעלת שישה בארים. טפלו בהן ב-12 milliliters של sodium hydroxide בריכוז 0.1 normal בטמפרטורה של 80 degrees Celsius למשך 20 דקות כדי ל lysed את התאים. לאחר מכן, הסירו את ה-sodium hydroxide ונטרלו את הפליקולות המטופלות על ידי שטיפה יסודית ב-12 milliliters של מים אולטרה-טהורים למשך 24 שעות עם ערבוב בפלטה בעלת שישה בארים.במהלך דגירה זו, החליפו את המים מדי שש שעות. עם סיום הדגירה, הפליקלות (pellicles) צריכות להיות לבנות. לאחר מכן, הניחו את הפליקלות על משטחי סיליקון וייבשו אותן בטמפרטורה של 50 °C למשך 48 שעות כדי להכינן אותן למדידת משקל יבש.ניתן לנתח את הגבישיות של הפליקלות באמצעות ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום בטרנספורמציה של פורייה (FTIR). נבטי Arabidopsis thaliana שגודלו בחושך הפגינו את פנוטיפ התגובה המשולשת, המתבטא בהיפוקוטיל קצר ועבה עם וו-רום מודגש, בנוכחות ACC ובנוכחות אתילן שהופק באמצעות פירוק CEPA במצע SH, אך לא בתנאים ללא טיפול. ניכר כי אורך ההיפוקוטיל של הזרעים שעברו טיפול היה קצר משמעותית מזה של ביקורת ללא טיפול.כך, אתילן שוחרר מ-CEPA על מצע SH בריכוז רלוונטי פיזיולוגית. כל הריכוזים של אתילן שנגזר מ-CEPA הפחיתו באופן משמעותי את המשקל הרטוב של הפליקל, אך לא השפיעו על עובי הפליקל, וכל הריכוזים של אתילן שנגזר מ-CEPA הגבירו באופן משמעותי את המשקל היבש של הפליקל. יתרה מכך, הידרטציית הפליקל הופחתה על ידי כל הריכוזים של אתילן שנגזר מ-CEPA.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב למדוד את ה-pH של מצע הגידול כדי להבטיח שה-pH לא יירד מתחת ל-5, כך שפירוק ה-CEPA לאתילן לא יעוכב. זכרו ש-CEPA בצורת אבקה מסוכן ביותר לריריות. יש לנקוט במשנה זהירות בעת ביצוע פרוטוקול זה.טכניקה זו תאפשר לחוקרים המגלים עניין באינטראקציות בין צמחים לחיידקים לבחון בבטחה תגובות המתווכות על ידי ethylene בתנאי in vitro. הדבר יסייע להשיל אור על האופן שבו אותות מהצמח מתווכים את הקולוניזציה וההיצמדות של חיידקים. נכון להיום, תחום זה לא נחקר מספיק.

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

מקור: Nathoo, N., et al. מערכת גידול משותף הידרופונית לניתוח סימולטני ושיטתי של אינטראקציות ואיתות מולקולריות של צמח/חיידק. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים מערכת גידול משותף הידרופונית לחקר אינטראקציות בין צמחים לחיידקים בתנאים סטריליים. שתילי צמחים מועברים למצע גידול סטרילי וחומצי, מודגרים ונבדקים לאיתור זיהום לפני החיסון באגרובקטריום. החיידקים הפעילים נצמדים לשורשי הצמח, מעבירים T-DNA לתאי הצמח ומקדמים שינויים מולקולריים המשפרים את ההתיישבות של החיידקים.

מערכת גידול משותף לחקר התגובות המולקולריות של מארחי צמחים וחיידקים המקיימים אינטראקציה

מקור: Augimeri, R. V. et al., תוך שימוש בתרכובת משחררת האתילן, חומצה 2-כלורו-אתילפוספונית, ככלי לחקר תגובת אתילן בחיידקים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את ההשפעה של אתילן שנוצר על ידי חומצה 2-כלורו-אתילפוספונית (CEPA) על צמיחת חיידקים וייצור תאית. אתילן מפעיל מסלולי איתות הממריצים סינתזת תאית, וכתוצאה מכך היווצרות פליקל משופרת. תוצאות אלה מדגישות את התגובה החיידקית לאתילן.

חקירת תגובת החיידקים לאתילן באמצעות תרכובת משחררת אתילן

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

אנו מתארים שיטה פשוטה לסינון תרביות חיידקים לייצור תרכובות מעכבות כלפי חיידקים אחרים.

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.

מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוק לדמיין Effectors מועברת בין חיידקים במהלך זיהום

מטרת כתב היד היא להציג מיתאר למחקרים הביוכימיים והפונקציונליים המקיפים את הליסים של הטבעת. צינור מרובה-צעדים זה, עם פרוטוקולים מפורטים, מאמת פעילות אנזימטית של החלבון שנבדק ומדגים כיצד לקשר את הפעילות לפעולה.

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ניסוי סימון קרבה (PL) במלפפון (Cucumis sativus L.) באמצעות חלבון AT4G18020 (APRR2)-AirID כמודל. השיטה מתארת בניית וקטור, טרנספורמציה של מבנה באמצעות חדירת אגרו-אין, חדירת ביוטין, מיצוי חלבונים וטיהור חלבונים המסומנים בביוטין באמצעות טכניקת טיהור זיקה.

תיוג קרבה מבוסס AirID לאינטראקציה חלבון-חלבון בצמחים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המאפשרת ניתוח ביטוי גנים של תא בודד על אוכלוסיות מזרקי Pseudomonas הגדלות בתוך אפופלסט הצמח.

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

חקור תגובות חיידקים לאתילן באמצעות CEPA לייצור אתילן במקום. שיטה זו מאפשרת חקר בטוח של אינטראקציות צמח-מיקרואורגניזם ותפקיד האתילן בהדבקה ובייצור תאית בקטריאלית.

ניצול במגרש משחררים אתילן, 2-Chloroethylphosphonic חומצה, ככלי לחקר תגובה אתילן בחיידקים

גלה סרטונים נוספים