Name: אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide גל אלקטרופורזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: למדו איך לאפיין קומפלקסים חלבוניים אוליגומריים בתאי A549 באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד ללא denaturing. שיטה זו מאפשרת ניתוח ישיר מליזטים תאיים ללא צורך בניקוי חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (מענק מס' 31003A_143834) ל-JP.

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול העמוד הלא denaturing שפורסם בעבר 12. במחקר זה, המדינה oligomeric של החלבון MxA הוערכה באמצעות או תאים Vero overexpressing MxA או תאים A549 IFN מגורה-α להביע אנדוגני MxA. הפרוטוקול המתואר להלן ניתן להשתמש כדי לנתח את מצב oligomeric של כל חלבון בנוסף MxA. עם זאת, אופטימיזציה נוספת ייתכן שתידרש. 1. הכנת Cell Lysate עבור עמוד חדרים denaturing הערה: כדי לנתח את מצב oligomeric של החלבון האנושי MxA בשני תאים Vero או A549, 1.0 x 10 6 התאים נקצרו. בהתאם לסוג התא או השפע של החלבון לנתח, את המספר הסלולרי צריך להיות מותאם. כמו כן, חשוב להגן על חיץ תמוגה מהחשיפה לאור, ברגע iodoacetamide הרגיש לאור מתווסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 0.3 x 10 6 A549 או Vero תאים לכל היטבעד 6-מנות היטב. שמור את התאים ב 2 מיליליטר צמיחה בינונית לכל טוב (ראה טבלה 1). דגירת תאי לילה חממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי שטיפה עם 1 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) ולנתק ידי הוספת 0.5 מ&quot;ל של 0.25% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 1x פתרון כ 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע תאים להתנתק המנה, להוסיף 0.5 מ&quot;ל מדיום הגידול ומערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים של כל אחד גם לתוך צינור אחד 2 מ&quot;ל ו גלולה אותם באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה (5,000 XG, 4 ° C, 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant ידי pipetting מבלי להפריע גלולה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם PBS 1 מ&quot;ל קר כקרח על ידי pipetting ההשעיה תא בקפידה מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים בצנטריפוגה בראש טבלה (5,000 XG, 4 ° C, 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant ידי pipetting without ניתוק התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 200 חיץ μl קר כקרח תמוגה (ראה טבלה 1) על ידי pipetting למעלה ולמטה ולשים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד, להגן lysate מן האור על ידי כיסוי הצינורות באמצעות נייר אלומיניום דגירה במשך 30 דקות על הקרח. הערה: לאחר הדגירה במשך 30 דקות על קרח, זה כבר לא חיוני בשמירה על lysate מחשיפה לאור, מאז להגנה על קבוצות תיאול חינם הוא בלתי הפיכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פסולת התא על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה מראש צונן (13,000 XG, 4 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עמודות דיאליזת חיץ דיאליזה (טבלה 1) בחדר הקר על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במהלך שלב צנטריפוגה. השתמש בעמודה עם משקל מולקולרי המנותק של 10,000. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את העמודות כדי מצוף לצוף ולשים אותם לתוך כוס המלאה עם חיץ דיאליזה. כדי להבטיח ערבוב עדין, להשתמש בוחש מגנטי. אל תיגע הממברנה. הערה: Dialysניתן לרכוש או מכינים עמודות 1.5 מיליליטר צינורות לפי הפרוטוקול שתואר על ידי פיאלה ועמיתים לעבודה 19. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודות מתוך מאגר דיאליזת המצוף לצוף. מעבירים את lysates פינה לתוך הטור דיאליזה מוכן ידי pipetting בלי לגעת קרום. צרף את העמודות כדי מצוף לצוף ולשים אותם בחזרה לתוך הכוס מלאה עם חיץ דיאליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze את lysate בתוך מבחנה המכילה מאגר דיאליזה קרים כקרח (טבלה 1) לפחות 4 שעות (או רצוי לילה) בשעה 4 ° C תוך ערבוב בזהירות בעזרת בוחש מגנטי. השתמש לפחות חיץ דיאליזה 100 מ&quot;ל עבור lysate 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם dialysed לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. הסר משקעים ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה (13,000 XG, 4 ° C, 20 דקות). כדי למנוע ניתוק של החלבון oligomeric מתחמי להמשיך עם פרוטוקול (סעיף 2) מיד לאחר דיאליזה. אין להקפיאאת lysates המוכן. </li></ol> אלקטרופורזה 2. הערה: אלקטרופורזה בוצע כפי שתואר קודם עם כמה שינויים 22. בפרוטוקול המתואר להלן, ג&#39;לים שיפוע מראש יצוק שימשו (שיפוע 4-15%). לחלופין, ג&#39;ל ניתן להכין במעבדה. זה מאוד חשוב לכלול כל סוכן denaturing כגון SDS כדי למנוע ניתוק של קומפלקסים חלבונים oligomeric. זמן של אלקטרופורזה הוטב מדינות oligomeric השונות של חלבון MxA אדם. עם זאת, זה יכול להשתנות עבור חלבונים אחרים, תלוי בגודל של מתחם oligomeric כמו גם המגוון של פרדה שאמורה להיות מושגת על מנת לנתח את המורכבות. לכן, הזמן האופטימלי של אלקטרופורזה צריך להיקבע באופן אמפירי. עבור הרזולוציה המיטבית של oligomers להיות מנותח הזרם לא יעלה על 25 מילי-אמפר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הג&#39;ל עמוד הלא denaturing בתא ג&#39;ל. מלאו tהוא תא פנימי וחיצוני עם חיץ ריצה מראש צונן (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להפעיל את הג&#39;ל עם חיץ ריצה מראש צונן במהירות של 25 מיליאמפר לכל ג&#39;ל במשך 15 דקות בחדר הקר על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 15 μl של lysates מוכן לעיל עם 5 μl של חיץ מדגם 4x (טבלה 1). אין להרתיח את המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 15 μl של מדגם ורמת חלבון יליד הבחירה על הג&#39;ל. הפעל את הג&#39;ל על 25 מילי-אמפר עבור 4 שעות בחדר קר ב 4 ° C.. הערה: עבור ניתוחים וכמותיות, פרוטוקול כימות חלבון (למשל ברדפורד חלבון assay 23) יכול להתבצע על מנת להבטיח טעינה של כמויות שוות של חלבון הכולל לכל נתיב. </li></ol> 3. כתם המערבי הערה: מתוארת להלן הפרוטוקול של מערכת כתם מערבית רטובה. ניתן להשתמש בכל קרום סופג. הפעל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) ממברנות מתנול 100% לפני איזון ב סופג buffer. טכניקת הכתם המערבית חצי היבשים יכולה לשמש לחלופין, אבל צריך להיות מותאם במיוחד מתחמי oligomeric גדולים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את הג&#39;ל ובזהירות להעביר אותו למאגר SDS (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך רעד בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 2 ספוגים, 4 גיליונות נייר תאי מסנן קרום סופג לכל ג&#39;ל. משרים אותם סופג חיץ (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את הכריך כדלקמן (מלמטה למעלה): 1 ספוג, 2 גיליונות נייר תאיים מסנן, קרום, ג&#39;ל, 2 גיליונות נייר תאיים מסנן, 1 ספוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את הכריך לתוך הטנק סופג. ודא כי הקרום פונה קוטב בתוספת בעוד ג&#39;ל פונה קוטב מינוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את מיכל סופג עם חיץ סופג מראש צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ב 90 mA הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך תוצאות העברת חלבון הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את הכריך ולדמיין תקן החלבון ידי דוגרי קרום Poncפתרון S eau במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain הממברנה על ידי שטיפה את Ponceau S בזהירות עם מים ללא יונים עד שאתה יכול לראות את הלהקות בבירור התקן החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את הלהקות של תקן החלבון באמצעות עט. הערה: שיורי Ponceau S יכול להפריע immunostaining. כדי למנוע זאת, הקרום ניתן destained עוד יותר על ידי דגירה ב 0.1 M NaOH 1 דקות ושטיפה לאחר מכן עם מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם חסימת חיץ (ראו טבלה 1) לפחות שעה 1 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו חלבון (ים) של עניין על ידי immunostaining באמצעות נוגדנים המכוונים נגד החלבון להיות מנותח. הערה: החלבון האנושי MxA היה דמיין באמצעות נוגדן polyclonal הארנב ספציפי אדם MX1 מדולל 1: 1,000 בחסימת מאגר (טבלת 1). פתרון נוגדן הודגר הלילה ב 4 ° C.. לחלופין, א חד השבטיNTI-MxA נוגדן (שיבוט 143) יכול לשמש (מידע לא מוצג) 24. </li></ol>

<ol><li>Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine+zipper-mediated+homo-oligomerization+regulates+the+Rho-GEF+activity+of+AKAP-Lbc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc.</a> J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).</li>
<li>Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+cell-cell+adhesion+by+classical+cadherins%3A+Critical+role+for+low-affinity+dimerization+through+beta-strand+swapping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).</li>
<li>Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TBP+dimerization+in+preventing+unregulated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression.</a> Mol Cell. 3, 717-727 (1999).</li>
<li>Torshin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+oligomerization+as+intermediate+level+of+signal+transduction%3A+analysis+of+protein-protein+contacts+and+active+sites+in+several+glycolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes.</a> Front Biosci. 4, 557-570 (1999).</li>
<li>Goodsell, D. S., Olson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+symmetry+and+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Structural symmetry and protein function.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).</li>
<li>Flydal, M. I., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+hydroxylase%3A+function%2C+structure%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation.</a> IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).</li>
<li>Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MxA+protein%3A+an+interferon-induced+dynamin-like+GTPase+with+broad+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity.</a> J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).</li>
<li>Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mx+GTPases%3A+dynamin-like+antiviral+machines+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity.</a> Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).</li>
<li>Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+backfolding+of+the+carboxyl-terminal+end+of+MxA+protein+is+a+prerequisite+for+its+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization.</a> J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).</li>
<li>Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+GTPase-negative+MxA+mutant+with+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity.</a> J Virol. 74, 8202-8206 (2000).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+myxovirus+resistance+protein+a+reveals+intra-+and+intermolecular+domain+interactions+required+for+the+antiviral+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function.</a> Immunity. 35, 514-525 (2011).</li>
<li>Nigg, P. E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+GTP-binding+Requirements+of+MxA+for+Viral+Target+Recognition+and+Antiviral+Activity+against+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus.</a> J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oligomerization+in+the+stalk+region+of+dynamin-like+MxA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA.</a> Nature. 465, 502-506 (2010).</li>
<li>Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiparallel+leucine+zipper-directed+protein+reassembly%3A+Application+to+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein.</a> J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).</li>
<li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterisation+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Wyatt, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Scattering+and+the+Absolute+Characterization+of+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules.</a> Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins.</a> Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+antiviral+protein+MxA+interacts+with+the+cellular+RNA+helicases+UAP56+and+URH49%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49.</a> J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).</li>
<li>Stertz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced%2C+antiviral+human+MxA+protein+localizes+to+a+distinct+subcompartment+of+the+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum.</a> J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).</li>
<li>Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+human+MxA+GTPase+into+highly+ordered+dynamin-like+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers.</a> J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+%28Orthomyxoviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).</li>
<li>Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missorting+of+LaCrosse+virus+nucleocapsid+protein+by+the+interferon-induced+MxA+GTPase+involves+smooth+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes.</a> Traffic. 5, 772-784 (2004).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת הקביעה המהירה של מדינת oligomeric של חלבונים לידי ביטוי בתאי יונקים ידי עמוד הלא denaturing ואחריו ניתוח כתם מערבי. היתרון העיקרי של גישה זו היא כי המדינה oligomeric של חלבון נתון ניתן לקבוע מן lysates התא כולו ללא טיהור חלבון לפני. זו עשויה להיות חשובה עבור חלבוני oligomerize או להפעיל תפקידם בשיתוף עם גורמי עזר. בנוסף, החלבונים הם עדיין במצב הטבעי שלהם ואם חילוץ נוסף מן הג&#39;ל, הפעילות האנזימטית או פונקציות חלבון אחרות ניתן לקביעה, בקורלציה למ...

<html> המבנה הרביעון של חלבון ממלא תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. מסלולי איתות, ביטוי גנים, ואנזים הפעלה / ביטול הפעלה כל מסתמכים על ההרכבה הנכונה של קומפלקסי חלבונים 1-4. תהליך זה ידוע גם בשם שָׁוֶה או-oligomerization הטרו נובע קוולנטי בלתי הפיך או הידרופובי אלקטרוסטטית הפיך אינטראקציות חלבון-חלבון. Oligomerization לא רק מגוונת את תהליכים תאיים שונים מבלי להגדיל את גודל הגנום, אלא גם מספק אסטרטגיה חלבונים לבנות מתחמי יציבה כי הם עמידים יותר כלפי denaturation והשפלה 5. פגמים oligomerization להשפיע על תפקודם של חלבונים והוא יכול להוביל להתפתחות של מחלות. לדוגמה, hydroxylase פנילאלנין האנזים יוצר מורכבות tetrameric. כמה מוטציות במתחם חלבון יכול להחליש את היווצרות tetramer ולהוביל פנילקטונוריה מחלת 6. s = &quot;jove_content&quot;&gt; חלבון MxA האדם הוא אינטרפרון (IFN) -induced חלבון מפעיל אנטי הפעלת פעילות אנטי רחבה נגד RNA השונה וכן נגיפי DNA 7. היא שייכת superfamily של GTPases גדול דמוי dynamin ויש לו את היכולת ליצור מבנים oligomeric גדול במבחנה 8. Oligomerization הוצע להגן MxA מפני השפלה המהירה 9,10. למרות ניסיונות נמרצים מצד קבוצות מחקר רבות, את המנגנון המולקולרי של פעולה נותר חמקמק בעיקר ואת תפקידה של מדינת oligomerization של MxA לתפקוד אנטי שלה נמצא תחת דיון 9,11,12. בהקשר זה, גאה ועמיתים לעבודה הציעו מודל שבו MxA מפעיל הפעילות אנטי שלה על ידי אינטראקציה עם נוקלאופרוטאינים ויראלי בצורה של מבני oligomeric גדולים דמוית טבעת 11. עם זאת, ולאחרונה, הראינו כי הדימרים MxA תערוכת פעילות אנטי אינטראקציה עם nucleoprotein של נגיף שפעת A 12. Based על המבנה הגבישי של MxA, גאו ועמיתים לעבודה זיהו מספר שאריות חומצת אמינו באזורי ממשק כי הם קריטיים עבור oligomerization שלה במבחנה ותפקוד אנטי שלה 11,13. לכן, על מנת להבהיר הקובעות oligomeric של MxA מפעיל פעילות אנטי, ביקשנו להקים פרוטוקול פשוט במהירות כדי לקבוע את המצב oligmeric של מוטציות ממשק MxA לידי ביטוי בתאים אנושיים, כמו גם אנדוגני MxA הביע לאחר גירוי IFNα. אמנם יש טכניקות רבות שאינם בשימוש נפוץ כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבונים כגון החלבון המפוצל גרין פלורסנט (פיצול-GFP) assay השלמה 14, תהודת plasmon משטח 15 והעברת אנרגית תהודת פורסטר (סריג) 16, הם אינם מספקים מידע של stoichiometry המדויק של קומפלקס חלבוני oligomeric. לקבלת חקירה של היבט מסוים זה, טכניקות כגוןפיזור רב-זווית אור (יונקים) 17 ו ultracentrifugation אנליטית 18 הם מאוד שימושיים. בדרך כלל, את החלבונים נותחו באמצעות שיטות אלה הם חלבונים מטוהרים. תהליכי oligomerization עשויים להיות תלויים גם בגורמים תאיים אחרים. אם הגורמים הללו אינם ידועים, הניתוח הוא יותר קשה. בנוסף, כמה חלבונים שקשה לבטא ב E. coli כדי לטהר. לכן, שיטות אלה אינן הבחירה האופטימלית לנתח oligomerization חלבון בסביבת הסלולר. בנוסף, טכניקות אלה דורשים מכשירים יקרים אשר אינם זמינים. ג&#39;ל polyacrylamide ללא denaturing אלקטרופורזה (עמוד), כרומטוגרפיה הדרה גודל או crosslinking כימיים ואחריו סולפט dodecyl נתרן קונבנציונאלי (SDS) -PAGE הם כלי שימושי לאפיון היווצרות של oligomers מ lysates תא 2,19,20. שיטות אלו אינן מחייבות ציוד מיוחד והוא יכול להיות בקלות PErformed במעבדה סטנדרטית. אנחנו בתחילה העריכו פרוטוקולים cross-linking כימיים שונים שהובילו invariantly להצטברות הלא ספציפית ומשקעים של MxA. לכן, אנחנו הבאים נבדקים פרוטוקולי עמוד הלא denaturing. כדף הלא denaturing כולל את השימוש SDS, הגירה של חלבונים תלוי תשלום מולדתם. עמוד כחול-יליד משתמש G250 הכחול המבריק coomassie לטעון חלבונים עם תשלום הכולל שלילי, בדומה SDS, אבל לא לפגל החלבון 21. למרבה הצער, coomassie משקע כחול מבריק בנוכחות מלחי גבוה קטיונים divalent (למשל Mg 2+) כלולים לעתים קרובות מאגרים תמוגה. בהתאם המאגרים בשימוש, זה עלול להיות קשה לנתח את המדגם מבלי אופטימיזציה נוספת של צעדים, עלול להיות בעל השפעה על החלבון המורכב oligomeric. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט המבוסס על שיטה שפורסמה בעבר 22 כדי לקבוע oligomerization שלחלבון אנושי MxA נגזר lysates הסלולר באמצעות עמוד הלא denaturing.

<table><tbody><tr><td>יחידות דיאליזה Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.5 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>שיווי משקל מקדים במאגר דיאליזה (אם רוצים להסיר גליצרול) ניתן לייצור עצמי על פי Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash; 15% ג'ל חלבון טרומי Mini-PROTEAN TGX, 10 בארות,</td> <td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>הפעלה מוקדמת במאגר רץ להתאמת מערכת החיץ</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, ללא EDTA</td><td>&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>להשתמש בטבליה אחת לכל 50 מ"ל</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4&nbsp; בקבוק 500 מ"ל Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td><חזק>רעיל</חזק> ללבוש כפפות ולהגן על העיניים</td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard&nbsp; 50 &micro; l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>עומס 5 ומיקרו; l/well</td></tr><tr><td>תאי A549</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>גדלים במצע גידול (ראה <חזק>טבלה 1</חזק>)</td></tr><tr><td>תאי Vero</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>גדלים במדיום גידול (ראה <חזק>טבלה 1</חזק>)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד Mx1</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>השתמש בדילול של 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL אנטי-ארנב IgG, נוגדן שלם מקושר לחזרת פרוקסידאז (מ חמור)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>שימוש בדילול של 1:10,000</td></tr><tr><td>0.5% טריפסין-EDTA (1x)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Life Technologies</td><td>תרמו פישר</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמיד&nbsp; &nbsp; 5 גרם</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>מלאי&nbsp; 100 מ"מ</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4.5 גרם/ליטר גלוק,+L-Glut,+טכנולוגיות חיים פירובט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>עט&nbsp; סטרפטוקוקוס 100 x&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 מ"ל&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; לייף טכנולוג'יז</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמקס 100x סטוק, 100 מ"ל&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, דיאליזה, מקור ארה"ב 500 מ"ל Gibco Lot: 42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון תאית</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF blotting&nbsp; ממברנה</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, נטול EDTA</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS תמיסה 10%</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט (Na3VO4)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-גליצרופוספט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב</td><td>Migros/Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>נתרן קלוריד (NaCl)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>אמרסקו</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון של קומפלקסים חלבונים multi-למקטע של mxa האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

היווצרות קומפלקסים אוליגומריים היא תנאי הכרחי למבנה ותפקוד תקינים של חלבונים רבים. חלבון האפקטור האנטי-ויראלי MxA המושרה על ידי אינטרפרון מפעיל פעילות אנטי-ויראלית רחבה נגד נגיפים רבים. MxA הוא GTPase דמוי דינמין ויש לו יכולת ליצור מבנים אוליגומריים מסדר גבוה יותר. עם זאת, האם אוליגומריזציה של MxA נדרשת לפעילותו האנטי-ויראלית היא נושא לוויכוח. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט להערכת המצב האוליגומרי של MxA המתבטא באופן אנדוגני או אקטופי בחלק הציטופלזמי של קווי תאים אנושיים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ללא דנטורציה (PAGE) בשילוב עם ניתוח כתמים מערביים. שלב קריטי בפרוטוקול הוא בחירת חומרי ניקוי למניעת צבירה ו/או משקעים של חלבונים הקשורים במיוחד לממברנות תאיות כגון MxA, מבלי להפריע לפעילותו האנזימטית. היבט מכריע נוסף של הפרוטוקול הוא ההגנה הבלתי הפיכה על קבוצות התיול החופשיות של שאריות ציסטאין על ידי יודואצטמיד כדי למנוע אינטראקציות מלאכותיות של החלבון. פרוטוקול זה מתאים להערכה פשוטה של המצב האוליגומרי של MxA ויתר על כן מאפשר מתאם ישיר של הפעילות האנטי-ויראלית של מוטציות ממשק MxA עם המצבים האוליגומריים שלהם.

באמצעות עמוד הלא denaturing, ניתחנו את המדינה oligomeric של סוג בר האנושי MxA, את MxA מוטציות ממשק dimeric (R640A) ו MxA (L617D) וכן מוטציה ממשק monomeric MxA (M527D) מ lysates תא 12. התאים היו lysed במאגר המכיל 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) ו iodoacetamide כדי להבטיח חלבון solubilization והגנה על קבוצות תיאול בחינם (ראה איור 1). כפי שתוארו קודם לכן, מלח מטבוליטים קטנים הוסרו על ידי דיאליזה 19. הפרדת חלבון בוצעה על ידי עמוד הלא den...

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט ומהיר להערכת המצב האוליגומרי של חלבון GTPase MxA דמוי דינמין מליזאטים של תאים אנושיים באמצעות שילוב של PAGE שאינו דנטורציה עם ניתוח כתמים מערביים.

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לקבוע את מספר התתי-יחידות בקומפלקסים חלבוניים הומו-אוליגומריים בליזאטים של תאים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד-סודיום דודציל סולפט שאינה דנטורטיבית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון המצב האוליגומרי של חלבונים המעורבים בתהליכים תאיים בסיסיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאינה דורשת טיהור של הקומפלקסים החלבוניים ההומו-אוליגומריים או ציוד ייעודי ויקר.לפיכך, ניתן לבצעו ברוב המעבדות. ניסוי זה משתמש בשני סוגי תאים: תאי A549 המבטאים חלבון Myxovirus resistance A אנדוגני, או MxA; ותאי virocells המבטאים ביטוי יתר של MxA.זריעה של תאי A549 ותאי virocells בצלחות של שש בארות עם שני milliliters של מצע גידול לכל בארה. הדגירה של התאים תתבצע למשך לילה באינקובטור לתרביות תאים. למחרת, יש לקצור את התאים.שטפו כל באער במיליליטר אחד של PBS ושחררו את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של תמיסת 0.25%Trypsin-EDTA למשך כחמש דקות בטמפרטורת החדר. מיד עם ניתוק התאים מהצלחת, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מצע גידול, וערבבו בזהירות על ידי פיפטור למעלה ולמטה. העבירו את התאים מכל באער לפרועת של שני מיליליטר, והשקיעו אותם באמצעות צנטריפוגת שולחנית.הסיר בזהירות את הנוזל העליון באמצעות פיפטינג, מבלי להפריע למשקע התאים. שטוף את התאים על ידי הוספה של 1 ml של PBS קר בטמפרטורת קרח וביצוע פיפטינג זהיר של תגלי התאים למעלה ולמטה. השק תאי התאים בצנטריפוגה שולחנית.הסיר בזהירות את העילוי באמצעות פיפטור מבלי לנתק את משקע התאים. הוסף 200 µL של תמיסת ליזיס קרה מאוד, השהה את התאים על ידי פיפטור למעלה ולמטה, ולאחר מכן הנח על קרח. הגן מיד על הליזט מפני אור על ידי כיסוי המבחנות בנייר אלומיניום, מכיוון שה-iodoacetamide בתמיסת הליזיס רגיש לאור.דגרו בקרח למשך 30 דקות. השימוש ב-iodoacetamide הוא קריטי מכיוון ש-iodoacetamide מגן באופן בלתי הפיך על קבוצת התיול של ציסטאינים חופשיים על ידי יצירת קשר תיואתר ומונע אגרגציה מלאכותית של חלבונים. לאחר מכן, הסירו את שיירי התאים על ידי סנטריפוגציה בסנטריפוגה שולחנית שקולתהה.במהלך הסנטריפוגציה, הכין עמודי דיאליזה עם סף משקל מולקולרי (MWCO) של 10,000. חבר את עמודי הדיאליזה למצוף והנח אותם בתוך כלי זכוכית (beaker) מלא בבופר דיאליזה שקולל מראש כדי להשוות את העמודים. אין לגעת בממברנה.הנח בוחש מגנטי בכלי כימי והעבר את הכלי לחדר הקירור. בעזרת הבוחש המגנטי להבטחת ערבוב עדין, בצע השוואת טמפרטורה למשך 20 דקות ב-4 °C. לאחר 20 דקות, הוצא את העמודות מתוך בופר הדיאליזה וממצוף הציפה.העבירו את הליזאטים המזוקקים לעמודי הדיאליזה שהוכנו באמצעות פיפטינג, תוך הקפדה לא לגעת בממברנה. חברו את העמודים למצוף. החזירו אותם לכלי הביקר המלא בבופר דיאליזה, ולאחר מכן העבירו את כלי הביקר לחדר הקירור.בצעו דיאליזה לליזאט למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורה של 4 °C, תוך ערבוב זהיר באמצעות מערבל מגנטי, כדי להסיר מטבוליטים קטנים ומלחים שעלולים להפריע לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד לא דנטורטיבי. עם סיום הדיאליזה, העבירו כל דגימה שעברה דיאליזה למבחנה של 1.5 ml. הסירו משקעים באמצעות סרקיזציה בצנטריפוגת שולחן.יש לבצע את האלקטרופורזה מיד לאחר דיאליזה של הליזאטים כדי למנוע את הדיסוציאציה של קומפלקסי החלבון האוליגומריים. מלאו את תא הג'ל הפנימי והחיצוניני במסיינר (running buffer) שקולל מראש. בצעו הרצה מקדימה של ג'ל הפוליאקרילמיד הלא-דנטורטיבי עם מסיינר שקולל מראש בזרם של 25 milliamps לכל ג'ל למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.ערבבו 15 µL מהליזט שהוכן עם חמישה µL של 4X sample buffer. טענו לג'ל סטנדרט חלבוני נטיבי (native protein standard) לפי הבחירה ו-15 µL מהדגימה. הרכיצו את הג'ל בזרם של 25 mA למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 4 °C.עם סיום האלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד לא דנטורטורי, פרקו את הג'ל והעבירו אותו בזהירות לתוך בופר SDS. דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוךما ניעור עדין. הכינו שני ספוגים, ארבעה דפי נייר סינון מסלולוז וממברנת בלוטינג עבור כל ג'ל, והשרו אותם בבופר בלוטינג.הרכיבו את ה"סנדוויץ'" באופן הבא, מלמטה למעלה: ספוג אחד, שני דפי נייר סינון מסלולוז, ממברנת בלוטינג, הג'ל, שני דפי נייר סינון מסלולוז וספוג אחד. הכניסו את ה"סנדוויץ'" למכל הבלוטינג, תוך כדי וידוא שהממברנה פונה לקוטב החיובי והג'ל פונה לקוטב השלילי.מלאו את מיכל הבלוטינג (blotting tank) בתמיסת בלוטינג מקוררת מראש. לקבלת תוצאות העברה מיטביות של חלבונים, בצעו בלוטינג בזרם של 90 milliamps למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, פרקו את ה"סנדוויץ׳".דגרו את הממברנה בתמיסת Ponceau S למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להנמיך את סולם החלבונים הסטנדרטי. הסירו את הצבע מהממברנה על ידי הנחתה במים דה-יוניים ושטיפתה. לאחר העברת הממברנה לתבנית, סמנו את רצועות החלבון הסטנדרטי באמצעות עט.חסמו את הממברנה באמצעות תמיסת חסימה למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החלבונים הנחקרים הודגמו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית בעזרת נוגדן פוליקלונלי של ארנב המכוון נגד MxA, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. תאי Virocells חסרי MxA אנדוגני הטרנספקטו עם MxA רקומביננטי מסוג wild type ועם וריאנטים מונומריים ודימריים של MxA.נדידת הווריאנטים של MxA הרקומביננטי במשקל המולקולרי הצפוי שלהם אישרה את מצבם האוליגומרי. MxA מסוג בר (wild type) שהובע אקטופית נדד כטטראמר. חלבונים רקומביננטיים אלו שימשו לאחר מכן להערכת המצב האוליגומרי של חלבון MxA אנושי אנדוגני שהופק מתאי A549 שעברו גרייה באמצעות interferon-alpha.התוצאה גילתה כי הגודל של MxA בליזטים של תאי A549 שעברו גרייה באינטרפרון-אלפא תואם לטטראמר. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ביום וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לא להקפיא ולהפשיר את הדגימות במהלך התהליך כולו, שכן הדבר עלול להרוס אינטראקציות בין חלבונים או לגרום לאגרגציה של חלבונים.בנוסף, בעבודה עם ריאגנטים הרגישים לאור, כגון iodoacetamide, חשוב להגן על הדגימות מפני אור במהלך שלב הליזיס. לאחר ביצוע SDS-PAGE לא דנטורטיבי, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון מיצוי חלבונים מג'ל, בדיקת פעילות אנזימטית של AsiS או PAGE דו-ממדי, וזאת כדי לענות על שאלות נוספות כגון פעילות אנזימטית ואפיון של קומפלקסים הטרו-אוליגומריים פוטנציאליים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את הרכבם של קומפלקסים חלבוניים אוליגומריים בתאים בתרבית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הכנת ליזאטים של תאים מתרביות תאים לצורך חקר חלבונים אוליגומריים בניתוח PAGE לא דנטורטיבי. זכרו כי עבודה עם iodoacetamide עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות והגנה על העיניים.

characterization-multi-subunit-protein-complexes-human-mxa-using-non

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

סרטון זה מתאר PAGE מולטימרי להפרדת קומפלקסים חלבוניים טבעיים מהומוגנאטים ברקמות. הטכניקה היא הכלאה של טכניקות כחולות-ילידיות-PAGE ו-SDS-PAGE. ניתן לאפיין ולחקור את המתחמים המופרדים על תפקידם בתפקוד התא.

Multimer-PAGE להפרדת קומפלקסים חלבוניים מקומיים: טכניקת הפרדה היברידית המורכבת מ- Blue Native-PAGE ו- SDS-PAGE להפרדת חלבונים מולטימריים שלמים מליזט רקמות

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

מוצינים הם גליקוקונוגטים בעלי משקל מולקולרי גבוה, עם גודל שנע בין 0.2 ל-200 מגה-דלטון (MDa). כתוצאה מגודלם, מוצינים אינם חודרים לג'לים פוליאקרילאמידים קונבנציונליים ודורשים נקבוביות גדולות יותר להפרדה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאלקטרופורזה של ג'ל מוצין אגרוז כדי להעריך כימות יחסי ולחקור את הרכבת הפולימרים.

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של מיטוכונדריאלי תפקודי שרשרת התחבורה אלקטרונים מתח (Cx) IV ו supercomplexes מהם באמצעות אלקטרופורזה יליד לחשוף מידע על הרכבה שלהם המבנה. ג'ל הילידים יכול להיות נתון immunoblotting, מבחני ג'ל, וטיהור על ידי electroelution כדי לאפיין עוד קומפלקסים בודדים.

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

פרוטוקול עבור הבהרה של הצמח תילקואיד חלבון הארגון מורכבים ו הלחנה אצל כחול לזיהוי יליד ג'ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ותיאר 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול ממוטבת עבורו תודרנית לבנה, , אבל ניתן להשתמש עבור שאר מיני צמחים עם שינויים מזעריים.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

פרוטוקול זה מתאר את השילוב של כרומטוגרפיה של החרגת מהגודל עם פיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל) לאפיון מוחלט של חלבונים ומכלולי מערכות בתמיסה. SEC-דוליטל קובע את המשקל המולקולרי והגודל של חלבונים טהורים, מקומיים מקוריים, הטרוקומנים וחלבונים משתנים כגון גליקורופטינס.

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

למדו איך לאפיין קומפלקסים חלבוניים אוליגומריים בתאי A549 באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד ללא denaturing. שיטה זו מאפשרת ניתוח ישיר מליזטים תאיים ללא צורך בניקוי חלבונים.

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה

גלה סרטונים נוספים