אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לקבוע את מספר התתי-יחידות בקומפלקסים חלבוניים הומו-אוליגומריים בליזאטים של תאים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד-סודיום דודציל סולפט שאינה דנטורטיבית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון המצב האוליגומרי של חלבונים המעורבים בתהליכים תאיים בסיסיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאינה דורשת טיהור של הקומפלקסים החלבוניים ההומו-אוליגומריים או ציוד ייעודי ויקר.

לפיכך, ניתן לבצעו ברוב המעבדות. ניסוי זה משתמש בשני סוגי תאים: תאי A549 המבטאים חלבון Myxovirus resistance A אנדוגני, או MxA; ותאי virocells המבטאים ביטוי יתר של MxA.

זריעה של תאי A549 ותאי virocells בצלחות של שש בארות עם שני milliliters של מצע גידול לכל בארה. הדגירה של התאים תתבצע למשך לילה באינקובטור לתרביות תאים. למחרת, יש לקצור את התאים.

שטפו כל באער במיליליטר אחד של PBS ושחררו את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של תמיסת 0.25%Trypsin-EDTA למשך כחמש דקות בטמפרטורת החדר. מיד עם ניתוק התאים מהצלחת, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מצע גידול, וערבבו בזהירות על ידי פיפטור למעלה ולמטה. העבירו את התאים מכל באער לפרועת של שני מיליליטר, והשקיעו אותם באמצעות צנטריפוגת שולחנית.

הסיר בזהירות את הנוזל העליון באמצעות פיפטינג, מבלי להפריע למשקע התאים. שטוף את התאים על ידי הוספה של 1 ml של PBS קר בטמפרטורת קרח וביצוע פיפטינג זהיר של תגלי התאים למעלה ולמטה. השק תאי התאים בצנטריפוגה שולחנית.

הסיר בזהירות את העילוי באמצעות פיפטור מבלי לנתק את משקע התאים. הוסף 200 µL של תמיסת ליזיס קרה מאוד, השהה את התאים על ידי פיפטור למעלה ולמטה, ולאחר מכן הנח על קרח. הגן מיד על הליזט מפני אור על ידי כיסוי המבחנות בנייר אלומיניום, מכיוון שה-iodoacetamide בתמיסת הליזיס רגיש לאור.

דגרו בקרח למשך 30 דקות. השימוש ב-iodoacetamide הוא קריטי מכיוון ש-iodoacetamide מגן באופן בלתי הפיך על קבוצת התיול של ציסטאינים חופשיים על ידי יצירת קשר תיואתר ומונע אגרגציה מלאכותית של חלבונים. לאחר מכן, הסירו את שיירי התאים על ידי סנטריפוגציה בסנטריפוגה שולחנית שקולתהה.

במהלך הסנטריפוגציה, הכין עמודי דיאליזה עם סף משקל מולקולרי (MWCO) של 10,000. חבר את עמודי הדיאליזה למצוף והנח אותם בתוך כלי זכוכית (beaker) מלא בבופר דיאליזה שקולל מראש כדי להשוות את העמודים. אין לגעת בממברנה.

הנח בוחש מגנטי בכלי כימי והעבר את הכלי לחדר הקירור. בעזרת הבוחש המגנטי להבטחת ערבוב עדין, בצע השוואת טמפרטורה למשך 20 דקות ב-4 °C. לאחר 20 דקות, הוצא את העמודות מתוך בופר הדיאליזה וממצוף הציפה.

העבירו את הליזאטים המזוקקים לעמודי הדיאליזה שהוכנו באמצעות פיפטינג, תוך הקפדה לא לגעת בממברנה. חברו את העמודים למצוף. החזירו אותם לכלי הביקר המלא בבופר דיאליזה, ולאחר מכן העבירו את כלי הביקר לחדר הקירור.

בצעו דיאליזה לליזאט למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורה של 4 °C, תוך ערבוב זהיר באמצעות מערבל מגנטי, כדי להסיר מטבוליטים קטנים ומלחים שעלולים להפריע לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד לא דנטורטיבי. עם סיום הדיאליזה, העבירו כל דגימה שעברה דיאליזה למבחנה של 1.5 ml. הסירו משקעים באמצעות סרקיזציה בצנטריפוגת שולחן.

יש לבצע את האלקטרופורזה מיד לאחר דיאליזה של הליזאטים כדי למנוע את הדיסוציאציה של קומפלקסי החלבון האוליגומריים. מלאו את תא הג'ל הפנימי והחיצוניני במסיינר (running buffer) שקולל מראש. בצעו הרצה מקדימה של ג'ל הפוליאקרילמיד הלא-דנטורטיבי עם מסיינר שקולל מראש בזרם של 25 milliamps לכל ג'ל למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

ערבבו 15 µL מהליזט שהוכן עם חמישה µL של 4X sample buffer. טענו לג'ל סטנדרט חלבוני נטיבי (native protein standard) לפי הבחירה ו-15 µL מהדגימה. הרכיצו את הג'ל בזרם של 25 mA למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 4 °C.

עם סיום האלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד לא דנטורטורי, פרקו את הג'ל והעבירו אותו בזהירות לתוך בופר SDS. דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוךما ניעור עדין. הכינו שני ספוגים, ארבעה דפי נייר סינון מסלולוז וממברנת בלוטינג עבור כל ג'ל, והשרו אותם בבופר בלוטינג.

הרכיבו את ה"סנדוויץ'" באופן הבא, מלמטה למעלה: ספוג אחד, שני דפי נייר סינון מסלולוז, ממברנת בלוטינג, הג'ל, שני דפי נייר סינון מסלולוז וספוג אחד. הכניסו את ה"סנדוויץ'" למכל הבלוטינג, תוך כדי וידוא שהממברנה פונה לקוטב החיובי והג'ל פונה לקוטב השלילי.

מלאו את מיכל הבלוטינג (blotting tank) בתמיסת בלוטינג מקוררת מראש. לקבלת תוצאות העברה מיטביות של חלבונים, בצעו בלוטינג בזרם של 90 milliamps למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, פרקו את ה"סנדוויץ׳".

דגרו את הממברנה בתמיסת Ponceau S למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להנמיך את סולם החלבונים הסטנדרטי. הסירו את הצבע מהממברנה על ידי הנחתה במים דה-יוניים ושטיפתה. לאחר העברת הממברנה לתבנית, סמנו את רצועות החלבון הסטנדרטי באמצעות עט.

חסמו את הממברנה באמצעות תמיסת חסימה למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החלבונים הנחקרים הודגמו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית בעזרת נוגדן פוליקלונלי של ארנב המכוון נגד MxA, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. תאי Virocells חסרי MxA אנדוגני הטרנספקטו עם MxA רקומביננטי מסוג wild type ועם וריאנטים מונומריים ודימריים של MxA.

נדידת הווריאנטים של MxA הרקומביננטי במשקל המולקולרי הצפוי שלהם אישרה את מצבם האוליגומרי. MxA מסוג בר (wild type) שהובע אקטופית נדד כטטראמר. חלבונים רקומביננטיים אלו שימשו לאחר מכן להערכת המצב האוליגומרי של חלבון MxA אנושי אנדוגני שהופק מתאי A549 שעברו גרייה באמצעות interferon-alpha.

התוצאה גילתה כי הגודל של MxA בליזטים של תאי A549 שעברו גרייה באינטרפרון-אלפא תואם לטטראמר. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ביום וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לא להקפיא ולהפשיר את הדגימות במהלך התהליך כולו, שכן הדבר עלול להרוס אינטראקציות בין חלבונים או לגרום לאגרגציה של חלבונים.

בנוסף, בעבודה עם ריאגנטים הרגישים לאור, כגון iodoacetamide, חשוב להגן על הדגימות מפני אור במהלך שלב הליזיס. לאחר ביצוע SDS-PAGE לא דנטורטיבי, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון מיצוי חלבונים מג'ל, בדיקת פעילות אנזימטית של AsiS או PAGE דו-ממדי, וזאת כדי לענות על שאלות נוספות כגון פעילות אנזימטית ואפיון של קומפלקסים הטרו-אוליגומריים פוטנציאליים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את הרכבם של קומפלקסים חלבוניים אוליגומריים בתאים בתרבית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הכנת ליזאטים של תאים מתרביות תאים לצורך חקר חלבונים אוליגומריים בניתוח PAGE לא דנטורטיבי. זכרו כי עבודה עם iodoacetamide עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות והגנה על העיניים.