אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את מספר יחידות המשנה בקומפלקסים של חלבונים הומו-אוליגומריים בליזטים של תאים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודקוסולפט-פוליאקרילאמיד ללא דנטורציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון המצב האוליגומרי של חלבונים המעורבים בתהליכים תאיים בסיסיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת טיהור של מתחמי החלבון ההומו-ליגומרי או ציוד מיוחד ויקר.

לכן, ניתן לבצע אותו ברוב המעבדות. ניסוי זה משתמש בשני סוגים של תאים. תאי A549 המבטאים עמידות אנדוגנית ל-Myxovirus חלבון A, או MxA; ווירוסים המבטאים יתר על המידה MxA.

זרע את תאי A549 ותאי הווירוס לשש צלחות באר עם שני מיליליטר של מצע גידול לבאר. דגרו את התאים למשך הלילה בחממת תרבית תאים. למחרת, קצרו את התאים.

שוטפים כל באר עם מיליליטר אחד של PBS ומחברים את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA למשך כחמש דקות בטמפרטורת החדר. ברגע שהתאים מתנתקים מהצלחת, מוסיפים 0.5 מיליליטר מדיום גידול, ומערבבים בזהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. העבירו את התאים של כל באר לצינור של שני מיליליטר, וגלו אותם באמצעות צנטריפוגה על השולחן.

הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי פיפטינג מבלי להפריע לכדורית התא. שטפו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS קר כקרח וצנרת בזהירות של מתלה התאים למעלה ולמטה. גלולה את התאים בצנטריפוגה על השולחן.

הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי פיפטינג מבלי לנתק את כדורית התא. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר ליזיס קר כקרח, השהה מחדש את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ולאחר מכן הניח על קרח. הגן מיד על הליזאט מפני אור על ידי כיסוי הצינורות בנייר כסף מכיוון שהיודואצטמיד במאגר הליזיס רגיש לאור.

דגירה על קרח למשך 30 דקות. השימוש ביודואצטמיד הוא חיוני מכיוון שיודואצטמיד מגן באופן בלתי הפיך על קבוצת התיול של ציסטאין חופשי על ידי יצירת קשר תיואתר ומונע צבירת חלבונים מלאכותית. לאחר מכן, הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה שולחנית מקוררת מראש.

במהלך הצנטריפוגה, הכינו עמודות דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי של 10, 000. חבר את עמודי הדיאליזה למצוף צף והנח אותם בכוס מלאה במאגר דיאליזה מקורר מראש כדי לאזן את העמודים. אל תיגע בקרום.

מניחים מערבל מגנטי בכוס ומעבירים את הכוס לחדר הקירור. בעזרת המערבל המגנטי כדי להבטיח ערבוב עדין, יש לאזן למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות, הסר את העמודים ממאגר הדיאליזה וממצוף הציפה.

העבירו את הליזטים המנוקים לעמודי הדיאליזה המוכנים על ידי פיפטינג מבלי לגעת בקרום. חבר את העמודים למצוף צף. החזירו אותם לכוס המלאה במאגר דיאליזה, ואז העבירו את הכוס לחדר הקירור.

דיאליזה של הליזאט למשך ארבע שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס תוך ערבוב זהיר עם מערבל מגנטי כדי להסיר מטבוליטים קטנים ומלחים שעלולים להפריע לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד שאינו דנטור. בסיום הדיאליזה, העבירו כל דגימה שעברה דיאליזה לצינור של 1.5 מיליליטר. הסר משקעים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה על השולחן.

יש לבצע אלקטרופורזה מיד לאחר דיאליזה של הליזאטים כדי למנוע דיסוציאציה של קומפלקסי החלבון האוליגומרי. מלאו את תא הג'ל הפנימי והחיצוני במאגר ריצה מקורר מראש. הפעל מראש את ג'ל הפוליאקרילאמיד שאינו מפרק דנטורציה עם מאגר ריצה מקורר מראש ב-25 מיליאמפר לג'ל למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

מערבבים 15 מיקרוליטר מהליזאט המוכן עם חמישה מיקרוליטר של מאגר דגימה 4X. טען תקן חלבון מקומי לבחירה ו-15 מיקרוליטר דגימה על הג'ל. הפעל את הג'ל ב -25 מיליאמפר למשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלמת האלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד שאינו דנטורציה, פרק את הג'ל והעביר בזהירות למאגר SDS. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. הכינו שני ספוגים, ארבעה גיליונות נייר סינון תאית, וקרום ספיגה לכל ג'ל והשרו אותם במאגר ספיגה.

הרכיבו את הכריך באופן הבא מלמטה למעלה. ספוג אחד, שני גיליונות נייר סינון תאית, קרום סופג, הג'ל, שני גיליונות נייר סינון תאית, וספוג אחד. הכניסו את הכריך למיכל הספיגה, וודאו שהממברנה פונה לקוטב הפלוס, ואילו הג'ל פונה לקוטב המינוס.

מלאו את מיכל הספיגה במאגר ספיגה מקורר מראש. לקבלת התוצאות הטובות ביותר של העברת חלבון, יש לספוג ב-90 מיליאמפר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת מפרקים את הכריך.

דגרו את הממברנה בתמיסת Ponceau S למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לדמיין את תקן החלבון. הימנע מהקרום על ידי הנחתו במים נטולי יונים ושטיפתו. לאחר העברת הממברנה למגש, סמנו את רצועות תקן החלבון בעזרת עט.

חסום את הממברנה עם חיץ חוסם למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החלבונים המעניינים מודגמים על ידי צביעה חיסונית באמצעות נוגדן רב-שבטי של ארנב המכוון כנגד MxA כמתואר בפרוטוקול הטקסט. וירוצ'לים חסרי MxA אנדוגני הועברו עם סוג בר רקומביננטי MxA ושונות MxA מונומרית ודימרית.

הנדידה של שונות ה-MxA הרקומביננטית במשקל המולקולרי הצפוי שלהם אישרה את מצבם האוליגומרי. סוג הבר MxA המתבטא באופן אקטופי נדד כטטרמר. חלבונים רקומביננטיים אלה שימשו לאחר מכן להערכת המצב האוליגומרי של חלבון MxA אנושי אנדוגני שמקורו בתאי A549 מגורים אינטרפרון-אלפא.

התוצאה גילתה שגודל ה-MxA בליזאטים של תאי A549 מגורים אינטרפרון-אלפא תואם לטטרמר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא להקפיא ולהפשיר את הדגימות במהלך כל ההליך, מכיוון שהדבר עלול להרוס אינטראקציות חלבון או לגרום לצבירת חלבונים.

בנוסף, כאשר עובדים עם ריאגנטים רגישים לאור, כמו יודואצטמיד, חשוב להגן על הדגימות מפני אור במהלך שלב הליזיס. בעקבות ה-SDS-PAGE שאינו דנטורציה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיצוי ג'ל חלבון ופעילות אנזימטית AsiS או PAGE ממד שני על מנת לענות על שאלות נוספות כמו פעילות אנזימטית ואפיון קומפלקסים הטרו-אוליגומריים פוטנציאליים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את ההרכב של קומפלקסים של חלבונים אוליגומריים בתאים מתורבתים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ליזטים של תאים מתרביות תאים כדי לחקור חלבונים אוליגומריים בניתוח PAGE שאינו דנטורציה. אל תשכח שעבודה עם יודואצטמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת כפפות והגנה על העיניים.