הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

המטרה הכוללת של פרוטוקול כימות חומצות גרעין מרובה-נבדקים (multiplex) זה היא כימות דיגיטלי של ביטוי microRNA בדם מלא. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר של הפרעות עיכול. היא מסייעת בזיהוי מנגנונים מולקולריים לא תקינים וחתימות של סממנים ביולוגיים, כגון microRNAs.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שכימות ה-microRNA אינה נשענת על הגברה. טכנולוגיה זו סופרת באופן דיגיטלי מטרות מולקולריות והיא אוטומטית במידה רבה. כדי לטהר RNA כולל, הפשיתו והדגירו דגימות דם מלא שנאספו והוקפאו בעבר למשך שעתיים.

השתמשו ברוטור עם דליים נדנדים (swinging bucket rotor) כדי לצנטריפוג את המבחנות ב-5,000 $\times$g בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות. לאחר מכן, הסירו את העל-נוזל (supernatant) על ידי מזיגה זהירה או שאיבה באמצעות פיפט למבחנת פסולת, תוך הקפדה לא להפר את המשקע (pellet). הוסיפו ארבעה מיליליטר של מים נקיים מ-RNase למשקע.

סגרו את הפקק היטב, וערבבו במערבל vortex עד להמסה נראית לעין של המשקע. לאחר מכן, סבבו את המבחנה שוב בצנטריפוגה, והסירו את הנוזל העליון (supernatant). בשלב הבא, הוסיפו 350 microliters של BM1 buffer למשקע וערבבו במערבל vortex עד להמסה נראית לעין של המשקע.

לאחר מכן, העבירו את הדגימה לשפופרת עיבוד של 2 mL לצורך הפקה אוטומטית של RNA כולל. באמצעות ערכה מסחרית להפקת RNA, בצעו טיהור אוטומטי של RNA תוך-תאי, כולל microRNA מדגימת הדם השלמה, על ידי טעינת קצות פיפטה טעונים מראש, שפופרות צנטריפוגה, תמיסות חוצצים (buffers) וריאגנטים המסופקים בערכת טיהור ה-RNA אל תוך מערכת ההפקה הרובוטית של ה-RNA. מתפריט בחירת הפרוטוקולים, בחרו בפרוטוקול Blood miRNA PartA והפעילו את הריצה.

השלימו את מיצוי ה-RNA, ואחסנו את הדגימות בהתאם לפרוטוקול הכתוב. הכינו דגימות microRNA על ידי נורמליזציה של 12 דגימות RNA ל-33 nanograms per microliter באמצעות RNase-free water. הכינו מהילול של 1:500 של ביקורות ה-microRNA המצורפות לערכה, באמצעות nuclease-free water, ושמרו על קרח.

בשלב הבא, הכינו את תערובת העבודה (master mix) לאנילינג על ידי ערבוב של 13 µL של בופר אנילינג, 26 µL של ריאגנט micro R-tag ו-6.5 µL של בקרות microRNA. לכל אחד מ-12 מבחנות פס של 0.2 mL, הוסיפו 3.5 µL מתערובת העבודה לאנילינג, ולאחר מכן הוסיפו 3 µL מדגימת ה-RNA. נערה את המבחנות לערבוב, סובבו אותן במיקרוצנטריפוגה שולחנית ב-2000 ×g, והריצו את המבחנות בטרמוסייקלר לפי התוכנית הבאה.

בשלב הבא, הכינו תערובת מאסטר לליגציה על ידי ערבוב של 3 µL מתוך באפר הליגציה ו-19.5 µL של PEG. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 µL מתערובת המאסטר לליגציה לכל אחת מהתגובות. לאחר ערבוב וספינ-דאון של המבחנות, החזירו אותן לתרמוסייקלר בטמפרטורה של 48 °C למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של ליגאז ישירות לכל דגימה בעודן בבלוק של התרמוסייקולר, ודגרו את המבחנות לפי התוכנית הבאה. ערבבו בעדינות וסובבו את המבחנות בצנטריפוגה (spin down), והוסיפו מיקרוליטר אחד של אנזים לניקוי הליגציה לכל דגימה. לאחר מכן, דגרו את המבחנות בתרמוסייקולר כפי שמוצג כאן.

לאחר הדגירה, הוסף 40 microliters של מים נקיים מ-RNase לדגימות לפני הערבוב והסבוב בצנטריפוגה. לביצוע היברידיזציה של microRNA, הפשר על קרח את מערכי גששי הדיווח (reporter) והלכידה (capture) המסופקים, וסבב אותם בצנטריפוגה. הוסף 130 microliters של תמיסת היברידיזציה (hybridization buffer) ל-Reporter Code Set 2, וערבב ליצירת תערובת מאסטר להיברידיזציה.

ל-12 מבחנות פס חדשות בנפח 0.2 מיליליטר, יש להוסיף 20 µL של תערובת מאסטר להיברידיזציה. יש לדנטור את דגימות ה-microRNA שהוכנו זה עתה בטמפרטורה של 85 °C למשך חמש דקות, ולקרר אותן על קרח. לאחר מכן, יש להוסיף 5 µL מדגימות ה-microRNA לכל אחת ממבחנות הפס המכילות את תערובת המאסטר להיברידיזציה.

תכנתו את התרמוסייקלר ל-65 °C, בטמפרטורה המחושבת לנפח של 30 µL, ואת המכסה המחומם להגדרת זמן Forever כדי שלא יירד ל-4 °C בסיום ההרצה. הוסיפו 5 µL של סט גששי הלכידה לכל מבחנה, וערבבו. לאחר מכן, לאחר ספינינג (spinning down), הניחו מיד את המבחנות בתרמוסייקלר ב-65 °C.

דגרו את הדגימות למשך זמן של לא פחות מ-12 שעות ולא יותר מ-30 שעות. הכינו את תחנת ההכנה על ידי חימום של המחסנית והפלטות לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו ספינט-דאון (spin down) לפלטות.

כדי להטעין את תחנת ההכנה, פתח את דלת התחנה והטען את פלטות הריאגנטים, את המחסנית, את קצות הפיפטה, את הדגימות המוכנות בשפורי רצועה של 0.2 milliliter, ושני שפורי רצועה ריקים של 12 שפורים בנפח 0.2 milliliter למיקומים המתאימים ברובוט. הסר את מכסי שפורי הרצועה ואת כיסוי פלטת הריאגנטים. לאחר מכן, סגור את דלת תחנת ההכנה והפעל את הבדיקה המתאימה מלוח הבקרה.

כדי להדמיות ולספירה של ברקודי הקומפלקסים התלת-חלקיים המקובעים והמכווננים, הוצא את המחסנית מתחנת ההכנה, השתמש במכסה המסופק כדי לאטום אותה, והנח אותה בכל חריץ פנוי במנתח הדיגיטלי. השתמש במסך המגע כדי ליצור קובץ הגדרת מחסנית, או CDF. ודא שקובץ ספריית הדוחות המתאים משויך לכל דגימה ב-CDF.

עם השלמת הסריקה, יש להוריד את קבצי הנתונים מהמנתח הדיגיטלי באמצעות כונן USB או באמצעות דואר אלקטרוני, לפני עיבוד וניתוח הנתונים, בהתאם לפרוטוקול ה-QC והניתוח הנלווה. מערכת הבדיקה של פלטפורמת ביטוי הגנים מפחיתה רעש טכני הודות לאופיה האוטומטי מאוד, והכימיה הייחודית שבה היא משתמשת מייצרת נתוני ביטוי גנים ברמת דיוק גבוהה. החזרות הטכניות המוצגות כאן מדגימות את יכולת השחזור הגבוהה שניתן להשיג בכימות ביטוי של microRNA אנדוגני וויראלי כאחד.

באמצעות שיטה זו, ניתן לזהות microRNAs אנושיים אנדוגניים ומקודד-ויראליים המראים סטייה מהביטוי הצפוי, כפי שהוגדר על ידי משתתפי מחקר בריאים, כמטרות בעלות עניין ב-IBS. הדיוק והרגישות של השיטה מאפשרים לזהות שינויים בקרב מטרות בעלות ביטוי נמוך, וניתן להבחין באופן מהימן גם בשינויים עדינים. דמויות אלו מציגות חלק מהשינויים ב-microRNAs במחזור הדם ב-IBS, ובסוגי IBS שונים, בהשוואה לקבוצות ביקורת בריאות.

המיקרו-RNA (microRNAs) בעלי העלייה המבדלת המשמעותית ביותר אצל משתתפים עם IBS מוצגים כאן. העקומות בתרשים כינור זה מציינות את תדירות הספירות עבור miR-150. הפסים האנכיים מייצגים את הרבעונים הראשון והשלישי והריבוע האדום מציין את החציון של הספירות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות מותאמות אישיות וממוקדות יותר המבוססות על אותה טכנולוגיה, וזאת במטרה לתקף חתימות של סממנים ביולוגיים בקוהורטות גדולות יותר ולחקור קשרים חיוניים בין RNA לחלבונים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום המחקר הביו-רפואי לפתח במהירות, ובדיוק רב, פאנלים של סממנים ביולוגיים לאבחון מחלות.