הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

המטרה הכוללת של פרוטוקול כימות חומצות גרעין מרובה זה היא לכמת דיגיטלית את ביטוי המיקרו-RNA בדם מלא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר הפרעות עיכול. זה עוזר בזיהוי מנגנונים מולקולריים לא מווסתים וחתימות סמנים ביולוגיים, כמו מיקרו-רנ"א.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שכימות המיקרו-רנ"א אינו מסתמך על ההגברה. טכנולוגיה זו סופרת באופן דיגיטלי מטרות מולקולריות והיא אוטומטית ברובה. כדי לטהר את ה-RNA הכולל, יש להפשיר ולדגור דגימות דם מלא שנאספו בעבר והוקפאו למשך שעתיים.

השתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי לצנטריפוגה של הצינורות בטמפרטורה של 5, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות. לאחר מכן, הסירו את חומרי העל על ידי שפיכה או פיפטינג בזהירות לתוך צינור פסולת, תוך הקפדה לא להפריע לכדור. הוסף ארבעה מיליליטר מים ללא RNase לגלולה.

החזר היטב את המכסה והמערבולת עד שהכדור נמס באופן גלוי. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב את הצינור, והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 350 מיקרוליטר של מאגר BM1 לגלולה ולמערבולת עד שהגלולה מומסת באופן גלוי.

לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור עיבוד של שני מיליליטר למיצוי RNA כולל אוטומטי. באמצעות ערכת מיצוי RNA זמינה מסחרית, בצע טיהור אוטומטי של RNA תוך-תאי, כולל מיקרו-RNA מדגימת הדם השלמה, על ידי טעינת קצות פיפטות טעונות מראש, צינורות צנטריפוגה, מאגרים וריאגנטים המסופקים בערכת טיהור ה-RNA למערכת מיצוי ה-RNA הרובוטית. מתפריט בחירת הפרוטוקולים, בחר בפרוטוקול Blood miRNA PartA והתחל את הריצה.

השלם את מיצוי ה-RNA ואחסן את הדגימות בהתאם לפרוטוקול הטקסט. הכן דגימות מיקרו-RNA על ידי שימוש תחילה במים נטולי RNase כדי לנרמל 12 דגימות RNA ל-33 ננוגרם למיקרוליטר. עם מים נטולי נוקלאז, הכינו דילול של 1 ל-500 של בקרות המיקרו-רנ"א המסופקות בערכת הבדיקה, והמשיכו על הקרח.

לאחר מכן, הכינו את תערובת מאסטר החישול על ידי שילוב של 13 מיקרוליטר של מאגר חישול, 26 מיקרוליטר של מגיב מיקרו R-tag ו-6.5 מיקרוליטר של בקרות מיקרו-RNA. לכל אחד מ-12 צינורות הרצועה של 0.2 מיליליטר, הוסף 3.5 מיקרוליטר מתערובת מאסטר החישול, ולאחר מכן הוסף 3 מיקרוליטר מדגימת ה-RNA. העבירו את הצינורות לערבוב, סובבו אותם ב-2000 פעמים גרם עם מיני מיקרו-צנטריפוגה על ספסל, והפעילו את הצינורות בתרמו-סייקלר באמצעות התוכנית הבאה.

לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר קשירה על ידי שילוב של שלושה מיקרוליטרים של מאגר הקשירה ו-19.5 מיקרוליטר של PEG. לאחר מכן, הוסף 2.5 מיקרוליטר מתערובת מאסטר הקשירה לכל אחת מהתגובות. לאחר ערבוב וסיבוב הצינורות, החזירו אותם לתרמוסייקלר בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של ליגאז ישירות לכל דגימה בעודו בבלוק התרמרוציקלר, ודגר את הצינורות באמצעות התוכנית הבאה. ערבבו וסובבו בעדינות את הצינורות, והוסיפו מיקרוליטר אחד של אנזים לניקוי קשירה לכל דגימה. לאחר מכן, דגרו את הצינורות בתרמו-סייקלר כפי שמוצג כאן.

לאחר הדגירה, הוסיפו 40 מיקרוליטר מים נטולי RNase לדגימות לפני ערבובם וסיבובם. כדי לבצע הכלאה של מיקרו-רנ"א, הפשירו את ערכות הבדיקה של הכתב ולכידת המסופקות על קרח, וסובבו אותן כלפי מטה. הוסף 130 מיקרוליטר של מאגר הכלאה לערכת קוד המדווח 2, וערבב כדי ליצור את תמהיל האב של ההכלאה.

ב-12 צינורות רצועה חדשים של 0.2 מיליליטר, הוסף 20 מיקרוליטר מתערובת מאסטר ההכלאה. דנטורציה של דגימות המיקרו-רנ"א שהוכנו זה עתה ב-85 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, וקררו אותן על קרח. לאחר מכן, הוסף 5 מיקרוליטר של דגימות המיקרו-RNA לכל אחד מצינורות הרצועה המכילים את תערובת מאסטר ההכלאה.

תכנת את התרמו-סייקלר ל-65 מעלות צלזיוס, בטמפרטורה מחושבת בנפח של 30 מיקרוליטר, ואת המכסה המחומם בהגדרת הזמן Forever כך שהוא לא ירד ל-4 מעלות צלזיוס בסוף הריצה. הוסף 5 מיקרוליטר של ערכת בדיקת הלכידה לכל צינור, וערבב. לאחר מכן, לאחר סיבובם כלפי מטה, הנח מיד את הצינורות בתרמוסייקלר בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.

דגרו את הדגימות לא פחות מ -12 שעות, ולא יותר מ -30 שעות. הגדר את תחנת ההכנה על ידי חימום תחילה של המחסנית והצלחות לטמפרטורת החדר. ואז סובב את הצלחות.

כדי לטעון את תחנת ההכנה, פתח את דלת התחנה וטען את לוחות הריאגנטים, המחסנית, קצות הפיפטה, דגימות מוכנות בצינורות רצועה של 0.2 מיליליטר ושני צינורות רצועה ריקים של 0.2 מיליליטר 12 צינורות למיקומים המתאימים ברובוט. הסר את מכסי צינור הרצועה ואת מכסה לוחית הריאגנט. לאחר מכן, סגור את דלת תחנת ההכנה והפעל את הבדיקה המתאימה מלוח הבקרה.

כדי לדמיין ולספור את הברקודים של המתחמים המשותקים והמכוונים, הסר את המחסנית מתחנת ההכנה, השתמש בכיסוי המצורף כדי לאטום אותה והנח אותה במנתח הדיגיטלי בכל חריץ זמין. השתמש במסך המגע כדי ליצור קובץ הגדרת מחסנית, או CDF. ודא שקובץ ספריית המדווחים המתאים מוקצה לכל דוגמה ב- CDF.

לאחר השלמת הסריקה, הורד את קבצי הנתונים מהמנתח הדיגיטלי באמצעות כונן USB או באמצעות דואר אלקטרוני, לפני עיבוד וניתוח הנתונים, על פי פרוטוקול ה-QC והניתוח המשויך. מערכת הבדיקה של פלטפורמת ביטוי הגנים מפחיתה רעש טכני באמצעות האופי האוטומטי שלה, והכימיה הייחודית שבה היא משתמשת מייצרת נתוני ביטוי גנים ברמת דיוק גבוהה. השכפולים הטכניים המוצגים כאן מדגימים את יכולת השחזור הגבוהה בכימות ביטוי מיקרו-RNA אנדוגני וויראלי כאחד.

באמצעות שיטה זו, ניתן לזהות מיקרו-רנ"א אנושי מקודד ויראלי ואנדוגני המראים סטייה מהביטוי הצפוי, כפי שהוגדר על ידי משתתפי מחקר בריאים, כמטרות מעניינות בתסמונת המעי הרגיז. הדיוק והרגישות של השיטה מאפשרים לזהות הפרעות בין מטרות בעלות ביטוי נמוך, וניתן גם לצפות בהפרעות עדינות באופן מהימן. נתונים אלה מראים חלק מההפרעות במיקרו-רנ"א במחזור בתת-סוגים של IBS, ותת-סוגים של IBS, בהשוואה לבקרות בריאות.

שני המיקרו-רנ"א המשמעותיים ביותר בעלייה דיפרנציאלית במשתתפי IBS מוצגים כאן. העקומות בתרשים כינור זה מצביעות על תדירות הספירות עבור miR-150. הפסים האנכיים מייצגים את הרבעון הראשון והשלישי והריבוע האדום מציין את הספירה החציונית.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות מותאמות אישית ממוקדות יותר המבוססות על אותה טכנולוגיה על מנת לאמת חתימות סמנים ביולוגיים בקבוצות גדולות יותר ולחקור את האסוציאציות החיוניות של RNA וחלבון. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחקר הביו-רפואי לפתח במהירות, בדיוק ובדייקנות, לוחות סמנים ביולוגיים אבחנתיים למחלות.