מניפולציה Neuropharmacological של מאופקים חינם-עף דבש דבורים, Apis mellifera

כתב יד זה מתאר כמה פרוטוקולים לניהול סוכנים תרופתיים כדי דבורי דבש, כולל בשיטות לא פולשניות פשוט לדבורים חינם-עף, כמו גם הגירסות פולשני יותר המאפשרות טיפול מקומי מדויק של דבורים מאופקות.

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לתת חומרים פרמקולוגיים אמינים וחזקים למערכת העצבים המרכזית של דבורי דבש או חרקים דומים. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי סוציוביולוגיה, נוירואתולוגיה וכוורת כגון חקר הנוירו-מנגנונים של התנהגות חברתית. היתרון העיקרי של הטכניקות האלה הוא שהן מאפשרות לחקור נוירוביולוגיה באורגניזמים שאינם מודלים, כמו למשל דבורת הדבש, שם הכלים הגנטיים מוגבלים כיום.

מי שתבטל את ההליך תהיה ג'ני פלאת', סטודנטית לתואר שני מהמעבדה לנוירואתולוגיה באוניברסיטת מקווארי. ניתן לתת תרופות דרך הפה או בזריקה. ניתן לבצע זריקות לבית החזה, לתוך האוצלוס, או למערכת העין.

זריקות Ocellus מספקות תרופות לכל הראש וזריקות בדרכי העיניים מכוונות לאזורים ספציפיים במוח. עבור כל הזריקות, הכינו מיקרואזמל על ידי ניתוק הפינה של סכין גילוח פיפיות עם מחזיק להב. חבר את שבר הלהב למחזיק להב כך שהוא יוצר להב נחמד עם נקודת קצה חדה.

להזרקה לבית החזה יש לנתח חור של שני מילימטר ממש מעל הסקוטלום, ליד תהליך הכנף האחורית של בית החזה של הדבורה. הימנע מחיתוך עמוק מדי, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בשרירי הטיסה, והיזהר להימנע מצירי הכנפיים. באופן אידיאלי, חתכו רק שלושה צדדים כך שניתן יהיה לקפל את דש הציפורן לאחור כדי לסגור את מקום הפציעה.

כעת הזרקו את התרופה לבית החזה. לאחר מכן העבירו את דש הציפורן בחזרה לתוך החור ולאחר עשר שעות הוא יתחבר מחדש ויאטום. כדי לגשת למוח, נעלו את ראש הדבורה הרתומה במקומו על ידי מילוי סדק הצוואר בשעווה דנטלית שחוממה ביד על מנת למנוע נזק לקולטני הריח של האנטנות או לתאים אחרים שעשויים להיות חשובים להתנהגות הדבורה.

האנטנה עשויה להיות נעולה גם בשעווה דנטלית. לאחר מכן, בעזרת המיקרואזמל, הסר בזהירות את העדשה של האוצלוס החציוני על ידי החדרת קצה המיקרואזמל מתחת לעדשה ושבירת העדשה בעדינות מקפסולת הראש. כדי שהתרופה תילקח לתוך כל קפסולת הראש, יש לזרוק בזהירות את התרופה על חור האוצלוס, ולהמתין עד שהיא תיספג פנימה.

לחלופין, ניתן למקד תת-אזורים במוח על ידי הזרקה דרך מערכת העיניים, למשל, על ידי הזרקת 250 ננוליטר של תרופה בעומק של 50 מיקרון כדי למקד את מבני המוח הסמוכים לאוצלוס. לאחר מכן הסר את השעווה הדנטלית ואפשר לדבורה לנוח זמן מה לפני שתמשיך בהליך הניסוי. להכנת מחטי הזרקה משוך צינורות זכוכית מילימטר אחד כדי לייצר קצה באורך של כ-0.5 סנטימטר.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו שוברים את הקצוות כדי ליצור פתח בקוטר חיצוני של כ-10 עד 15 מיקרון. ניתן למדוד זאת באמצעות סולם על גרטיקולה. כעת טען מחט הזרקה עם תמיסת התרופה.

לאחר מכן, במערכת ההזרקה, חבר את מחט ההזרקה הטעונה למיקרומניפולטור. בדוק את מערכת ההזרקה בשמן מינרלי וכייל אותה כדי לספק בולוס של 0.5 עד שני ננו-ליטר בהתאם לגודל מבנה המוח הממוקד. בעזרת גרטיקולה, מודדים את קוטר הטיפות כדי לחשב את נפחן.

כדי לתקן את ראש הדבורה הרתומה השתמש בשעווה דנטלית רכה, כמו קודם. לאחר מכן חותכים פתח לחלק הקדמי של קפסולת הראש באמצעות מיקרואזמל עם שלושה חתכים: אחד ממש מתחת לאוצלוס החציוני; אחד בגבול העין הימנית או השמאלית; ואחד מעל גבעולי האנטנה. השתמש בחתיכת שעווה דנטלית כדי להחזיק את הדש הפתוח במקומו.

לאחר מכן, דחף בזהירות את הבלוטות וקנה הנשימה באמצעות מלקחיים עדינים ועשה קרע קטן בעצב מעל מבנה המוח הממוקד. כעת הכניסו את קצה פיפטת הזכוכית לאזור המוח הרצוי, באופן אידיאלי, בניצב לפני השטח של המוח לעומק הנדרש כדי להגיע למבנה המטרה. לאחר מכן הזריק את בולוס התרופה.

כאשר מכוונים לאזורי מוח מזווגים, בצע זריקה אחת לכל המיספרה כדי להשפיע על שתי ההמיספרות. אם מוזרק צבע פלואורסצנטי עם הבולוס, ניתן לראות את אזורי המוח השטחיים באמצעות אור פלואורסצנטי. ניתן לבדוק אזורים אחרים מאוחר יותר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לאחר ההזרקה יש להחליף את דש הציפורן ולאטום את החתך על ידי המסת גביש של איקוסאן בקוטר של כמילימטר אחד מעל הציפורן באמצעות חוט דק המחובר למגהץ מיקרו-הלחמה. זה יפחית מאוד את התמותה. כדי לתת תרופה נדיפה כמו מחוט ניכרום מחומם, הכינו אותה מומסת באתנול טהור.

כדי לקדוח בזהירות חורים במכסה של צינור 50 מילימטר, הזינו את שני החוטים דרך החורים. כדי ליצור נימה, סובב חוט ניכרום בחוזקה סביב מסמר, חבר את חוט הניכרום לשני חוטי חשמל ואז הסר את הציפורן. לאחר מכן, אבטח את החוטים ואטום את החורים בסיליקון.

כעת חבר את החוטים למקור חשמל. והשתמש בצמד תרמי כדי למדוד את טמפרטורת הנימה. כדי לכייל את המכשיר, פיפטה בזהירות שני מיקרוליטרים של תמיסת תרופה על החוט ותנו לאתנול להתאדות לחלוטין בטמפרטורת החדר.

שנה את המתח בזרם כך שהבולוס של התרופה יתנדף תוך עשר שניות מהפעלת הכוח. אין להרוס את התרופה על ידי פירוק תרמי. בדרך כלל ניתן לראות משקעים על החוט היבש אם נבדק בקפידה.

כדי להעביר את התרופות לדבורה, העמיסו דבורה מעופפת או רתומה לתוך הצינור והצמידו בזהירות את המכסה כשהחוטים החוצה. לאחר מכן הפעל את מקור החשמל למשך 10 שניות והמתן 50 שניות נוספות עד שהתרכובת הנדיפה תיקלט במלואה על ידי הדבורה לפני הסרת הדבורה. ניתן להשיג בקלות השפעות ספציפיות על תהליכים מוחיים לאחר הזרקת בית החזה.

לדוגמה, חוסמי שעתוק ניתנו בטכניקה זו כדי לזהות שלבים של זיכרון הדורשים ביטוי גנים. הושגו השפעות סלקטיביות ותלויות זמן על משימות זיכרון. דיפוזיה של מולקולות לתוך המולימפה הראש מובילה להשפעות מהירות ותלויות מינון המושגות על ידי הזרקת אוצלוס.

בריכוזי מינון מסוימים, אלטוסטטינים מרוכזים באופן מפוזר הפחיתו את הביצועים במבחן למידת חוש הריח. כדי לבחון את התכונות המרחביות והטמפורליות של אזורים ספציפיים במוח, דבורים רתומות אומנו בפרדיגמת התניה של PER חוש הריח ולאחר מכן הוזרקו פרוקן בגוף הפטרייה, או באונות אנכיות. כאשר הדבורים נבדקו לאחר מכן לזיכרון, הביצועים נפגעו רק בדבורים שהוזרקו דו צדדית.

בזירה עם מספר מאכילים, דבורים נלכדו בעדינות כשהן עמדו לרדת ממזין עם סוכרוז טוחנת אחת. הדבורים שנלכדו טופלו ב-100 מיקרוגרם של קוקאין חופשי נדיף, מה שהביא לעלייה בחיפוש מזון במזינים חצי טוחנות, אך לא בשני מאכילים טוחנות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתת תרופות לדבורים מעופפות חופשיות או מרוסנות על ידי הזרקה או נידוף.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקות אלה בקלות על מספר רב של דבורים תוך מספר שעות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו התניה של הארכת פרובוסקיס, כך שנוכל לענות על שאלות נוספות על הנוירוביולוגיה של למידה וזיכרון.