מודל Murine של הקבוצה B סטרפטוקוקוס נרתיקי Colonization

המטרה הכוללת של מודל בעלי חיים זה היא לבסס סטרפטוקוקוס מקבוצה B, או קולוניזציה של GBS בדרכי הנרתיק של העכברים. שיטה זו יכולה לעזור לנו להבין שאלות מפתח על קולוניזציה של סטרפטוקוק מקבוצה B, כגון, מהם הגורמים החיידקיים החשובים להתיישבות, כמו גם כיצד תגובות המארח משפיעות על התמדה בנרתיק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהחיסון, בדרך כלל, מביא ליותר מ-90 אחוז קולוניזציה ללא שימוש בהרדמה, מדכאי חיסון או חומרי עיבוי.

התחל במערבולת של 0.5 מיליגרם של בטא-אסטרדיול, לכל עכבר, בצינור חרוטי של 15 מיליליטר עד להסרת כל הגושים והבטא-אסטרדיול מופיע כאבקה דקה. לאחר מכן, מזרק מסנן 100 מיקרוליטר שמן שומשום, לכל עכבר, לתוך הצינור דרך מסננת של 0.45 מיקרון, ומערבל שוב את הצינור. כאשר ההורמון מופץ כתרחיף הומוגני בכל השמן, משוך את המגיב למזרק חדש של 10 מיליליטר וחבר מחט בגודל 18 אינץ' אחד.

הכניסו 100 מיקרוליטר מהתרחיף למזרק טוברקולין אחד, מיליליטר אחד, לכל עכבר, וציידו כל מזרק טוברקולין במחט סטרילית, בגודל 26, חצי אינץ'. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של בטא-אסטרדיול לרבע השמאלי או הימני התחתון של חלל הצפק של כל בעל חיים. באותו יום של ההזרקה, גדלו תרבית נוזלית של חמישה מיליליטר למשך הלילה של זן GBS המעניין במרק טוד יואיט, או THB, ב-37 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, תת-תרבית של ה-GBS בנפח של 1 עד 10 ב-THB טרי למשך שעתיים עד שלוש דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, עד שהחיידקים מגיעים לשלב אמצע העץ. לאחר מכן, העבירו את תת-התרבות לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה את תאי החיידקים. השעו מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של PBS סטרילי.

לאחר מכן, הביאו את הנפח הכולל של המתלה עד מיליליטר אחד של PBS לכל 10 עכברים, כדי להגיע ל-OD600 של 0.4 בצינור תרבית חדש של חמישה מיליליטר. העבירו את התרבית לצינור חדש של 15 מיליליטר, וגלו מחדש את החיידקים. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-PBS בעשירית מאמצעי האחסון המקורי.

שמור 50 מיקרוליטר של החיידקים לדילול סדרתי וציפוי על אגר THB, כדי לקבוע את ה-CFU המדויק של החיסון. לאחר מכן, צייר 10 מיקרוליטר של GBS לתוך קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עם ג'ל, ואבטח ידנית את העור הרפוי בצוואר, של החיה הראשונה, בין האגודל לאצבע המורה, ולאחר מכן קיבוע הזנב. הכנס את קצה הפיפטה 5 עד 10 מילימטרים לתוך לומן הנרתיק, והוציאו את כל נפח החיסון.

לאחר מכן, שחררו מיד את הקשקוש והרימו את הזנב כדי להרים את הקצה האחורי של החיה, תוך כדי הליכה עם הכפות הקדמיות על משטח קשה. לאחר דקה, בדוק ויזואלית את פתח הנרתיק לאיתור זרימה חוזרת של החיסון. רגע לפני הדגימה, הרטיבו מראש את הכותנה ב-PBS, ורסנו את אחד העכברים כפי שהודגם זה עתה.

יש להכניס את המקלון 10 מילימטרים לתוך לומן הנרתיק, ולסובב בעדינות ארבע פעמים בכיוון השעון, וארבע פעמים נגד כיוון השעון, תוך הפעלת לחץ קל על דופן הנרתיק. הכניסו את הספוגית לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר PBS, וסובבו את הצינור והספוגית למשך כ-15 שניות כדי לשחרר את החיידקים מסיבי הכותנה. לאחר מכן, יש לדלל באופן סדרתי כל דגימה ב-PBS, ולצלחת 20 מיקרוליטר של אחד עד 10 עד 10,000 דילולים על צלחת אגר בינונית דיפרנציאלית, שהוכנה לפי הוראות היצרן, לדגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

מושבות GBS יופיעו בצבע ורוד בוהק או סגול. כדי לאסוף את שטיפת הנרתיק, השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עם טענת ג'ל כדי להוציא 20 מיקרוליטר PBS לתוך לומן הנרתיק. פיפטה בעדינות את כל הנפח למעלה ולמטה ארבע פעמים בתוך הלומן.

לאחר מכן, בעזרת אותו קצה, משוך את כל הנפח. לניתוח נוזל שטיפה במורד הזרם, הוצא את השטיפה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.7 מיליליטר. להומוגניזציה של דיסקציה של רקמות, יש לרסס במורד הבטן הגחונית של בעל חיים שעבר המתת חסד עם 70 אחוז אתנול, ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לפתוח את חלל הבטן.

עקור את המעיים כך שמערכת הרבייה תיחשף. לאחר מכן, חתכו את שתי קרני הרחם, באורך בינוני, בין גוף הרחם לשחלות. בעזרת מספריים ומלקחיים, הפרד את השומן הבטני, הממברנות ושלפוחית השתן ממערכת הרבייה, והזיז את הרקמות בזנב.

לאחר מכן, חתכו לרוחב את הנרתיק קרוב ככל האפשר לפות, כדי להפריד את מערכת הרבייה מהגוף. העבירו את מערכת הרבייה בטאקט לצלחת פטרי סטרילית, והשתמשו בסכין גילוח חדש כדי להפריד את הרחם מצוואר הרחם בחתך רוחבי יחיד. הפרד את צוואר הרחם מהנרתיק עם חתך רוחבי נוסף.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר כל אחת מהרקמות לשתי שפופרות בודדות, שקולות מראש, המכילות 500 מיקרוליטר PBS וחרוזים הומוגניים. שקלו כל צינור של 2 מיליליטר כדי לקבוע את משקלי הרקמות. לאחר מכן, אטמו היטב את צינורות מכסה הבורג והומוגניזציה של הרקמות, למשך דקה אחת, במהירות המרבית, בהומוגנייזר רקמות.

כדי לכמת את העומס החיידקי, יש לדלל באופן סדרתי 25 מיקרוליטר של רקמה הומוגנית ולצלחת 1 עד 10 עד 10,000 דילולים על לוחות אגר בינוניים דיפרנציאליים, למשך דגירה של 24 שעות, ב-37 מעלות צלזיוס. כדי לאחסן דגימות לכימות ציטוקין, הקפיאו את ההומוגנטים במינוס 20 מעלות צלזיוס. בתמונות אלה מודגמים ארבעת השלבים של מחזור הייחום של העכבר, כפי שנקבעו על ידי נוזל שטיפת הנרתיק הרטוב.

עכברים שחוסנו בשלב הפרואסטרוס היו מושבים ב-GBS זמן רב יותר מכל שלב אחר של ייחום, במיוחד אלה שחוסנו בדיסטרוס בזמן החיסון. ייחום מתמשך מקדם התמדה של GBS A909 בעכברי CD-1 עם קולוניזציה של 90 אחוז שנצפתה שבועיים לאחר החיסון. בניסוי טיפוסי עם מנה אחת של בטא-אסטרדיול לפני החיסון, רק 40 עד 50 אחוז מהעכברים התיישבו שבוע לאחר החיסון, עם GBS ממוצע ששוחזר המחקה את אחוז הקולוניזציה.

הוכחה כי שמירה על ייחום מתמשך מקדמת התמדה נרתיקית של GBS ברוב עכברי CD-1. GBS A909 נמשך במערכת הנרתיק בעכברי CD-1 ובעכברי FVB מולדים למשך כשבוע. בעוד שרוב העכברים המולדים BALB/c ו-C57BL/6 מתיישבים בשבוע אחד למשך חודש או יותר.

הדמיה של GBS חיובי ל-GFP בבעלי חיים מחוסנים מדגימה נוכחות של GBS המודבק לאפיתל הנרתיק של העכברים ובסמיכות לפלורה נרתיקית מקומית אחרת. חשוב למנוע זרימה חוזרת, במהלך החיסון, כדי להבטיח שכל העכברים יתיישבו. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעה עד שעתיים, תלוי במספר בעלי החיים.

מודל זה מאפשר לחוקרים בתחום האינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן, לחקור את יכולתם של חיידקים, כמו סטרפטוקוקוס מקבוצה B, ליישב את מערכת הרבייה הנשית. ניתן להשתמש בהליך זה כדי לבדוק תרכובות חדשות או טיפולים פרוביוטיים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי התערבויות טיפוליות.