Name: מודל Murine של הקבוצה B סטרפטוקוקוס נרתיקי Colonization (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: למדו כיצד ליצור מודל עכברים לקולוניזציה נרתיקית של Streptococcus קבוצה B. שיטה זו מאפשרת חקר גורמים חיידקיים ותגובות חיסון מארח ללא שימוש בהרדמה או מדכאי חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות למנהל הוויווריום ולצוות באוניברסיטת סן דייגו סטייט על התמיכה בגידול בעלי חיים. במהלך עבודה זו, K.A.P. נתמך על ידי מלגת ARCS ומלגה מקרן Inamori. K.S.D. נתמך על ידי מענק R01, NS051247, מהמכונים הלאומיים לבריאות.

כל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי משרד טיפול בבעלי חי מעבדה בסן דייגו סטייט ועורך תחת סטנדרטי וטרינרים קבלו. עכברים נקבה, גיל 8 - 16 שבועות, שימשו לפיתוח שיטה זו. 1. הזרקת הכנה Intraperitoneal של β-אסטרדיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את β-אסטרדיול (0.5 מ&quot;ג / עכבר) על לשקול נייר כשהוא לבוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE). זהירות: β-אסטרדיול יכול להיספג דרך העור ומשטחים ריריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר β-אסטרדיול לצינור מערבולת חרוטי 15 מ&quot;ל עד שכל הגושים יוסרו β-אסטרדיול הוא אבקה דקה. צייר את שמן שומשום (100 μl / עכבר) לתוך מזרק 10 מ&quot;ל. מזרק-מסנן שמן שומשום לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל את-אסטרדיול β באמצעות מסנן 0.45-מיקרומטר. וורטקס צינור חרוטי 15 מ&quot;ל עד-אסטרדיול β הוא תרחיף הומוגני בשמן שומשום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את β-esההשעיה tradiol לתוך מזרק 10 מ&quot;ל חדש. עם 18 G, 1-ב. מחט, aliquot 100 μl של ההשעיה לתוך מזרקים טוברקולין 1 מ&quot;ל. הכן מזרק אחד עבור כל עכבר. מניח 26 חדש, הסטרילי G, ½-ב. מחט על מזרק אחד טוברקולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהל 0.5 מ&quot;ג של β-אסטרדיול המרחפים 100 μl של שמן שומשום (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל עכבר 24 שעות לפני חיסון חיידקי. להזריק כל עכבר בתוך החלל הצפק, ב רביעי הבטן התחתונים, רק בצד ימין או שמאל של קו האמצע, כפי שתואר לעיל 28. הערה: אין ניקוי או הגזיזה של הזריקה הוא הכרחי. </li></ol> 2. נרתיקי הרכבה עם GBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני חיסון, לגדל תרבית נוזל לילה 5 מ&quot;ל של זן של עניין GBS, כגון A909 (סרוטיפ Ia), במרק טוד יואיט (THB) על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת תרבות GBS הלילה בווליום 01:10 לתוך THB הטרי לדגור על 37 מעלות צלזיוס. לגדל אתחיידקים לשלב יומן אמצע (OD 600 = 0.4-0.5). הערה: זה בדרך כלל ייקח 2 - 3 שעות, בהתאם לזן של GBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את תת-התרבות על חיידקי צינור גלול חרוטי 15 מיליליטר סטרילי ב 3000 g × למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה חיידקי 200 μl של בופר פוספט סטרילית (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הגלולה המושעית, להביא 3 - 5 מיליליטר של PBS (1 מיליליטר לכל 10 עכברים) בדיוק OD 600 = 0.4 בתוך שפופרת תרבות של 5 מיליליטר חדשה. זה יהיה ריכוז של ~ 1 × 10 8 יחידות המושבה להרכיב (CFU) / מ&quot;ל. מעבירים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל חדש מחדש גלולה החיידקים 3,000 גרם × למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב PBS ב 1/10 נפח המקורי. לדוגמה, אם 3 מ&quot;ל של OD 600 = 0.4 היה pelleted, ואז resuspend אותו 300 μl של PBS. הערה: זהו השעית החיידקים הסופית (~ 1 × 10 9 CFU / ml) המשמשת חיסון בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reserve 50 μl של השעיה זו דילול סדרתי ציפוי על אגר THB לקבוע את הבידוד מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן כל עכבר עם 10 μl של השעית החיידקים הסופית כך 1 × 10 7 CFU ניתנת כל עכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסן, לרסן את העכבר באופן ידני על ידי הבטחת העור הרפוי על בעורפו בין של האגודל ואצבע מורה המטפלים ולאחר מכן לשתק את הזנב, כפי שתואר לעיל 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את 10 μl של GBS מוכן בשלב 2.6 לתוך קצה פיפטה טעינת ג&#39;ל 200 μl. הכנס את קצה 5 עד 10 מ&quot;מ לתוך לומן בנרתיק לוותר על 10 μl של הבידוד. הערה: טיפי טעינת ג&#39;ל עדיפים על טיפי 200 μl סטנדרטיים כדי למזער את הסיכון של טראומה או פציעת איברים, במיוחד עכברים צעירים יותר או קטנים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר חיסון, לשחרר את בעורף ולרומם את הקצה האחורי של העכבר, הרמת העכבר בזנבו walking את רגליו הקדמיות על משטח קשה עבור ~ 1 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק את פתח הנרתיק לכל backflow של בידוד. אם backflow הוא ציין, קצה פיפטה טרי ניתן להשתמש כדי לתפעל או להגדיל את פתח הנרתיק, דבר המקל על ספיגה של הזרימה חוזר לתוך לומן. בנוסף, backflow ניתן aspirated דרך פיפטה מחדש מחוסן. הערה: אם מתן סוכנים אקטואליים, אורגניזמים פרוביוטיים, או חלבונים בעלי עניין, בהיקף של עד 20 μl חיץ פיסיולוגי יכול להינתן בדרכי נרתיקית. </li></ol></li></ol> 3. שטיפת לומן בנרתיק לכמת טען GBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אחד צינור מיקרו צנטריפוגות 1.5 מ&quot;ל לכל עכבר על ידי הוספת 100 μl של PBS. זמן קצר לפני בניקוי, טרום להרטיב את הספוגית ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן את העכבר כמתואר בשלב 2.7.1 והכנס את ספוגית 10 מ&quot;מ לתוך לומן הנרתיק. בעדינות לסובב את ספוגית 4 פעמים עם כיוון השעון ו -4 פעמים נגד כיוון השעון, הפעלת לחץ קל על קיר הנרתיק.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ספוגית אל הצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל עם 100 μl של PBS. לפני הציפוי, מערבולת צינור microcentrifuge עבור ~ 15 שניות כדי לשחרר את חיידקי מהמקלון. סדרתי לדלל מדגם ב PBS צלחת 20 μl של דילולים 1:10 דרך 1: 10,000 על צלחות אגר בינוני ההפרש מוכן לפי הוראות היצרן. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. מושבות GBS יופיעו גם ורוד או סגול בהיר בצבע. פלורה אנדוגני אחרת תהיה עכבות, או תופיע מושבות כחולות, לבנות או אפורות. </li></ol> 4. איסוף נוזלים בנרתיק שטיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן את העכבר כמתואר בשלב 2.7.1. בעזרת קצה פיפטה טעינת ג&#39;ל 200-μl, pipet 20 μl של PBS לתוך לומן הנרתיק. בעדינות pipet את הווליום כולו ולמטה 4 פעמים בתוך לומן, ולאחר מכן למשוך את כל נפח באותו קצה פיפטה. הערה: אם נוזל השטיפה הוא עבה עם רירי, קצה פיפטה תקן 200 μlניתן להשתמש כדי לאסוף את נוזל השטיפה הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חיסכון נוזל שטיפה לניתוח ציטוקינים או כימות CFU, לוותר לתוך צינור microcentrifuge 0.7 מ&quot;ל. אם קביעת השלב של ייחום, לוותר לפחות 5 μl של נוזל שטיפה לשקופית זכוכית ולבחון את התאים בהגדלה 100X על מיקרוסקופ אור. הערה: לקבלת דוגמאות של שלבי הייחום, ראה איור 1. </li></ol> Dissection רקמות 5. המגון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל עכבר, להכין שלושה צינורות מתברגים 2 מיליליטר (אחד לכל רקמות: נרתיק, צוואר רחם, ורחם). ממלא כל צינור עם מספיק (0.4 - 0.5 גרם) 1.0 מ&quot;מ חרוזי zirconia כדי לכסות את תחתית החרוטים בצורה של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי הצינורות המוכנים לפני איסוף רקמות במשך 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, במיוחד אם לכימותי עומס חיידקים. הוסף 500 μl של PBS סטרילי כדי צינור אחד. לשקול כל צינור לאחר מעוקר ולהקליט לשימוש עתידי כדי לחשב משקל רקמה התאושש. </li><li&gt; להקריב את העכבר באמצעות אישרה שיטות מוסדיים כגון מחנק CO 2 ו נקע בצוואר הרחם. תרסיס לאורך הבטן הגחון עם 70% EtOH. במספריים סטריליות, לפתוח את חלל abdominopelvic, להרים את העור שרירי הגב ועל הבטן, ואת מקומו המעיים כך במערכת הרבייה חשופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המספריים עם 70% EtOH, לנגב לנקות במידת הצורך, והעביר את שני קרני הרחם באורך אמצע בין הגוף הרחם והשחלות. בעזרת מספרי מלקחיים, שומן קרבי נפרד, ממברנות, ואת שלפוחית ​​השתן מן במערכת הרבייה, נע caudally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מספריים כמתואר בשלב 5.4. רוחבי לחתוך את הנרתיק קרוב הפות ככל האפשר כדי להפריד את מערכת הרבייה מהגוף. הרם והוצא את מערכת הרבייה השלמה ולמקם אותו בצלחת פטרי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח חדש, להפריד את הרחם מצוואר הרחם ב קיצוץ רוחבי אחד. לעקר את סכין הגילוח עם 70%EtOH, ולאחר מכן להפריד את צוואר הרחם מהנרתיק ב קיצוץ רוחבי אחד. הערה: לא תהיה כמות מינימלית של רקמת הרחם עדיין מחוברת אל צוואר הרחם. תהיה כמות מינימאלית של רקמת נרתיק עדיין מחוברת אל צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר את כל הרקמות לתוך צינורות 2 מ&quot;ל של כל אחד מהם המכיל PBS ו שמאחד חרוזים. נקה את המלקחיים עם 70% EtOH בין טיפול בכל רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול כל צינור כובע בורג 2 מ&quot;ל ולחסר את המשקל המקורי של צינור כדי לקבוע את משקל רקמות. משקולות רקמות בדרך כלל להשתנות בין 20 - 100 מ&quot;ג. בחוזקה לאטום את צינורות כובע בורג homogenize הרקמות עבור 1 דקות במהירות המרבית ב homogenizer רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת עומס חיידקי, סדרתי לדלל 25 μl של homogenate רקמות דילולים צלחת 01:10 דרך 1: 10,000 על צלחות אגר בינוני ההפרש. דגירה צלחות כמתואר בשלב 3.3. כדי לאחסן דגימות כימות ציטוקינים, להקפיא homogenates רקמה על -20 ° C. </li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

כדי לקדם את קידום ההבנה של אינטראקציות GBS עם שני מארח חיידקים אחרים בהקשר של המארח, במודל חיה נדרש. עבודה זו מתארת ​​את ההיבטים הטכניים של הקמת קולוניזציה וגינלית GBS בעכברים. פרוטוקול זה משיג&gt; 90% קולוניזציה של עכברים ללא שימוש בהרדמה לחסן חיידקים או לאסוף דגימות ספוגיות, דיכוי מערכות חיסון כדי לאפשר קולוניזציה, שטיפה-מראש נרתיק, או תוספות כדי לעבות את הבידוד. יתר על כן, מודל זה מדגים שחזור חזק, עם השתנות צנועה הבין-ניסיוני בשני אורך התמדת GBS והינטל החיידקים. תוצאות הנציגים ...

סטרפטוקוקוס agalactiae, מקבוצה B Streptococcus (GBS), הוא חיידק כמוס, גראם חיוביים אשר מבודד לעתים קרובות מהבטן בדרכי המין והשתן של מבוגרים בריאים. בשנות ה -1970, GBS התגלה בתור הסוכן המוביל לתמותה בילוד זיהומיות, עם למעלה מ -7,000 מקרים של המחלה בילוד בשנה 1. מחלה מוקדמת GBS (סוף יום) מתרחשת בשעות או בימים הראשונים של החיים, נשאלת דלקת ריאות או מצוקה נשימתית, ולעתים קרובות מתפתח אלח דם, ואילו מחלות בגיל מאוחר (לוד) מתפתח לאחר מספר חודשים ומציג עם בקטרמיה, אשר לעתים קרובות ומקדמות דלקת קרום המוח 2. החל משנת 2002, המרכז לבקרת מחלות ומניעתן ממליץ על בדיקה אוניברסלית עבור קולוניזציה וגינלית GBS ב הריון מאוחר וטיפול מונע אנטיביוטי במהלך הלידה (IAP) כדי GBS חיובי אמהות 1. למרות הירידה של המחלה מוקדמת בכ -1,000 מקרים בארצות הברית מדי שנה בשל IAP,GBS נשאר הגורם המוביל של אלח דם בילוד מוקדם, ו התרחשות מאוחרת נשארת 1 מעושה. בין אם ברחם, בזמן הלידה, או אפילו במקרים בגיל מאוחר, חשיפה לידתי עד GBS דורשת הישרדות, משוכל באמצעות מספר סביבות מארחות ומחסומים, התחמקות חיסונית, וכן, במקרה של דלקת קרום מוח, חציית דם הפיקוח ההדוק מוח 2. Upstream של אינטראקציות הארסיות אלה בתוך הילוד הוא קולוניזציה הראשונית של מערכת הנרתיק האימהית. אימהי שיעורי קולוניזציה וגינלית GBS נעים בין 8-18% במדינות מפותחות ומתפתחות, עם שיעור ממוצע מוערך של 12.7% 3,4. קולוניזציה GBS בדרך בנרתיק במהלך ההריון יכולה להיות קבועה, לסירוגין, או בעלת אופי ארעי בקרב נשים בודדות 5. נקודה מעניינת הוא אימהית גיל&gt; 36 שנים קשורות קולוניזציה המתמשכת 6. גורמי סיכון ביולוגי סוציו אקונומי רבים להתיישבות הנרתיק GBSזוהה. גורמים ביולוגיים כוללים קולוניזציה GBS העיכול והיעדר לקטובצילוס בתוך הבטן. עם זאת, מוצא אתני, השמנת יתר, היגיינה, פעילות מינית גם קושרו עם מרכבת 7 נרתיק GBS. למרות לשמצה בגרימת זיהומים בילוד, GBS גורם גם מגוון של זיהומים אימהיים הוא peripartum ולאחר לידה. מרכבת GBS היא גדלה אצל נשים עם הצגת דלקת נרתיק 8 ו, במקרים מסוימים, יכולה להיות אפילו את ישות מחל 9. בנוסף, התרוממות GBS באיברי הרבייה במהלך ההריון עלולה לגרום זיהום תוך-שפיר או chorioamnionitis 10. יתר על כן, ב עד 3.5% מכלל ההריונות, GBS מפיצה לשלפוחית השתן לגרום לזיהום בדרכי השתן או בקטרוריה אסימפטומטית 11. בקטרוריה GBS במהלך ההריון קשורה לסיכון מוגבר של קדחת לידתית, chorioamnionitis, לידה מוקדמת, ואת prematurקרע הדואר של ממברנות 12. יחדיו, בנוכחות GBS בתוך מערכת הנרתיק קשורה לזיהומים של רקמות מארחים מרובים, ואת היכולת לבטל GBS מן הנישה הזו הוא הכרחי עבור שניהם בריאות האם בילוד. עד לאחרונה, רוב העבודה בחינת אינטראקציות GBS עם מערכת הצרויקו הוגבל מודלים תא במבחנה 13-15. ניסויים במבחנה אלה חשפו גורמי חיידקיים שחשובים לדבקות, כוללים חלבוני משטח כזה חוזר פילים ו סרין עשיר 17,18, כמו גם מערכות רגולטוריות דו רכיבים 15,19 ותגובת התעתיק העולמית של האפיתל נרתיקית GBS 19. עם זאת, על מנת להבהיר את מארח חיידק האינטראקציות באופן מלא בתוך מערכת הנרתיק, במודל חיה חזק הכרחי. עבודה מוקדמת הראתה כי GBS ניתן להשבה מתוך בדרכי הנרתיק של עכברים מחוסנים 20,21 וחולדות &lt;sup&gt; 22 בשני תנאים בהריון שאינן בהריון. בשנת 2005, קולוניזציה וגינלית GBS לטווח קצר הייתה דגם בעכברים כדי לבחון את היעילות של אנזים ממס הפאג לטיפול GBS בנרתיק פני תקופה של 24 שעות 23. מספר שנים לאחר מכן, במודל של עכברי קולוניזציה וגינלית לטווח ארוך GBS פותח ללמוד גורמים המארח חיידקי מסדירי התמדת GBS. מודל זה זיהה מספר גורמים GBS תורם קולוניזציה, כולל הנספחים משטח 17,18 ומערכות דו רכיבי GBS 19,24. מודל זה תרם לזיהוי מנגנוני התגובה מארח 19,25 ו שימש כדי לבדוק אסטרטגיות טיפוליות שונות, כולל פפטידים אימונו-26 ו פרוביוטיקה 27. פרוטוקול זה נותן את ההדרכה הדרושה כדי לחסן GBS לדרכי עכבר הנרתיק ולאחר מכן לעקוב קולוניזציה ולאסוף דגימות עבור ניתוחים נוספים.

<table><tbody><tr><td>שמן שומשום&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-אסטרדיול&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875-1G</td><td>זהירות: יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. &בטא;-אסטרדיול יכול להיספג דרך העור והמשטחים הריריים.&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu; l קצות פיפטה לטעינת ג'ל&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1252-0610</td><td></td></tr><tr><td>ספוגיות שופכה-איברי מין, סטריליות, סידן אלגינט</td><td>פוריטן</td><td>25-801 A 50</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar StrepB</td><td>DRG International</td><td>SB282</td><td></td></tr><tr><td>טוד יואיט מרק</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>7161C</td><td></td></tr><tr><td>18 גרם, 1.5 אינץ' מחטים</td><td>BD</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>26 גרם, 0.5 אינץ' מחטים</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים 10 מ"ל</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים 1 מ"ל</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m מסנני מזרק PVDF</td><td>Whatman</td><td>6900-2504</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט של Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל murine של הקבוצה b<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

סטרפטוקוקוס agalactiae (מהקבוצה B Streptococcus, GBS), הוא למעצמה קולוניאלית גראם חיובי, ללא תסמינים של מערכת העיכול האנושית ודרכי נרתיק של 10 - 30% ממבוגרים. אצל אנשים החיסון נפגעת, בילודים כולל, נשים בהריון, קשישים, GBS עלול לעבור פתוגן פולשנית גרימת אלח דם, דלקת פרקים, דלקת ריאות, דלקת קרום המוח. בגלל GBS הוא הפתוגן חיידקי מובילה של ילודים, מניעה הנוכחית מורכבת ההקרנה הריון מאוחר לגרורות GBS בנרתיק וטיפול אנטיביוטי שלאחר מכן peripartum של אמהות GBS חיובי. נטלו נרתיק GBS כבד הוא גורם סיכון למחלה והתנחלות בילוד. למרבה הצער, מעט מאוד ידוע על המארח וגורם חיידקי מקדמים או להתיר GBS קולוניזציה וגינלית. פרוטוקול זה מתאר טכניקה להקמת קולוניזציה וגינלית GBS המתמשכת באמצעות דגימה אחת β-אסטרדיול טרום טיפול יומי לקבוע לואה חיידקיםד. זה שיטות לפרטים נוספים כדי לנהל סוגי טיפולים נוספים או ריאגנטים עניין לאסוף נוזל שטיפה וגינלית ורקמות במערכת הרבייה. במודל עכבר זה יהיה עוד יותר את ההבנה של יחסי הגומלין GBS-המארח בתוך סביבת הנרתיק, אשר יוביל טיפולית מעניינת פוטנציאל לשלוט קולוניזציה הנרתיק של האם במהלך ההריון כדי למנוע העברת לגבי הילוד פגיע. זה גם יהיה עניין להגדיל את הבנתנו אינטראקציות חיידקי מארח כלליות בדרכי הנרתיק הנשיות.

במהלך הפיתוח של המודל הזה, תצפיות מרובות נעשו לגבי הגורמים המשפיעים על משך קולוניזציה וגינלית GBS. כדי לקבוע כיצד לשלב הייחום בבית משפיע חיסון התמדה חיידקי GBS, עכברים בוימו ביום של חיסון באמצעות נוזל שטיפה וגינלית. איור 1 מדגים את ארבעת השלבים של מחזור הייחום העכבר, כפי שנקבע על ידי רטוב הר נוזל שטיפה וגינלית, שיטה מבוססת היטב 29. עכברים חולקו לקבוצות על פי בשלב ראשוני זה, והתמדה GBS היה פיקוח לאורך זמן באמצעות בניקוי ה...

מטרת פרוטוקול זה היא לחקות קבוצה אנושית B Streptococcus (GBS) קולוניזציה וגינלית במודל בעכברים. שיטה זו עשויה לשמש כדי לחקור תגובות מארחות חיסוניות וגורם חיידקי תורם התמדת נרתיק GBS, כמו גם לבחון אסטרטגיות טיפוליות.

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

המטרה הכוללת של מודל חיה זה היא לבסס קולוניזציה של Streptococcus group B, או GBS, בדרכי הנשק של עכבר. שיטה זו יכולה לסייע לנו להבין שאלות מפתח לגבי קולוניזציה של Streptococcus group B, כגון, מהם הגורמים הבקטריאליים החשובים לקולוניזציה, וכן כיצד תגובות המארח משפיעות על ההתמדה בנשק. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שההחדרה, בדרך כלל, מביאה לקולוניזציה של יותר מ-90% ללא שימוש באלחוש, במדכאי חיסון או בחומרי הסמכה.התחילו בערבול ב-vortex של 0.5 מיליגרם של beta-Estradiol, לכל עכבר, בתוך מבחנה קונוית של 15 מיליליטר עד להסרת כל הגושים ועד ש-beta-Estradiol ייראה כאבקה דקה. לאחר מכן, סננו באמצעות מזרק 100 מיקרוליטר של שמן שומשום, לכל עכבר, אל תוך המבחנה דרך מסננת של 0.45 מיקרון, וערבלו שוב את המבחנה ב-vortex. כאשר ההורמון מפוזר כתליה הומוגנית בשמן, שאבו את התחליט למזרק חדש של 10 מיליליטר וחברו מחט במידה 18 ובאורך של אינץ' אחד.העבירו מנה של 100 µL מהתליה למזרק טוברקולין של 1 mL אחד לכל עכבר, וציידו כל מזרק טוברקולין במחט סטרילית, gauge 26, באורך חצי אינץ'. לאחר מכן, מזריקו 100 µL של beta-Estradiol לרביע השמאלי או הימני התחתון של חלל הפריטוניאום של כל בעל חיים. באותו יום של ההזרקה, גדלו תרבית נוזלית לילית של 5 mL של זן ה-GBS הרלוונטי בתוך מצע Todd Hewitt broth, או THB, בטמפרטורה של 37 °C.למחרת בבוקר, בצע תת-תרבית של ה-GBS ביחס של 1:10 ב-THB טרי לדגירה של שעתיים עד שלוש ב-37 degrees Celsius, עד שהחיידקים מגיעים לשלב ה-mid-log. לאחר מכן, העבר את תת-התרבית לשפופרת קונית סטרילית של 15 milliliter, וסבב את תאי החיידקים בצנטריפוגה. השהה מחדש את המשקע ב-200 microliters של PBS סטרילי.לאחר מכן, השלימו את הנפח הכולל של התרחיף ל-1 מיליליטר של PBS לכל 10 עכברים, כדי להגיע ל-OD600 של 0.4 במבחנת תרבית חדשה של 5 מיליליטר. העבירו את התרבית למבחנה חדשה של 15 מיליליטר, ובצעו שקיעה חוזרת של החיידקים. לאחר מכן, השעיקו את התאים ב-PBS בנפח השווה לעשירית מהנפח המקורי.השאירו 50 µl מהחיידקים לצורך דילול סדרתי וזריעה על מצע THB agar, כדי לקבוע את ה-CFU המדויק של האינוקולום. לאחר מכן, שאבו 10 µl של GBS לתוך טיפ של פיפט להעמסת ג'ל בנפח 200 µl, וקבעו ידנית את העור הרפוי בעורף של החיה הראשונה בין האגודל לאצבע המורה, ולאחר מכן קבעו את הזנב. הכניסו את טיפ הפיפט למרחק של 5 עד 10 מילימטרים אל תוך הלומן הנרתיקי, ופרוקו את כל נפח האינוקולום.לאחר מכן, שחרר מיד את העורף והרם את הזנב כדי להגביה את חלקו האחורי של בעל החיים, תוך כדי הליכה של הכפות הקדמיות על משטח קשיח. לאחר דקה, בדוק ויזואלית את פתח הנרתיק כדי לוודא שלא חלה רגרסיה (backflow) של האינוקולום. רגע לפני הניגוב, הרטב את הכותנה ב-PBS, וכבל את אחת העכברים כפי שהודגם כעת.החדירו את swab למשך 10 millimeters אל תוך lumen של הנרתיק, וסובבו אותו בעדינות ארבע פעמים עם כיוון השעון וארבע פעמים נגד כיוון השעון, תוך הפעלת לחץ קל על דופן הנרתיק. העבירו את swab לתוך מבחנת microcentrifuge של 1.5 milliliter המכילה 100 microliters של PBS, ובצעו vortex למבחנה ול-swab למשך כ-15 seconds כדי לשחרר את החיידקים מסיבי הכותנה. לאחר מכן, בצעו דילול סדרתי לכל דגימה ב-PBS, וזרועו 20 microliters מדילולים של 1:10 עד 1:10,000 על צלחת agar של differential medium, שהוכנה לפי הוראות היצרן, לדגירה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 hours.מושבות GBS יופיעו בצבע ורוד בהיר או סגול (mauve). כדי לאסוף את שטיפת הנרתיק, השתמשו בטיפ פניטציה להטענת ג'ל של 200 microliter כדי להעביר 20 microliters של PBS אל תוך חלל הנרתיק. בצעו פיפטור עדין של כל הנפח למעלה ולמטה ארבע פעמים בתוך החלל.לאחר מכן, באמצעות אותה טיפ, שאבו את כל הנפח. לצורך ניתוח המשך של נוזל השטיפה, העבירו את השטיפה למבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 0.7 milliliter. לצורך הומוגניזציה של נתיחה רקמתית, רססו את הבטן הוונטרלית של בעל חיים שהורדם להמתה ב-70 percent ethanol, והשתמשו במספריים סטריליים כדי לפתוח את חלל הבטן והאגן.הזיזו את המעיים כך שדרכי הרבייה יהיו חשופות. לאחר מכן, גזרו את שתי קרני הרחם, במרכז אורכן, בין גוף הרחם לשחלות. באמצעות מספריים ופינצטה, הפרידו את השומן הוויסרלי, את הקרומים ואת שלפוחית השתן מדרכי הרביה, תוך הזזת הרקמות לכיוון הזנב (caudally).לאחר מכן, בצעו חיתוך רוחבי של הנרתיק קרוב ככל האפשר לפרה (vulva), כדי להפריד את מערכת הרבייה מהגוף. העבירו את מערכת הרבייה השלמה אל צלחת פטרי סטרילית, והשתמשו בלהב תער חדש כדי להפריד את הרחם מצוואר הרחם בחיתוך רוחבי אחד. הפרידו את צוואר הרחם מהנרתיק באמצעות חיתוך רוחבי נוסף.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להעביר כל אחת מהרקמות למבחנות נפרדות בנפח 2 מיליליטר שנשקלו מראש ומכילות 500 µL של PBS וחרוזי הומוגניזציה. שקלו כל מבחנת 2 מיליליטר כדי לקבוע את משקל הרקמה. לאחר מכן, סגרו היטב את מכסי הבורג והומוגניזו את הרקמות במשך דקה אחת, במהירות המקסימלית, במכשיר להומוגניזציה של רקמות.כדי לכמת את העומס החיידקי, בצעו דילול סדרתי של 25 µL מהומוגנאט הרקמה והעבירו לצלחות אגר עם מצע דיפרנציאלי בדילולים של 1:10 עד 1:10,000, לדגירה של 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C. לצורך אחסון דגימות לקמתות ציטוקינים, הקפיאו את ההומוגנאטים בטמפרטורה של 20- °C. בתמונות אלו מוצגים ארבעת השלבים של מחזור הבעולת בעכבר, כפי שנקבעו באמצעות בדיקת תכשיר רטוב של נוזל שטיפה נרתיקי.עכברים שחוּקְלּו בשלב הפרואסטרוס (proestrus) הראו התנחלות של GBS למשך זמן ארוך יותר מאשר בכל שלב אחר של מחזור ההשבחה, ובמיוחד בהשוואה לאלו שהיו בשלב הדיאסטרוס (diestrus) בזמן החקילה. מצב של אסטרוס (estrus) מתמשך מקדם את ההישארות של GBS A909 בעכברי CD-1, כאשר נצפתה התנחלות של 90% שבועיים לאחר החקילה. בניסוי טיפוסי שבו ניתן מנת בטא-אסטרדיול (beta-Estradiol) אחת לפני החקילה, רק 40% עד 50% מהעכברים היו מזוהים עם התנחלות שבוע לאחר החקילה, כאשר ממוצע ה-GBS שהופק שיקף את אחוז ההתנחלות.הדגמה לכך ששמירה על מצב של Estrus רציף מקדמת התמדה של GBS בנרתיק ברוב עכברי ה-CD-1. GBS A909 נשאר בדרכי הנרתיק בעכברי CD-1 שאינם בעלי קרבה גנטית (outbred) ובעכברי FVB בעלי קרבה גנטית (inbred) למשך כשבוע. זאת, בעוד שרוב עכברי ה-BALB/c וה-C57BL/6 בעלי הקרבה הגנטית הופכים למעובדים (colonized) בשבוע הראשון למשך חודש או יותר.ויזואליזציה של GBS חיובי ל-GFP בבעלי חיים שהוחדרו מדגימה את נוכחותו של GBS ההיצמד לאפית הנרתיק של העכבר ובסמיכות קרובה לצמחייה נרתיקית טבעית אחרת. חשוב למנוע זרימה חוזרת, במהלך ההחדרה, כדי להבטיח שכל העכברים יקולנזו. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בשעה עד שעתיים, תלוי במספר בעלי החיים.מודל זה מאפשר לחוקרים בתחום האינטראקציות בין מאחס לפתוגן לבחון את יכולתם של חיידקים, כגון group B strep, להתנחלות במערכת הרבייה הנשית. ניתן להשתמש בהליך זה לבדיקת תרכובות חדשות או טיפולים פרוביוטיים כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע להתערבויות טיפוליות.

a-murine-model-of-group-b-streptococcus-vaginal-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מפתח טכניקות כדי לשמש...

הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק

מקור: Morrill, S. R., et al. מודלים של קולוניזציה נרתיקית של עכברים על ידי חיידקים שגדלו אנאירובית. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים פרוטוקול למידול קולוניזציה נרתיקית בעכברים באמצעות חיידקים אנאירוביים עמידים לאנטיביוטיקה. זה מתחיל בטיפול הורמונלי להגברת הרגישות לאפיתל, ואחריו חיסון נרתיקי וחיסון משותף בתנאים אנאירוביים. ההליך מסתיים בדגימה ותרבית לאחר החיסון כדי להעריך את קולוניזציה של חיידקים והיווצרות ביופילם.

מידול קולוניזציה של נרתיק עכברים על ידי חיידקים אנאירוביים

מקור: פטרס, ק. א., דוראן, ק. ס. מודל עכבר של קולוניזציה נרתיקית של סטרפטוקוקוס בקבוצה B. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים את ההכנה והחיסון הנרתיק של עכבר נקבה שטופלה הורמונלית עם סטרפטוקוקוס מקבוצה B כדי למודל זיהום. הוא מסביר כיצד לגדל ולהכין את החיידק, להזריק את החיסון ללומן הנרתיק, ולהבטיח זיהום מוצלח.

הקמת מודל עכבר לזיהום סטרפטוקוקוס בקבוצה B בנרתיק

מקור: פטרס, ק. א. ודוראן, ק. ס. מודל עכבר של קולוניזציה נרתיקית של סטרפטוקוקוס בקבוצה B. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים את הכימות של עומס סטרפטוקוקוס (GBS) בקבוצה B בנרתיק במודל עכבר באמצעות דגימה ותרבות כרומוגנית. הוא מפרט את השלבים באיסוף דגימות, ציפוי וספירת מושבות כדי לכמת את עומס GBS בלומן הנרתיק של העכבר.

כימות עומס סטרפטוקוקוס מקבוצה B בלומן הנרתיק של העכבר באמצעות דגימה ותרבות כרומוגנית

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום Escherichia coli אורופתוגני בשלפוחית השתן של עכבר נקבה באמצעות החדרת קטטר טרנס-שופכתי. החיידקים המוזרקים מצליחים לבסס זיהום בדרכי השתן בתוך שלפוחית השתן, ומספקים פלטפורמה רבת ערך לחקר מחלות הקשורות לבריאות הקשורות לדרכי השתן.

הקמת מודל של דלקת בדרכי השתן בעכברות

meningitidis Neisseria הוא הפתוגן ספציפי אדם שמדביק את כלי דם. בפרוטוקול זה microvessels אדם מוכנס בעכבר על ידי השתלת עור אנושי על עכברי חיסון. חיידקים לדבוק בהרחבה לכלי האנושי, שהובילו לניזק והתפתחות כלי דם של הפריחה purpuric נצפתה בדרך כלל במקרים של בני אדם.

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

מודל עכברי של חיסון אורופתוגני E. coli (UPEC) טרנס-urethral כדי ליצור מאגרי שלפוחית שתן תוך-תאיים סמויים וחשיפה שלפוחית השתן לאחר מכן ל - G. vaginalis כדי לגרום ל- UPEC UTI חוזר ונשנה מודגם. כמו כן הודגמו ספירה של חיידקים, ציטולוגיה של שתן, וקיבוע ועיבוד שלפוחית השתן באתרם לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים.

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

הפרוטוקול מציג מודל עכברי של התיישבות נרתיקית עם חיידקי נרתיק אנושיים בתרבית אנאירובית. אנו מתמקדים ב- Gardnerella vaginalis, תוך הכללת הצעות עבור Prevotella bivia ו - Fusobacterium nucleatum. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כמדריך לחיסונים וגינליים והתאוששות בת קיימא של חיידקים אחרים שגדלו באנאירוב.

מודלים של התיישבות נרתיקית מורין על ידי חיידקים שגודלו אנאירובית

לידה מוקדמת (לידה &lt; שבוע 37) היא בעיה בריאותית עולמית דחופה עם אפשרויות מניעה וטיפול לא אופטימליות. אנו מציגים מודל עכברי של לידה מוקדמת הנגרמת על ידי זיהום חיידקי בנרתיק ומתארים כיצד לנתח את התחלואה והתמותה של היילודים כתוצאה מכך.

מידול זיהום נרתיקי עולה, לידה מוקדמת ותחלואה בילודים בעכברים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים להתיישבות בעכברים עם pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים, וכן שיטות לא פולשניות לאימות קולוניזציה והערכת התרחבות pks+ E. coli בצואה.

התיישבות עם עכברים pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים

למדו כיצד ליצור מודל עכברים לקולוניזציה נרתיקית של Streptococcus קבוצה B. שיטה זו מאפשרת חקר גורמים חיידקיים ותגובות חיסון מארח ללא שימוש בהרדמה או מדכאי חיסון.

מודל Murine של הקבוצה B

גלה סרטונים נוספים