Name: איתור של Trypanosoma brucei מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למד שיטה מהירה לבידוד טריפנוזומות המבטאות גליקופרוטאיני משטח משתנים (VSG) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מתגים נדירים וחקר שונות אנטיגנית בטפילים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות צלב ג&#39;ורג &#39;עבור ייעוץ כללי על הביולוגיה trypanosome. עבודה זו נתמכה גם על ידי ביל ומלינדה גייטס GCE מענק DS, מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (dge-1,325,261) כדי MRM ו NIH / NIAID (מענק # AI085973) כדי FNP. אנו מודים גלדריאל בקתה-כורים לשימוש של הזן המכיל את אתר I-SCEI גן וההכרה.

הערה: לאורך כל ההליך, יש צורך לשמור על תאים על קרח. תקשורת קרה אמורה לשמש גם לאורך כל דרך. קציר לדוגמא 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול trypanosomes הדם זן ליסטר 427 צפיפות של 0.5 - 1 מיליון / מ&quot;ל. עדיף להתחיל תרבויות עם מספר קטן של טפילים. ספין למטה 50 x 10 6 תאים / המדגם עבור 10 דקות ב 1500 x ז. הקפד להשאיר 1 x 10 6 תאים בתרבית לשימוש מאוחר יותר להשתמש שולטת נוגדנים חיוביים ושליליים. הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש גם על trypanosomes המבודד דם בעלי חיים (ראה דיון לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה או לשפוך את רוב supernatant (להשאיר כ -750 μl). מעבירים את התאים לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ב microcentrifuge ולהסיר supernatant. </li></ol> 2. תיוג מגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 150 בינוני תרבות μl (wi HMI-9סרום ה למשל) + נוגדן אנטי VSG העיקרי בבית הדילול המתאים. הערה: הנוגדן אנטי VSG נעשה בבית והשתמש בכל דילול של 1:50. חשוב להשתמש נוגדן אנטי VSG ראשית שאינה שכותרתו עם fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים וורטקס בעזרת מערבולת מתאם-60 במהירות 6 - 8 בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשטוף עם 800 - 1,000 μl קר HMI-9 עם סרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ו לשאוב supernatant. לשטוף עם 1 מ&quot;ל HMI-9 עם סרום ספין כנ&quot;ל. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 100 μl של HMI-9 עם סרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 110 μl של תא מגנט מיון מופעל microbeads (MSC). השתמש ועכבר אנטי, ארנבת אנטי, או חרוזים אנטי ביוטין בהתאם נוגדן אנטי VSG העיקרי. לערבב היטב. תאים וורטקס בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד תאי vortexing, להגדיר עמודה / מדגם הפרדה מגנטי מופעל אחד על מגנט הפרדה. הקפד קיימת מחדשceptacle (אנו משתמשים צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל) תחת העמודה לאסוף את הזרימה דרך. הגדרת מנגנון בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של HMI-9 עם סרום לעמודה הממשלה. לאחר תחול מקום צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל תחת העמודה לאסוף זרימה דרך מכל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 10 דקות בשלב 2.4, להוסיף 800-1,000 μl קר HMI-9 עם סרום. ספין על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant להסיר נוגדן מאוגד. לשטוף עם 1 מ&quot;ל של HMI-9 עם להשאיר בסרום וחזור 100 μl של supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליק צינור צנטריפוגות במרץ חזותי לבדוק את הצינור כדי לוודא כי היא הגלולה resuspended לחלוטין. הוסף 1 מ&quot;ל של HMI-9 עם סרום ו פיפטה למעלה ולמטה כדי לוודא שתאי הם resuspended היטב. </li></ol> 3. הפרדה מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעמודים דרוך כמתואר לעיל. החל תאים לעמודה. אסוף זרימה דרך עם תאים המבטאים את VS הלא הדומיננטיג 1 מ&quot;ל של מדיום + trypanosomes בדרך כלל לוקח 6 - 7 דקות לזרום דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2x לשטוף עם 1 מ&quot;ל של HMI-9 עם סרום ולאסוף זרימה דרך באותו צינור כמו בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה דרך Divide (3 מ&quot;ל) לשני צינורות 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. הערה: אלה ניתן לשלב מאוחר יותר או חצי יכול לשמש כדי לבודד RNA, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עמודה מגנט. הוסף 3 מ&quot;ל של HMI-9 עם סרום לעמודה לצלול טור לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל להשיג תאים המבטאים את ההתחלה, דומיננטי VSG. הסר 300 μl של חומר eluted לצורך ניתוח מאוחר יותר. שמור את התאים הללו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש בתור חיובי כביקורת שלילית, לקחת כ 1 מיליון תאי מתרבות המוצא של תאים מלאים גדלו ב 37 ° C (מדינות שאינן צפויות לעבור תדיר) ו פיפטה אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. הערה: תאי בקרה חיוביים יהיו מוכתמים עם נוגדן fluorophore שכותרתו בשלב 4.1. הרמ&quot;א תאי הבקרה השליליב רבב בכל שאר הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה דרך ספין דגימות מדגם מלא נוגדנים חיוביים על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant. הערה: עוד 300 μl aliquot של תאים eluted ניתן להשתמש כביקורת חיובית מכתים אנטי VSG. </li></ol> מכתים 4. לזהות מזהמים בוררים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה דרך גלולת דגימות ותא בקרה חיובית ב 100 μl של HMI-9 עם סרום + עיקרי, שכותרתו fluorophore, נוגדן אנטי VSG על הדילול המתאים. הערה: הנוגדן אנטי VSG שכותרתו נעשה בבית והשתמש בדילול של 1: 1,000. Fluorophore שכותרתו, אנטי VSG יכול להיות מאותו מקור כמו הנוגדן ללא תווית בהפרדת MACS step.There צריך להיות 3 מ&quot;ל של מדגם זרימה דרך בשני צינורות microcentrifuge לאחר שלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את כל הזרימה דרך על ידי זרימת cytometry, לשלב את הכדורים בשני צינורות microcentrifuge בעוד מחדש susממתינים דגימות 100 μl של HMI-9 עם נוגדן בסרום + אנטי VSG. לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים וורטקס בחדר קר על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להוסיף 800 - 1,000 μl קר HMI-9 עם סרום. ספין דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant להסיר נוגדן מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 1 מ&quot;ל של HMI-9 עם סרום. ספין דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 5,200 XG ולהסיר supernatant. במהלך הספין האחרון, לסובב את דגימות eluted משלב 3.4 ואת מדגם ביקורת השלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל דגימות הזרימה דרך eluted ב: 148.5 μl HMI-9 עם סרום, 25 μl חרוזים ספירה מוחלטת 1.5 μl יודיד Propidium מכתימים פתרון (175 סך μl). Resuspend דגימות בקרת נוגדנים חיוביות ושליליות 175 μl HMI-9 עם סרום. הקפד לרשום את מספר חרוזי ספירה מוחלטים / 25 μl עבור במגרש המסוים בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל הדגימות באמצעות cytometer זרימה ולאסוף נתונים. תאים מתים כתם כמו PI <sup&gt; +. מזהמים להכתים כמו PI - VSG +. בוררים להכתים כמו PI - VSG - 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מיתוג תדרים באמצעות זרימת cytometry נתונים. הערה: לקבלת הוראות כיצד לחשב תדרים מיתוג, עיין בקובץ משלים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Flow Cytometry Calculations.docx</a> ולוח 1. </li></ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עם כל כבוד טכניקה ניסויית, המרכיב הקריטי ביותר של פרוטוקול השמירה על כל הדגימות קרות. Trypanosomes במהירות מאוד להפנים נוגדן מאוגד השטח שלהם 9, אך תהליך זה הוא תנועתיות תלויה, ואינו להשפיע על assay כל עוד התאים נשמרים על 4 מעלות צלזיוס. כל הדגימות תמיד צריך להיות כל הזמן על הקרח, ואת pipetting צריך להיעשות במהירות כדי לצמצם את החשיפה לסביבה מעבדה C 25 °. קרת HMI-9 עם סרום צריך להיות זמין בתחילת הניסוי צריך להישמר על קרח לאורך כל דרך. בידוד של trypanosomes ידי הפעלת אותם...

הטפיל protozoan, Trypanosoma brucei, הוא סוכן סיבתי של מחלות המשפיעות בני אדם (דרך Trypanosoma brucei gambiense ו Trypanosoma brucei rhodesiense) ובעלי חיים (דרך Trypanosoma brucei brucei) ברחבי אפריקה שמדרום לסהרה. החיידק מועבר המארח יונק דרך הרוק של וקטור זבוב הצה צה. שני האדם מחלת השינה Animal לגרום לנטל כלכלי חמור באזורים אנדמיים, ומעטים סמים זמינים או בפיתוח לטיפול או מחלה. הבנת מנגנוני התחמקות חיסון היא קריטית להתפתחות של תרופות עבור trypanosomiasis. וריאציה אנטיגני של המשטח הצפוף, Variant גליקופרוטאין (VSG) המאפשר לכסות את הטפיל היא אחד האמצעי העיקרי שבאמצעותו ט brucei מתחמקת תגובת הנוגדנים היונקת. כ -2,000 וריאנטים של גן VSG קיימים בגנום trypanosome, אבל רק אחד הוא עבד בכל זמן נתון מאחד ~ 15 הבעהאתרי שיאון. &quot;מיתוג&quot; של VSG הביע יכול להתרחש גם על ידי העתקת גן VSG לתוך אתר הביטוי הפעיל, או על ידי הפעלת תעתיק של אתר ביטוי שותק בעבר (הנסקרת ב 1). למרות העבודה הרבה הוקדשה וריאציה אנטיגני להבנת בט&#39; brucei, הגורמים המשפיעים מיתוג תדר עדיין הם הבינו היטב. מחקרים שנערכו עד כה כבר הקשה על ידי העובדה כי בעוד מיתוג מתרחש stochastically במבחנה, תדרי מיתוג נמצאים ברמות נמוכות מאוד, בסדר גודל של 1 בסביבות 10 6 תאים 2. זה מקשה למדוד אם עליות גורם כפל או מקטין תדר מיתוג, מאז המיתוג קשה לזהות מלכתחילה. לפני 2009, שיטות לבידוד בוררים באוכלוסיית נתונה היו ממושכות ועבודה אינטנסיבית. passaging אלה כללו trypanosomes באמצעות עכברים שחוסנו נגד VSG הדומיננטי ואז תאי קצירה3 כעבור יום, או לספור מאה תאים על ידי immunofluorescence 4,5. אסטרטגיה נוספת מסתמכת על בחירה עבור עמידות לתרופות לבודדת בוררת 6. בגלל trypanosomes אפריקה לגדל במבחנה הן בדרך כלל מורכבת אוכלוסייה גדולה להביע גרסה אחת גדולה, ואוכלוסייה קטנה בהרבה של בוררים להביע הגירסות חלופיות, אנו מתייחסים הגרסה הגדולה ברחבי נייר זה כמו VSG הדומיננטי, החל. בעשותו כן, אנו בשום פנים ואופן לא רוצה לרמוז גרסה מרכזי זה יש כושר יותר מאשר גרסאות אחרות באוכלוסייה. כאן אנו מתארים שיטה שיכולה למדוד את מספר מהימן של trypanosomes להביע VSG הלא דומיננטית באוכלוסיה נתונה ב 3 - 4 שעות. שיטה זו שימושית במיוחד עבור כשרוצה לבדוק אם מניפולציה גנטית נתונה או טיפול תרופתי מגדילה את מספר תאי חליפה באוכלוסייה. במקום לפטור את אוכלוסיית התאים המבטאים את המטלותminant, החל VSG באמצעות תרופות או באמצעות אימונולוגית, תאים אלה בוטלו על ידי ציפוי אותם קודם עם חרוזים מגנטיים מצמידים את הנוגדן כנגד VSG הדומיננטי ואז לבודד אותם על עמודה מגנטית. אוכלוסיית החליף אז נאספה את זרימת הדרך ומוכתמת שוב עם נוגדן אנטי VSG שכותרתו fluorophore לזהות מזהמים. כימות מושגת על ידי הוספת מספר מוגדר של חרוזי ספירה מוחלטים לטעום כל כך שהיחס של חרוזי תאים ניתן לקבוע והשתמש לכמת את מספר הבוררים באוכלוסייה 7.

<table><tbody><tr><td>נוגדן נגד VSG ללא תווית</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>נוגדן VSG מיוצר בבית</td></tr><tr><td>פלואורופור עם תווית נוגדן נגד VSG</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>נוגדן VSG מיוצר בבית</td></tr><tr><td>HMI-9 מדיה</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 מיוצר בבית</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright חרוזי ספירה מוחלטת</td><td>Thermofisher מדעי</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LD</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>מגנט MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS מפריד מגנטי</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>מתאם מערבולת-60</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>קולטר</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח ציטומטר זרימה</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור של<em&gt; trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין surface variant ידי מגנטי activated cell מיון cytometry זרימה

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, טפיל פרוטוזואי הגורם לטריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי וחייתי (הידוע כמחלת שינה ונאגנה, בהתאמה) בין וקטור הצה צה לפונדקאי יונקים. הוא מתחמק ממערכת החיסון המארח של היונקים על ידי החלפה מעת לעת של גליקופרוטאין פני השטח הצפוף והמשתנה (VSG) המכסה את פני השטח שלו. זיהוי שונות אנטיגנית ב-Trypanosoma brucei יכול להיות מסורבל ואינטנסיבי כאחד. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות מספר הטפילים ש'התחלפו' כדי לבטא VSG חדש באוכלוסייה נתונה. הטפילים מוכתמים תחילה בנוגדנים כנגד ה-VSG ההתחלתי, ולאחר מכן מוכתמים בנוגדנים משניים המחוברים לחרוז מגנטי. טפילים המבטאים את ה-VSG ההתחלתי מופרדים משאר האוכלוסייה על ידי העברת הטפילים על עמודה המחוברת למגנט. טפילים המבטאים את ה-VSG הדומיננטי המתחיל נשמרים על העמודה, בעוד שהזרימה מכילה טפילים המבטאים VSG חדש כמו גם כמה מזהמים המבטאים את ה-VSG ההתחלתי. אוכלוסיית זרימה זו מוכתמת שוב בנוגדנים המסומנים פלואורסצנטית כנגד ה-VSG ההתחלתי לסימון מזהמים, ופרופידיום יודיד (PI), המסמן תאים מתים. מספר ידוע של חרוזי ספירה מוחלטים הנראים על ידי זרימה ציטומטרית מתווספים לאוכלוסיית הזרימה. לאחר מכן ניתן להשתמש ביחס החרוזים למספר התאים שנאספו כדי להעריך את מספר התאים בדגימה כולה. ציטומטריית זרימה משמשת לכימות אוכלוסיית המתגים על ידי ספירת מספר התאים השליליים של PI שאינם מכתימים באופן חיובי עבור ה-VSG ההתחלתי והדומיננטי. לאחר מכן ניתן לחשב את שיעור המתגים באוכלוסייה באמצעות נתוני ציטומטריית הזרימה.

השיטה המתוארת כאן שמשה על מנת להוכיח כי הפסקות פעמי גדיל בתוך אתר ביטוי VSG הגדיל את מספר בוררים באוכלוסייה 8. כאן, אנו מציגים תוצאות נציגים מתוך אוכלוסייה של trypanosomes זה היה יכול להיגרם באופן דומה כדי ליצור הפסקה פעמי גדיל באתר הביטוי. אנו משווים trypanosomes אלה לאלה שלא היה מושרה ליצור הפסקה פעמי גדיל. איור 1 מציג את זרימת נציג cytometry מגרש מתאי un-induced המושרים שנאספו הזרימה דרך מעמודת מיון התא המגנטית מופעל....

טריפנוזומים אפריקאים הגדלים במבחנה עוברים שונות אנטיגנית בשיעור נמוך, כך שאוכלוסיות מורכבות מטפילים המבטאים סוג גליקופרוטאין פני שטח דומיננטי (VSG) ואוכלוסייה קטנה של וריאנטים "מתחלפים". פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לאיתור וכימות אוכלוסיות אלה.

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לבודד טריפנוסומות המבטאות וריאנט מסוים של גליקופרוטאין שטח (variant surface glycoprotein או VSG) משאר האוכלוסייה, ולזהות טפילים שביצעו מעבר מה-VSG הדומיננטי ההתחלתי לכל VSG אחר. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של הטריפנוסומה, כגון מהם הגורמים או האירועים המשפיעים על החלפת VSG באוכלוסיית טפילים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה יותר משיטות שפורסמו בעבר ומאפשרת כימות קל של תאים שביצעו מעבר לעומת תאים שלא ביצעו מעבר.כאשר המעבדה החלה לעבוד לראשונה על וריאציה אנטיגנית, הבעיה הראשונה הייתה כיצד לזהות תאים נדירים שעברו החלפה (switchers). בעיה מסוג זה נפתרה למעשה באימונולוגיה לפני מספר שנים, באמצעות שימוש במיון תאים מופעל מגנטית (magnetic-activated cell sorting) להעשרת תאים שהיו שליליים לתכונה מסוימת. התאמת תהליך אי-בחירה זה למחקר על וריאציה אנטיגנית נראתה כרעיון מבטיח מאוד.כדי להתחיל, יש לגדל טריפנוסומות מזרם הדם מזן Lister 427 לצפיפות של 0.5 עד 100,000 למילליטר. העבירו מנה של 50 × 10⁶ תאים למבחנה של 15 מילליטר ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה. שמרו 1 × 10⁶ תאים ותרבית לשימוש מאוחר יותר כביקורות חיוביות ושליליות לנוגדנים.שאבו בעזרת פיפט את רוב הנוזל העליון, כך שיישארו בערך 750 µL במבחנה. העבירו את התאים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 1.5 mL. לבסוף, סובבו את התאים בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C למשך ארבע דקות ב-2800 ×g.לאחר מכן, העבירו באמצעות פיפט את כל העילאי. השעיקו שוב את התאים ב-150 µL של מצע תרבית, בתוספת נוגדן ראשוני נגד גליקופרוטאין שטח של וריאנט (anti variant surface glycoprotein) או anti VSG בדילול המתאים. לאחר מכן, ערבבו את התאים במערבל Vortex בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.שטפו עם 800 עד 1000 µL של מצע תרבית קר. סנטריפוגו את התאים בטמפרטורה של 4 °C למשך ארבע דקות ב-5200 ×g. לאחר שאיבת הנוזל העליון (supernatant), שטפו את התאים עם 1 mL של מצע תרבית וסנטריפוגו שוב.הסיר את הנוזל העליון ותלה את המשקע ב-100 microliters של מצע תרבית. הוסף 110 microliters של חרוזי מיקרו למיון תאים מופעל מגנטית (magnetic-activated cell sorting microbeads) מהסוג המתאים לנוגדן הראשוני. ערבב היטב באמצעות פיפטינג למעלה ולמטה ולאחר מכן בצע וורטקס.בזמן ערבוב התאים במערבל (vortex), הכינו עמודת הפרדה המופעלת מגנטית. מקמו מבחנה של 15 milliliters תחתיה כדי לאסוף את מדיום ההכשרה. הוסיפו שני milliliters של מדיום תרבית להכשרת העמודה.בשלב הבא, הוציאו את הדגימה מהוורטקס והוסיפו 800 עד 1000 µL של מצע גידול קר. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה ולאחר מכן הסירו את הנוזל העליון (supernatant) כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים. שטפו את התאים שהשקיעו ב-1 mL של מצע גידול וסובבו שוב בצנטריפוגה.בשלב זה שאבו את הנוזל העליון אך השאירו 100 µL בשפופרת. נערו את שפופרת הצנטריפוגה בעוצמה עד להשעיה מלאה של המשקע. הוסיפו 1 mL של מצע גידול ובצעו פיפוט הלוך ושוב כדי להשעות את התאים באופן מלא.הסר את הפועל הקוני בנפח 15 מילימטר ששימש לאיסוף מדיום ההכנה והחלף אותו בפועל קוני חדש בנפח 15 מיליליטר לאיסוף השאיפה (flow-through) המכילה את הטפילים שהוחלפו. העבר את תרחיף התאים לעמודה שהוכשירה. אסוף את השאיפה לשפופרה בנפח 15 מיליליטר שמתחתיה, פעולה שלרוב אורכת שש עד שבע דקות עבור 1 מיליליטר של מדיום בתוספת trypanosomes.בשלב הבא, שטפו את העמודה פעמיים עם 1 ml של מצע גידול ואספו את הנוזל שעבר (flow-through) לאותה מבחנה. חלקו את הנוזל שעבר, שסך כולו צריך להיות כ-3 ml, לשתי מבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 ml. לאחר מכן, הניחו את המבחנות על קרח.הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע גידול לעמודה והכניסו את העמודה לתוך מבחנת צנטריפוגה של 15 מיליליטר. פעולה זו תגרום להשגת התאים המבטאים את ה-VSG הדומיננטי ההתחלתי. הוציאו 300 מיקרוליטר מהחומר שנשטף ושמרו אותו על קרח; ניתן להשליך את השאר.כדי ליצור בקרת חיובית, העבירו כ-100,000 תאים מתרבית התאים ההתחלתית אל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה. חזרו על פעולה זו כדי ליצור בקרת שלילית. סנטריפוגו את דגימות הזרימה (flow-through) ואת דגימת הבקרה החיובית.לאחר מכן, הסירו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). השעיקו מחדש את תאי ביקורת החיוביות ב-100 Microlitres של מצע גידול עם נוגדן anti VSG ראשוני המסומן בפלואורופור בדילול המתאים. לאחר מכן, השעיקו מחדש משקע אחד מהמעבר (flow-through pellet) ב-100 microliters של מצע גידול עם נוגדן anti VSG ראשוני המסומן בפלואורופור בדילול המתאים.השתמשו בתמיחת השביעה כדי להשעות מחדש את המשקע במבחנת המעבר השנייה, כך שיתקבלו כל הדגימות במבחנה אחת. ערבבו היטב באמצעות פיפטינג (שאיבה ושחרור). ערבבו את התאים ב-Vortex ולאחר מכן הוסיפו 800 עד 1000 microliters של מצע גידול קר.סבבו את הדגימות בצנטריפוגה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות ב-5200 ×g, ולאחר מכן השליכו את הנוזל העליון כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים. שטפו את התאים ב-1 ml של מצע תרבית, ולאחר מכן סבבו את התאים בצנטריפוגה. הבקרות החיוביות והשליליות ואת התאים שเอולוטו (eluted) שנשמרו קודם לכן על קרח.שפכו את הנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו 148.5 µL של מצע תרבית לדגימות. לאחר מכן, הוסיפו 25 µL של חרוזי ספירה מוחלטת, ולאחריהם 1.5 µL של תמיסת צביעה ב-Propidium Iodide.יש להמיס מחדש את משקעי בקרת החיובי והשלילי ב-175 microliters של מצע גידול. כעת ניתן להריץ את הדגימות במכשיר הסייטומטר הזורם (flow cytometer). תרשימי הסייטומטריה הזורמת אלו מראים תוצאות של הפרדת תאים מאוכלוסיות של trypanosomes שהונחו ליצור שבירה של DNA בדו-גדיל לעומת תאים שלא הונחו.הפאנלים השמאליים מציגים את הפיזור הקדמי (forward scatter) מול הפיזור הצדי (side scatter), המאפשרים להבחין בין תאים חיים לתאים מתים ובין חרוזיים שהתווספו לדגימה. ניתן להגדיר שערים (gates) הקובעים זאת על סמך מאפייני הפיזור. הפאנלים הימניים מציגים רק את אותם תאים שסווגו כחיים על סמך שערי הפיזור שהוגדרו בפאנלים השמאליים.ה-VSG השולט בתחילת התהליך במקרה זה היה VSG two. תאים שנספחים באופן חיובי ל-Propidium Iodide הם תאים מתים. אלו נראים באזורי Q one ו-Q two של הגרף.תאים שסומנו באופן חיובי עבור ה-VSG הדומיננטי ובאופן שלילי עבור PI נופלים לאזור Q שלוש והם מהוים זיהומים. לבסוף, תאים ב-Q ארבע הם תאים חיים שסומנו באופן שלילי עבור ה-VSG הדומיננטי, והם נחשבים כמעבירי ביטוי (switchers). גרף זה מציג את תדרי switching הנצפים שחושבו עבור אוכלוסיות של trypanosomes עם מול בלי שברים מושריים.רמת ההחלפה הסטוכסטית in vitro נמוכה למדי. בעוד שהשראת שבירה מובילה למספר רב יותר של תאים המבצעים החלפה ל-VSG שאינו הדומיננטי. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בערך תוך שלוש שעות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על הדגימות קרות לאורך כל התהליך ולהשHיח (resuspend) את המשקעים בצורה מספקת, במיוחד לפני הבידוד בעמודה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ריצוף RNA, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל אילו VSGs מובעים באוכלוסייה שעברה החלפה (switch population). שיטה זו משמשת בדרך כלל למדידת החלפת VSG, אך ניתן להשתמש בה גם לבידוד ולכימות של טפילים המבטאים כל חלבון שטח רצוי.

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מערכת מגנטית אפנון biosensing מנוצל במהירות, ברגישות פשוט לזהות מבחני ביולוגיים, כגון מולקולות דנ"א וחלבונים.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם...

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

פולש טפיל המלריה והמשכפל בתוך תאי דם אדומים. ההערכה מדויקת של פלישת merozoite וparasitemia לכן חיונית בהערכה במהלך הידבקות במלריה. כאן אנו מתארים זרימה cytometry פרוטוקול מבוסס למדידת הפרמטרים הללו במודל עכבר של מלריה.

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

כתב יד זה מתאר את השימוש בזן ביולומינסנט של טריפנוזומים אפריקאים כדי לאפשר מעקב אחר זיהום בשלב מאוחר ומדגים כיצד ניתן להשתמש בהדמיה חיה in vivo כדי להמחיש זיהומים בתוך מערכת העצבים המרכזית בזמן אמת.

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

הוספת תג לחלבון היא דרך רבת עוצמה לקבל תובנה לגבי תפקודו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתיוג אנדוגני של מאות חלבוני Trypanosoma brucei במקביל כך שניתן להשיג תיוג בקנה מידה גנומי.

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים אנטיגנים על פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו סומנו בנוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שהתקבלו הופרדו בשדה מגנטי גבוה ונותחו באמצעות ציטומטרים זרימה קונבנציונליים המופעלים על פלואורסצנטיות.

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

שיטה זו של הפרדה trypanosome הדם תלויה שלהם תשלום משטח שלילי פחות מאשר בתרבית של תאי דם. דם נגוע להציב, שטופלו על עמודת מחליף אניון. שיטה זו, הכי מתאים אבחון של מחלת השינה, מספקת טפילים מטוהרים לחקירות חיסוניות, ביולוגיים, ביוכימיים, פרמצבטיקה וביולוגיה מולקולרית.

טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

שאיפה מחט פיין היא טכניקה, לפיו התאים מתקבלים מפצע או איבר באמצעות מחט דקה. חומר מנושפי מרוח, מוכתם ונבדק תחת מיקרוסקופ לאבחון או משמש לביולוגיה מולקולרית, לצילנסה או לניתוח מבחנה. הוא זול, פשוט, מהיר וגורם לטראומה מינימלית.

איתור של Extravascular טריאנוסומה טפילים על ידי שאיפה מחט פיין

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

טפילי דם רפואיים ברחבי העולם נבדקו באופן אוטומטי באמצעות צעדים פשוטים על פלטפורמת AI עם קידוד מועט. האבחנה הפרוספקטיבית של שכבות דם שופרה על ידי שימוש בשיטת זיהוי וסיווג אובייקטים במודל היברידי של למידה עמוקה. שיתוף הפעולה של ניטור פעיל ומודלים מאומנים היטב מסייע לזהות נקודות חמות של העברת טריפנוזומים.

זיהוי אוטומטי מעולה של טפילי טריפנוזום באמצעות מודל היברידי של למידה עמוקה

אנו מתארים שיטה לחקור כיצד pH מגיב לרמזים סביבתיים בגליקוזיומים של צורת זרם הדם של טריפנוזומים אפריקאים. גישה זו כוללת חיישן חלבון תורשתי רגיש ל- pH בשילוב עם ציטומטריית זרימה למדידת דינמיקת pH, הן כבדיקת מסלול זמן והן בפורמט מסך בתפוקה גבוהה.

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי

למד שיטה מהירה לבידוד טריפנוזומות המבטאות גליקופרוטאיני משטח משתנים (VSG) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מתגים נדירים וחקר שונות אנטיגנית בטפילים.

איתור של

גלה סרטונים נוספים