איתור של Trypanosoma brucei מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד טריפנוזומים המבטאים גליקופרוטאין משטח מסוים או VSG משאר האוכלוסייה ולזהות טפילים שעברו מ-VSG הדומיננטי ההתחלתי לכל VSG אחר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של טריפנוזום, כגון, מהם הגורמים או האירועים המשפיעים על מעבר VSG באוכלוסיית טפילים. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהיא מהירה יותר משיטות שפורסמו בעבר ומאפשרת כימות קל של מעבר לתאים שאינם מתגים.

כשהמעבדה החלה לעבוד לראשונה על וריאציה אנטיגנית, הבעיה הראשונה הייתה כיצד לזהות מתגים נדירים. בעיה מסוג זה נפתרה למעשה באימונולוגיה לפני מספר שנים, באמצעות שימוש במיון תאים המופעל על ידי מגנטים כדי להעשיר תאים שהיו שליליים לתכונה מסוימת. הסבת תהליך אי-ברירה לשונות אנטיגנית נראתה כמו רעיון מבטיח באמת.

כדי להתחיל, יש לגדל טריפנוזומים מזרם הדם של Lister 427 לצפיפות של 0.5 עד 100,000 למיליליטר. יש לצרף 50 כפול 10 לדגימת שישה תאים לתוך צינור של 15 מיליליטר ולאחר מכן צנטריפוגה. שמור פעם אחת 10 עד ששת התאים ותרבית שתשמש מאוחר יותר כבקרת נוגדנים חיוביים ושליליים.

פיפטה מרוב הסופרנטנט ומשאירה בערך 750 מיקרוליטר בשפופרת. העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לבסוף, צנטריפוגה את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות ב-2800 פעמים גרם.

ואז פיפטה את כל הסופרנטנט. השעיה מחדש של תאים ב-150 מיקרוליטר של מדיום תרבית, בתוספת נוגדן גליקופרוטאין ראשוני נגד וריאנט או אנטי VSG בדילול המתאים. לאחר מכן, מערבול את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

שוטפים עם 800 עד 1000 מיקרוליטר של מדיום תרבית קרה. צנטריפוגה של התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות ב 5200 פעמים גרם. לאחר שאיבת הסופרנטנט, יש לשטוף את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבית וצנטריפוגה שוב.

הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של מדיום תרבית. הוסף 110 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי מיון תאים מופעלים מגנטית מהסוג המתאים לנוגדנים הראשוניים. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ואז מערבולת.

בזמן שהתאים מערבולים, הגדר עמודת הפרדה המופעלת על ידי מגנטית. הנח צינור של 15 מיליליטר מתחתיו כדי לאסוף את מדיום ההתחלה. הוסף שני מיליליטר של מדיום תרבית כדי לטשטש את העמודה.

לאחר מכן, הסר את הדגימה מהמערבולת והוסף 800 עד 1000 מיקרוליטר של מדיום תרבית קרה. צנטריפוגה את הדגימה ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט כדי להסיר נוגדן לא קשור. שוטפים שוב את התאים הגלולים במיליליטר אחד של מדיום תרבית וצנטריפוגה.

הפעם שאפו את הסופרנטנט אך השאירו 100 מיקרוליטר בצינור. החלק את צינור הצנטריפוגה במרץ עד שהכדור מושעה במלואו. הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית ופיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות את התאים במלואם.

הסר את הצינור החרוטי בגודל 15 מילימטר המשמש לאיסוף מדיום ההתחלה והחלף אותו בחרוט חדש של 15 מיליליטר כדי לאסוף את הזרימה המכילה את הטפילים המוחלפים. החל את מתלה התא על העמודה המוכנה. אסוף את הזרימה בצינור של 15 מיליליטר שמתחתיו לוקח בדרך כלל שש עד שבע דקות עבור מיליליטר אחד של מדיום פלוס טריפנוזומים.

לאחר מכן, שטפו את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות ואספו את הזרימה באותו צינור. חלקו את הזרימה שאמורה להסתכם בערך בשלושה מיליליטר לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הניחו את הצינורות על קרח.

הוסף שלושה מיליליטר של מדיום תרבות לעמוד וצלל את העמוד לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. זה ישיג את התאים המבטאים את ה- VSG הדומיננטי ההתחלתי. הסר 300 מיקרוליטר מהחומר המופרך הזה ושמור אותו על קרח, את השאר ניתן להשליך.

כדי ליצור בקרה חיובית, קח כ-100,000 תאים מהתרבית ההתחלתית של התאים והכניס אותם לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. חזור על פעולה זו כדי ליצור פקד שלילי. צנטריפוגה דגימות הזרימה ודגימת בקרה חיובית.

ואז הסר והשליך את הסופרנטנט. השעו מחדש את תאי הבקרה החיוביים ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית עם נוגדן ראשוני נגד VSG המסומן בפלואורופור בדילול המתאים. לאחר מכן, השעו כדור זרימה אחד ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית עם נוגדן ראשוני נגד VSG המסומן בפלואורופור בדילול המתאים.

השתמש במתלה כדי להשעות מחדש את הגלולה בצינור הזרימה השני וכתוצאה מכך צינור בריכה אחד. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. מערבל את התאים ואז הוסף 800 עד 1000 מיקרוליטר של מדיום תרבית קרה.

צנטריפוגה של הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות ב-5200 פעמים גרם ולאחר מכן השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר כל נוגדן לא קשור. שוטפים את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבית, ואז צנטריפוגה את התאים. הבקרות החיוביות והשליליות והתאים המנומקים שאוחסנו בעבר על קרח.

השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 148.5 מיקרוליטר של מדיום תרבית לדגימות. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של חרוזי ספירה מוחלטת, ואחריהם 1.5 מיקרוליטר של תמיסת צביעה של פרופידיום יודיד.

השעו מחדש את כדורי הבקרה החיוביים והשליליים עם 175 מיקרוליטר של מדיום תרבית. כעת ניתן להפעיל דגימות על ציטומטר הזרימה. עלילות ציטומטריית זרימה אלה, מראות תוצאות של הפרדת תאים מאוכלוסיות של טריפנוזומים המושרים ליצירת שבירת DNA דו-גדילית לעומת תאים לא מושרים.

הפאנלים השמאליים מראים את הפיזור קדימה לעומת הצד, המאפשר הבהרה של התאים החיים לעומת המתים והחרוזים שנוספו לדגימה. לאחר מכן ניתן ליצור שערים הקובעים אותם על סמך מאפייני הפיזור. הלוחות הימניים מציגים רק את התאים שניתן לסווג כחיים על סמך שערי הפיזור שנוצרו בפאנלים השמאליים.

ה-VSG ההתחלתי הדומיננטי במקרה זה היה VSG 2. תאים שנצבעו באופן חיובי עבור Propidium Iodide הם תאים מתים. ואלה נראים באזורי Q 1 ו-Q 2 של העלילה.

תאים שמכתימים באופן חיובי עבור ה-VSG הדומיננטי ושלילי עבור PI נופלים לאזור Q 3 והם מזהמים. לבסוף, תאים ב-Q 4 הם תאים חיים שמכתימים באופן שלילי עבור ה-VSG הדומיננטי הנחשבים למחליפים. תרשים זה מציג את תדירות המיתוג המחושבת שנצפתה של אוכלוסיות הטריפנוזומים עם לעומת ללא הפסקות מושרות.

רמת המיתוג הסטוכסטי במבחנה נמוכה למדי. בעוד שגרימת הפסקה מביאה ליותר תאים באופן משמעותי, מעבר ל-VSG הלא דומיננטי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשלוש שעות.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על דגימות קרות לאורך כל הדרך ולהשעות את הכדורים כראוי במיוחד לפני הבידוד על העמוד. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו ריצוף RNA כדי לענות על שאלות נוספות כמו אילו VSGs באים לידי ביטוי באוכלוסיית מתגים. שיטה זו משמשת בדרך כלל למדידת מיתוג VSG, היא יכולה לשמש גם לבידוד וכימות של טפילים המבטאים כל חלבון פני השטח המעניין.