הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב AAVS1 לוקוס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע עריכת גנום ממוקדת מהירה ויעילה ב-AAVS1 של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, או PSCs אנושיים, תוך שימוש בגישת החלפת קלטות בתיווך רקומבינאז, או RMCE. RMCE משפר את החדרת המטרה של רצף ללוקוס AAVS1, שיש לו חשיבות רבה לביולוגיה של תאי גזע מכיוון שהוא מאפשר בדיקה מהירה על תפקוד המולקולה על ידי ביטוי יתר או נוקדאון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שקווי PSC אנושיים נקיים מאירועי אינטגרציה אקראיים, עדיין פלוריפוטנטיים וכאשר ניתן ליצור קריוטיפים נורמליים תוך 15 יום בלבד.

שיטה זו מספקת כלי שימושי לטרנסגנזה, בלוקוס AAVS1 אך ניתן ליישם אותה גם על מיקומים מתירניים אנושיים אחרים. כדי להתחיל, תרבית קווי תאי מאסטר PSC אנושיים תחת נהלים סטנדרטיים על או כיבוי פיברובלסטים עובריים של עכברים או iMEFs, בשש צלחות באר. כאשר התאים מגיעים ל-60% עד 70% צלחת מפגש iMEFs עמידים לתרופות על ידי שימוש ראשון בתמיסת ג'לטין של 0.1% לציפוי הבארות הדרושות של צלחת 12 בארות ודגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, צלחו 125,000 iDR4s לבאר ודגרו על התרביות למשך הלילה עם מדיום iMEF. למחרת, דגירה מוקדמת של תרביות PSC אנושיות עם מדיום טרי כולל 10 מעכבי ROCK מיקרו-מולאריים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. בינתיים, הביאו את תמיסת טרנספקציית ESC אנושית ואת חומר הדיסוציאציה של התאים לטמפרטורת החדר.

הכן מיליליטר אחד של מדיום ציפוי נוקלאופקציה לכל מצב נוקלאופקציה. לאחר מכן, הסר את מדיום ה-iDR4 מהבארות, השתמש במיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את התאים ולהוסיף מדיום ציפוי נוקלאופציה. מעבירים 500 מיקרוליטר לדגימה של צינורות ציפוי בינוניים עד סטריליים של 1.5 מיליליטר ומאחסנים ב-37 מעלות צלזיוס עד לציפוי.

כדי לנתק את ה-PSCs האנושיים בתרחיף תא בודד, הסר את המדיום, השתמש ב-PBS בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את התאים והוסף מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין או אקוטאז על תרביות hPSC מזינות או ללא מזין, בהתאמה. דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר בזהירות את הצלחת מהאינקובטור ומבלי לאפשר לתאים להתנתק, שאב את חומר הדיסוציאציה והוסף 1 מיליליטר של מדיום PSC אנושי.

נתק את התאים הרופפים על ידי שטיפה עדינה של המדיום על פני הצלחת תוך הימנעות מהיווצרות קצף. אסוף את התאים בתרחיף תא בודד בצינור נקי וסטרילי של 15 או 50 מיליליטר. לאחר מכן השתמש במיליליטר אחד של מדיום hESC כדי לשטוף את התאים ולאסוף אותם באותו צינור.

קח 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לספירה וצנטריפוגה את התאים הנותרים ב -300 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. ספרו את התאים בעזרת מכשיר לספירת תאים בזמן שהמתלה עובר צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט והשתמש ב-PBS בטמפרטורת החדר כדי להשעות בעדינות את צבע התא ל-10 עד התא השישי למיליליטר.

לאחר מכן העבירו שני מיליליטר לכל מצב ניסוי לניקוי צינורות סטריליים של 15 מיליליטר וחזרו על הצנטריפוגה. בזמן שהדגימות מסתובבות, הכינו תערובות פלסמיד בשלוש שפופרות נקיות של 1.5 מיליליטר עם יחסים מולקולריים של 0:1, 2:1 ו-2:0 של תורם באמצעות 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד פליפאז. כדי להמשיך בנוקלאופקציה, הסר את צלחת ה-iDR4 וצינור 1.5 מיליליטר עם מדיום ציפוי מהחממה.

צינור אחד בכל פעם, מבלי להפריע לגלולה, הסר בזהירות את ה-PBS, והסר כמה שיותר מהמאגר. השתמש ב-100 מיקרוליטר של תמיסת טרנספקציה כדי להשעות את הגלולה על ידי פיפטינג עדין. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לצינור 1.5 מיליליטר המכיל את תערובות הפלסמיד וערבבו בעדינות.

העבירו את תערובת ה- DNA של התאים לקובט הטרנפקטור, תוך שימת לב לא להכניס בועות. הכנס את הקובט למכשיר הגרעין והפעל את תוכנית A13 לתאים שגודלו על מזינים או F16 להעברה ללא מזין. הסר את הקובט והשתמש בפיפטות ההעברה החד פעמיות בערכה כדי להוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום ציפוי בקובט בעדינות, אך במהירות ובתנועה אחת.

לאחר מכן, החזר את הנפח באותו אופן וצלחת אותו בצורה טיפתית בצלחת 12 הבארות המכילה את ה-iDR4 ומדיום הציפוי. הניחו את צלחת התרבות על מדף בחממה והזיזו אותה לאט קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר באופן שווה את מתלה התאים. דגרו את המנה למשך 24 שעות לפני החלפת המדיום.

יומיים-שלושה לאחר הטרנספקציה, התחל את הבחירה. שאפו את המדיום, השתמשו ב-1 מיליליטר של PBS כדי לשטוף את התאים, ולאחר מכן הוסיפו מדיום ESC אנושי עם 100 ננוגרם למיליליטר פורומיצין. התבונן בצמיחת התאים והגדל את ריכוז הפורומיצין בהתאם עד למקסימום של 250 ננוגרם למיליליטר, והמשך בחירת הפורומיצין במשך שבעה ימים.

לאחר שלושה עד ארבעה ימים בבחירת פורומיצין, התחל את הבחירה עם 0.5 מיקרו-מולרי פיאלורידין או FIAU. החלף את המדיום מדי יום ושמור על FIAU לא יותר משבעה ימים רצופים. לאחר השלמת הסלקציה, בסביבות הימים 14 עד 15, מושבות RMCE עמידות יהיו נוכחות ויהוו את קו ה-RMCE החדש.

פצל את התאים ביחס של 1:2 בהתאם להליכים סטנדרטיים. כאשר הבארות ממפתח 1 מוכנות לפיצול, נתק את הבאר לאפיון לתרחיף תא בודד כפי שתואר קודם לכן בסרטון ואסוף את התאים בצינור של 15 מיליליטר. סובב את התאים ב -300 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, השתמש במיליליטר אחד של PBS כדי להשעות מחדש את התאים ולפצל את הדגימה לשניים. האחד סונן באמצעות מסננת תאים לביצוע ציטומטריית זרימה והשני לניתוח DNA על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר טרנספקציה עם רקומבינאז flippase ותורם tdT RMCE, hPSCs יצרו קבוצות קטנות של תאים המפוזרים באופן שווה על פני שכבת iDR4 MEF וביטאו GFP מכונן ו-tdT חולף.

בחירה חיובית באמצעות פורומיצין מעדיפה הכנסת תורם RMCE ואז בחירה שלילית באמצעות FIAU בוחרת רק עבור אירועי רקומבינציה בתיווך FRT חסרי TK. בסביבות היום השישי לאחר הטרנספקציה, ניתן לזהות אשכולות קטנים של תאים שליליים ל-RMCE GFP וחיוביים ל-tdT. כפי שהודגם כאן, מושבות RMCE שליליות ל-GFP וחיוביות ל-tdT קיימות רק כאשר משתמשים גם בתורם RMCE וגם ב-flippase בעוד ש-RMCE אינו מתרחש בהיעדר flippase. אפיון ציטומטריית זרימה של קווי RMCE החדשים שנוצרו, שהם מושבות RMCE עמידות לפורומיצין ו-FIAU, המשולבות באוכלוסיית תאים לא משובטים מאשר כי 100% מהתאים מייצגים את הפנוטיפ השלילי ל-RMCE GFP וחיובי ל-tdT.

כאשר משתמשים בתורמי RMCE ללא פעילות מקליט ב-hPSC, 100% מהתאים שליליים ל-GFP. אפיון PCR המוצג כאן של קו RMCE הלא משובט, מדגים את חילופי הקסטות המלאים וכי תוכנית הבחירה המשמשת מייצרת קווים אקראיים ללא אינטגרציה, הן של תורם RMCE והן של וקטור הביטוי flippase. לסיכום, שיטת RMCE זו מפשטת באופן משמעותי את עריכת הגנים ב-hPSCs עבור לוקוס מוגדר בהשוואה לנוקלאזות ממוקדות.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 15 יום. לכן, RMCE הוא כלי מהיר מאוד לעריכת גנים שיאפשר מחקרים השוואתיים בסביבה איזוגנית. בעת שימוש בהליך זה, חשוב שיעילות ההעברה תהיה גבוהה מ-30% וליצור סוכן בחירת אחסון ליבה מתאים.

לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לבצע RMCE בלוקוס AAVS1 של PSCs אנושיים וכיצד לאפיין את הקו הרקומבינציה.