הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע עריכה גנומית ממוקדת, מהירה ויעילה ב-AAVS1 של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, או human PSCs, באמצעות גישת flippase, Recombinase-mediated Cassette Exchange, או RMCE. שיטת RMCE משפרת את ההחדרה הממוקדת של רצף אל תוך לוקוס AAVS1, דבר בעל חשיבות רבה לביולוגיה של תאי גזע שכן הוא מאפשר בדיקה מהירה של תפקוד מולקולה באמצעות ביטוי יתר (overexpression) או השתקה (knockdown). היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן ליצור קווי תאי human PSC נקיים מאירועי אינטגרציה אקראיים, שעדיין הינם פלוריפוטנטיים ובעלי קריוטיפ תקין, בתוך 15 ימים בלבד.

שיטה זו מספקת כלי יעיל לטרנסגנזה בלוכוס AAVS1, אך ניתן להחילה גם על לוכוסים תאי-אנושיים חדירים אחרים. לתחילת הדברים, תרבתו קווי תאי מאסטר של PSC אנושיים לפי נהלים סטנדרטיים, עם או ללא פיברובלסטים עובריים של עכברים שעברו אינאקטיבציה (iMEFs), בלוחיות בעלות שישה בארות. כאשר התאים מגיעים ל-60% עד 70% התמסרות (confluency), זרעו iMEFs עמידים לתרופות על ידי שימוש ראשוני בתמיסת ג'לטין 0.1% לציפוי הבארות הדרושות בלוחית בעלת 12 בארות, והדגירו את הלוחית בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, זרעו 125,000 תאי iDR4 לכל באר והדגירו את התרביות למשך לילה במצע iMEF. למחרת, הדגירו מראש תרביות PSC אנושיות במצע טרי הכולל 10 micromolar ROCK Inhibitor בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת. בינתיים, הגעי את תמיסת הטרנספקציה של ESC אנושיים ואת חומר הפירוק התאי לטמפרטורת החדר.

הכינו מיליליטר אחד של מצע זריעה לנוקלאופקציה עבור כל תנאי נוקלאופקציה. לאחר מכן, הסירו את מצע ה-iDR4 מהבארות, השתמשו במיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את התאים והוסיפו מצע זריעה לנוקלאופקציה. העבירו 500 microliters של מצע זריעה לכל דגימה למבחנות סטריליות בנפח 1.5 milliliter ואחסנו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד לזריעה.

כדי לנתק את תאי ה-PSCs האנושיים לתליה של תאים בודדים, יש להסיר את המצע, להשתמש ב-PBS בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את התאים ולהוסיף מיליליטר אחד של 0.05%Trypsin או Accutase לתרביות hPSC על תאי מאכיל (feeder) או ללא תאי מאכיל (feeder-free), בהתאמה. יש לדגור את התרביות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הוצא בזהירות את הפיתה מהמדגור ובלי לאפשר לתאים להתנתק, שאב את חומר הפירוק והוסף 1 מיליליטר של מצע hPSC אנושי.

נתקו את התאים הרפועים באמצעות שטיפה עדינה של המצע על פני השטח של הפיתח, תוך הימנעות מיצירת קצף. אספו את התאים לסספנסיות תאים בודדים בתוך מבחנה נקייה וסטרילית של 15 או 50 מיליליטר. לאחר מכן, השתמשו ב-1 מיליליטר של מצע hESC כדי לשטוף את התאים ואספו אותם לאותה המבחנה.

קחו מנה (aliquot) של 50 µL מת сусפנסיית התאים לצורך ספירה, וסובבו במערך צנטריפוגה את שאר התאים ב-300 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. ספרו את התאים באמצעות מכשיר לספירת תאים בזמן שסספנסיה עוברת צנטריפוגה. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והשתמשו ב-PBS בטמפרטורת החדר כדי לערבב מחדש בעדינות את התאים עד לריכוז של 10⁶ תאים למילליטר.

לאחר מכן, העבירו שני מיליליטרים עבור כל תנאי ניסוי למבחנות סטריליות ונקיות של 15 מיליליטר וחזרו על הסנטריפוגציה. בזמן שהדגימות מסובבות, הכינו תערובות פלסמיד בשלוש מבחנות נקיות של 1.5 מיליליטר ביחסים מולקולריים של 0:1, 2:1 ו-2:0 של donor flippase, תוך שימוש ב-2.5 מיקרוגרם של פלסמיד flippase. כדי להמשיך בנוקלאפקציה, הוציאו מהאינקובטור את פלטת ה-iDR4 ואת מבחנת ה-1.5 מיליליטר המכילה את מצע הזריעה.

שאבו בזהירות את ה-PBS מכל מבחנה בנפרד, ללא הפרעה למשקע, והסירו כמה שיותר מהבופר. השתמשו ב-100 microliters של תמיסת טרנספקציה כדי לסספנד מחדש את המשקע על ידי פיפטור עדין. לאחר מכן, העבירו את סספנדת התאים למבחנה של 1.5 milliliter המכילה את תערובות הפלסמידים וערבבו בעדינות.

העבירו את תערובת ה-DNA של התאים לקוובט (cuvette) של הטרנספקטור, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות. הכניסו את הקוובט למכשיר הנוקליאופקטור והפעילו את תוכנית A13 לתאים שגודלו על תאי מאכלה (feeders) או תוכנית F16 לטרנספקציה ללא תאי מאכלה. הוציאו את הקוובט והשתמשו בפיפטות ההעברה החד-פעמיות שבערכה כדי להוסיף בעדינות, אך במהירות ובבתנועה אחת, 0.5 milliliters של מצע זריעה לקוובט.

לאחר מכן, השב את הנפח באותו האופן ופזר אותו בטפטוף לתוך פלטת 12 באריים המכילה iDR4 ומצע זריעה. הנח את צלחת התרבית על מדף באינקובטור והזז אותה לאט קדימה ואחורה ומצד לצד כדי להפיץ את תרחיף התאים באופן אחיד. דגור את הצלחת למשך 24 שעות לפני החלפת המצע.

יומיים עד שלושה ימים לאחר הטרנספקציה, התחילו את תהליך הסלקציה. שאבו את המדיום, השתמשו ב-1 milliliter של PBS לשטיפת התאים, ולאחר מכן הוסיפו מדיום ESC אנושי עם 100 nanograms per milliliter של puromycin. עקבו אחר גדילת התאים והעלו את ריכוז ה-puromycin בהתאם, עד למקסימום של 250 nanograms per milliliter, והמשיכו בסלקציית ה-puromycin במשך שבעה ימים.

לאחר שלושה עד ארבעה ימי סלקציה באמצעות puromycin, התחילו סלקציה עם 0.5 micromolar של fialuridine או FIAU. החליפו את המצע מדי יום ושמרו על FIAU למשך לא יותר משבעה ימים רצופים. לאחר השלמת הסלקציה, סביב ימים 14 עד 15, יופיעו מושבות RMCE עמידות אשר יהוו את קו ה-RMCE החדש.

פצלו את התאים ביחס של 1:2 בהתאם לנהלים הסטנדרטיים. כאשר הבארים מ-Key 1 מוכנות לפיצול, הפרידו את הבאר המיועדת לאפיון לתליה של תאים בודדים (single cell suspension) כפי שתואר קודם לכן בסרטון, ואספו את התאים לשפופרת של 15 milliliter. סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, השתמש ב-1 mL של PBS כדי להשעות מחדש את התאים וחלק את הדגימה לשניים. חלק אחד סונן באמצעות מסנן תאים לצורך ביצוע ציטומטריה זרימה, והחלק השני נועד לניתוח DNA בהתאם לפרוטוקול הכתוב. בעקבות טרנספקציה עם flippase recombinase ועם תורם tdT RMCE, ה-hPSCs יצרו קבוצות קטנות של תאים שהתפזרו באופן אחיד על פני שכבת iDR4 MEF והביעו GFP קונסטיטוטיבי ו-tdT זמני.

סלקציה חיובית באמצעות puromycin מעדיפה השתחלה של תורם RMCE, ולאחר מכן סלקציה שלילית באמצעות FIAU בוחרת רק אירועי רקומבינציה המתווים על ידי FRT שחסר בהם TK. סביב היום השישי לאחר התעתוק, ניתן לזהות צבירים קטנים של תאים בעלי פנוטיפ RMCE GFP-negative ו-tdT-positive. כפי שמוצג כאן, מושבות RMCE בעלות פנוטיפ GFP-negative ו-tdT-positive נוכחות רק כאשר נעשה שימוש הן בתורם ה-RMCE והן ב-flippase, בעוד ש-RMCE אינו מתרחש בהיעדרו של flippase. אפיון באמצעות ציטומטריה של זרימה של קווי ה-RMCE שנוצרו זה עתה, שהם מושבות RMCE העמידות ל-puromycin ול-FIAU, אשר שולבו באוכלוסיית תאים לא-קלונלית, מאשר כי 100% מהתאים מייצגים את הפנוטיפ RMCE GFP-negative ו-tdT-positive.

כאשר נעשה שימוש בתורמי RMCE ללא פעילות מקליטה ב-hPSC, 100% מהתאים הם שליליים ל-GFP. אפיון ה-PCR המוצג כאן של קו ה-RMCE הבלתי-קלונלי, מדגים את החלפת הקסטה המלאה וכי תוכנית הברירה שנעשה בה שימוש מייצרת קווים ללא אינטגרציה אקראית, הן של תורם ה-RMCE והן של הווקטור המבטא flippase. לסיכום, שיטת RMCE זו מפשטת באופן משמעותי את עריכת הגנים ב-hPSCs עבור לוקוס מוגדר בהשוואה לנוקליאזות מכוונות.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה תוך 15 ימים. לפיכך, RMCE הוא כלי מהיר מאוד לעריכה גנטית המאפשר ביצוע מחקרים השוואתיים בסביבה איזוגנית. בעת שימוש בהליך זה, חשוב להשיג יעילות טרנספקציה הגבוהה מ-30% ולבצע ברירה מתאימה באמצעות סוכן ברירה מאגר מרכזי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע RMCE באתר AAVS1 של PSCs אנושיים וכיצד לאפיין את השורה הרקומיננטית.