גישה קלילה ויעילה לייצור ההפיך דיסולפיד צולב Micelles

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק פרוטוקול פשוט ויעיל לסינתזה של מיצלות צולבות דיסולפיד עמוסות בתרופות למתן תרופות ממוקדות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום הננו-רפואה. כגון כיצד לייצר ביעילות ננו-פורמולציות יציבות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לנו לסנתז בקלות מיצלות צולבות דיסולפיד בקנה מידה גדול, וזה רצוי ביותר למחקרים קליניים בחולים. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף שני גרם של פוליאתילן גליקול מונואמין עם סיומתיל לבקבוק תחתון עגול. הוסף עשרה מיליליטר DMF נטול מים כדי להמיס אותו.

מצננים על קרח. הוסף שלוש מקבילות של הידרוקסי בנזוטריאזול, שלוש מקבילות ל-DIC ושלוש מקבילות של ליזין מוגן di-eth-moc לבקבוק תחתון עגול. לאחר מכן, הוסף עשרה מיליליטר DMF נטול מים.

מערבבים את התערובת במשך 20 דקות על צלחת ערבוב מגנטית. לאחר מכן מוסיפים את התערובת לבקבוק התחתון העגול המכיל פוליאתילן גליקול עם סיומתיל מונומתיל. מוציאים את הבקבוק התחתון העגול מאמבט הקרח, ואז מערבבים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

לאחר השלמת הערבוב יש לאשר את השלמת התגובה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. הוסף 200 מיליליטר אתר קר כקרח לבקבוק התגובה. צנטריפוגה ב 6, 000 x גרם למשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד את הפולימר המשקע.

חזור על תהליך המשקעים והצנטריפוגה פעמיים, המס מחדש את המוצר ב-10 מיליליטר DMF בכל פעם לפני המשקעים. לאחר מכן שטפו את הפולימר שלוש פעמים עם אתר קר כקרח. חבר את הצינור למקור ואקום גבוה כדי להסיר את שאריות האתר.

לאחר מכן הוסף לפולימר 20 מיליליטר של 20%4-מתילפיפרידין ב-DMF. מערבבים עד להשלמת הפירוק. אפשרו לתגובה להיות מהנה במשך שלוש שעות.

לאחר אישור השלמת התגובה, יש לייבש את המוצר הפולימרי. כעת ביניים פולימריים מספר שתיים תחת ואקום, ולאחר מכן בצע שלבי סינתזה פולימרים נוספים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הפקת מספר ביניים פולימרי 10, העבירו אותו לבקבוק תגובה.

הוסף 30 מיליליטר DMF נטול מים. בבקבוק חדש ממיסים 24 מקבילות של חומצה כולית פעילה ב-20 מיליליטר DMF. לאחר מכן הוסף 48 מקבילות של N, N-Diisopropylethylamine.

מערבבים 10 דקות. לאחר סיום הערבוב מעבירים את התערובת לבקבוק התגובה המכיל פולימר ביניים מספר 10. אפשר לתגובה לרוץ בן לילה.

למחרת לאשר את השלמת התגובה ולזרז פולימר ביניים מספר 11, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן חייג את הביניים הפולימרי במים נטולי יונים. ליופיליזציה של הדגימה המניבה אבקה לבנה.

לאחר הכנת המיצלה ממיסים 20 מיליגרם טלודנדרמר וחמישה מיליגרם PTX במיליליטר אחד של כלורופורם. הסר את הממס באמצעות מאייד סיבובי לקבלת סרט פולימרי יבש הומוגני. הרכיבו מחדש את הסרט עם מיליליטר אחד של PBS על ידי מערבולת.

לאחר מכן סוניקציה למשך 30 דקות ב -40 קילו-הרץ. הוסף 3% מי חמצן כדי לחמצן את קבוצות התיול על הטלודנדרימר. בצע שלבי הכנה ואימות נוספים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר השלמת הכנת המיצלה יש למדוד את הגודל והתפלגות הגודל של המיצלות בעזרת מכשיר פיזור אור דינמי. בצע את המדידות בטמפרטורת החדר ושמור על ריכוז המיצלה על מיליגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן הכינו תמיסת מלאי של 7.5 מיליגרם למיליליטר של נתרן דודציל סולפט ב-PBS.

לאחר מכן הכינו תמיסת מלאי של 1.5 מיליגרם למיליליטר של מיסלים צולבים של דיסולפיד ב-PBS. באמצעות תמיסות מלאי אלה נוצרת תערובת שבה ריכוז ה-SDS הסופי הוא 2.5 מיליגרם למיליליטר. וריכוז המיצלה הוא 1.0 מיליגרם למיליליטר.

טען את הדגימה ומדוד את התפלגות הגודל והגודל של תמיסת המיצלה במרווחי זמן של שתי דקות. לאחר איסוף דם מצויט טרי מעכברים עירומים צנטריפוגה דגימת דם של מיליליטר אחד ב-1,000 x גרם למשך 10 דקות לאיסוף כדוריות דם אדומות. שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS ואז השעו מחדש את כדור התא עם PBS לריכוז סופי של 2% ערבבו 200 מיקרוליטר של תרחיף אריתרוציטים עם תמיסה של 1.0 מיליגרם למיליליטר של PTX NCMs.

לאחר מכן מערבבים 200 מיקרוליטר של תרחיף אריתרוציטים עם תמיסה של 1.0 מיליגרם למיליליטר של PTX DCM. דגרו את התערובות הללו בשייקר אינקובטור למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה היא צנטריפוגה מלאה התערובות ב -3, 000 x גרם למשך חמש דקות.

העבירו 100 מיקרוליטר מהסופרנטנט של כל דגימה לצלחת של 96 בארות. לאחר מכן השתמש בקורא מיקרו לוחות כדי למדוד את הספיגה של המוגלובין חופשי ב-540 ננומטר. כפי שנמדד על ידי מבחן אלמן, שיעור ההמרה מקבוצות תיול חופשי לקשרי דיסולפיד הגיע ל-85% לאחר 48 שעות של חמצון בתיווך חמצן.

כאן משתמשים בשיטת חמצון בתיווך מי חמצן כשיטה חלופית. יחס ההמרה מגיע ל-88% תוך 30 דקות. שהוא מהיר פי 96 מהגישה המתווכת בחמצן.

באמצעות גישה יעילה יותר זו נוצרו למעלה מ-50 גרם של ננו-חלקיקים עם גודל חלקיקים מדוד של 27 ננומטר עם התפלגות גודל צרה. היציבות של מיצלות צולבות טעונות PTX נחקרת גם בתנאי שיבוש מיצלה חמורים. גודל החלקיקים של המיצלות נשאר יציב לאורך זמן, מה שמצביע על כך שהן נשארו שלמות.

לאחר הכנסת GSH בריכוז תוך-תאי, גודל המיצלות הצולבות הטעונות בדיסולפיד נשאר שלם למשך 30 דקות, ואז ירד בפתאומיות לננומטר אחד. זה מסמל הפחתה של מספר קריטי של קשרי דיסולפיד, תנאי מוקדם להתנתקות מהירה של המיצלות. התוצאות המייצגות של הפעילות המוליטית של מיצלות טעונות PTX מוצגות כאן.

ל-PTX NCMs יש ספירת ליזה של תאי דם אדומים תלוית מינון. עם זאת, DCMs PTX שיש להם קישור צולב דיסולפיד אינם מראים פעילויות המוליטיות הניתנות לצפייה. לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע בטכניקה אחרת אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור להוסיף כמות שווה של 3% מי חמצן להיווצרות דיסולפיד. לאחר הליך זה ניתן לבצע בדיקת המוליזה על מנת להעריך את תאימות הדם של המיצלות הצולבות דיסולפיד. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז ביעילות מיצלות צולבות דיסולפיד עמוסות בתרופות.

אל תשכח שחלק מהכימיקלים הללו עלולים להיות מסוכנים ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.