סיקור הפעילות האנדוקרינית במים באמצעות מסחרי-זמין במבחנה Transactivation bioassays

המטרה הכוללת של הליך סטנדרטי זה היא לסנן דגימות מים לאיתור כימיקלים פעילים אנדוקריניים, באמצעות מבחני תאים מבוססי קולטנים זמינים מסחרית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ניטור איכות המים, כגון, האם כימיקלים פעילים אנדוקריניים אכן קיימים בדגימה? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לנתח עבור קבוצה של תרכובות פעילות אנדוקריניות הרבה יותר מהר מהשיטות הכימיות הנוכחיות.

טכניקה זו יכולה לסייע באבחון בעיות איכות מים הנובעות מנוכחות כימיקלים משבשים אנדוקריניים. שיטה זו מספקת תובנה לגבי מזהמים במים, אך ניתן ליישם אותה גם על מטריצות סביבתיות אחרות, כגון משקעים ורקמות. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להיאבק, מכיוון שהיא דורשת דיוק גבוה בעת שימוש בטכניקות פיפטינג.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את דגימת המים בתמיסות מלאי של מדיום ספציפי לבדיקה וכימיקל ייחוס, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. אחסן את המדיום הספציפי לבדיקה בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטר ממלאי כימי הייחוס המתאים ל-285 מיקרוליטר של מדיום בדיקה בצינור סטרילי.

מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של 5% DMSO במדיום בדיקה לשמונה צינורות נוספים. העבירו אליקוט של 100 מיקרוליטר משפופרת אחת לצינור שתיים, כדי להתחיל סדרת דילול משולשת.

מערבבים היטב את הדגימה המדוללת בשפופרת שתיים עם פיפטה. לאחר מכן, העבירו אליקוט של 100 מיקרוליטר מצינור שתיים לצינור שלוש. המשך בתהליך זה עבור כל צינור.

לאחר מכן, הכינו דגימת בקרת ממס על ידי ערבוב של 10 מיקרוליטר של DMSO ב-190 מיקרוליטר של מדיום בדיקה. לאחר מכן, אספו ותייגו ארבעה צינורות חדשים. הוסף 95 מיקרוליטר של מדיום בדיקה לצינור הראשון.

לאחר מכן, מוסיפים חמישה מיקרוליטר תמצית מים ומערבבים היטב. הוסף 50 מיקרוליטר של 5% DMSO במדיום בדיקה לשלושת הצינורות האחרים. לאחר מכן, בצע דילול כפול על ידי העברת 50 מיקרוליטר תמיסה מצינור אחד למשנהו.

התחל בהוצאת בקבוקון של תאים עצורים בחלוקת ER או GR מהמקפיא הקריוגני. הפשירו את התאים במהירות על ידי הנחת הבקבוקון באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, עם ערבוב עדין במשך שתי דקות. לאחר מכן, יש לטהר את הבקבוקון עם 70% אתנול.

הנח אותו בארון בטיחות ביולוגי מסוג 2. פתח את הבקבוקון בטכניקות אספטיות והעביר את התאים ל-10 מיליליטר של מדיום בדיקה. צנטריפוגה ב -200 פעמים גרם למשך חמש דקות.

לאחר השלמת הצנטריפוגה, השתמש בפיפטה מזכוכית סטרילית כדי לשאוב את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא בשישה מילילטרים של מדיום בדיקה. מערבבים חמישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים עם חמישה מיקרוליטר של תמיסת כתמים חיוניים.

לאחר מכן, הוסף אליקוט לחדר הספירה. ספרו את מספר התאים החיים באמצעות מיקרוסקופ אור או מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן, העריכו את צפיפות התאים החיים בתרחיף התא.

לדלל במידת הצורך, כדי לקבל צפיפות סופית של 550, 000 תאים חיים למיליליטר של מדיום בדיקה. התחל ביצירת פריסת צלחות הכוללת עקומת כיול ספציפית לבדיקת תשע נקודות, דגימות QA/QC ודילולים מרובים עבור כל תמצית מים. הוסף 90 מיקרוליטר של מדיום בדיקה לבארות הבקרה החופשיות של תאים משוכפלים.

שופכים את מתלה התאים למאגר פיפטינג סטרילי. לאחר מכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 90 מיקרוליטר של תרחיף תאים לבארות האחרות. הוסף 10 מיקרוליטר מהדגימות המדוללות לבארות המתאימות.

מכסים את הצלחת במכסה. לאחר מכן, הניחו את הצלחת באינקובטור 5%C02 בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. לאחר השלמת הדגירה, אפשר לצלחת להתייצב לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן יש לבצע את הצעדים הבאים בהיעדר אור ישיר. הכן תמיסת טעינה של שישה x לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת הטעינה לכל באר.

הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב כדאיות תאים לכל באר, כדי להעריך את הציטוטוקסיות של תמצית המים המדוללת. אטום את הצלחת בסרט דבק אלומיניום. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר השלמת הדגירה, הוסף את הצלחת לקורא המיקרו-פלטות עם יכולות קריאה תחתונה. מדוד את הקרינה ונתח את הנתונים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה נותחו ארבע דגימות מורכבות של 24 שעות של שפכים עירוניים מטופלים, שש דגימות של מים עיליים ממערכות מים מתוקים בדרום קליפורניה, ושדה ריק המורכב ממים טהורים במיוחד.

פעילות ER זוהתה בשבע מתוך 10 דגימות המים המייצגות, בעוד שפעילות GR זוהתה בארבע. ניתן לראות את הנחיות ביצועי ה-QA/QC עבור מבחני קולטן האסטרוגן וקולטני הגלוקוקורטיקואידים כאן. תוצאות המחקר עבור ציטוטוקסיות ודיוק הדגימה עמדו היטב בקריטריוני הקבלה, ואישרו את מדידות דגימת המים.

הריכוזים הגבוהים ביותר של הבדיקה הביולוגית נמצאו בשפכים המשניים, בעוד שפעילות ה-GR של השפכים השלישוני נמצאה מתחת לגבול הזיהוי של הבדיקה הביולוגית. כמו כן, רוב דגימות המים העיליים לא הראו פעילות GR מעל גבול הגילוי והיו בעלות רמות נמוכות בהרבה של פעילות ER מאשר השפכים המשניים. רוב דגימות השפכים של מפעלי טיהור השפכים הראו תגובת מינון מעל גבול הזיהוי עבור בדיקות ביולוגיות של ER ו-GR.

ניתן לראות כאן את התוצאות המייצגות של יחס הקרינה הכחול/ירוק הממוצע של דגימות אלה, כנגד גורם ההעשרה היחסי. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 24 שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן הניסיון הזה, חשוב לעקוב אחר כל הנחיות ה-QA/QC.

טכניקה זו סללה את הדרך למנהלים לחקור גישות חלופיות לניטור כימיקלים משבשים אנדוקריניים במים. אל תשכח שעבודה עם נתרן אזיד עלולה להיות מסוכנת. יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון עבודה במכסה אדים המתפקד כהלכה.