ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבודד נויטרופילים במצב של מנוחה (quiescent neutrophils) ולמדוד את שחרור ה-DNA שלהם בתגובה לאגוניסטים. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח באימונולוגיה וברפואה וטרינרית, כגון: מהי תגובת הנויטרופילים לאגוניסטים שונים המעוררים השראה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (neutrophil extracellular traps) או מוות תאי? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת סריקה מהירה של אגוניסטים ומעכבים שונים של היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

התחילו בהחדרת מחט פרפר (butterfly needle) במידה 21 לווריד הצפלי (cephalic vein) של כלב תורם בריא, לאחר מכן חברו מזרק של 3 mL ודגמו שלוש דגימות דם של 3 mL כל אחת, והעבירו את הדגימות באופן מיידי למבחנות דם פתוחות המכילות EDTA. הקפידו כי דקירת הווריד תהיה ללא טראומה וכי זרימת הדם תהיה טובה, שכן דגימת דם לקויה תוביל לתשואת נויטרופילים נמוכה. לאחר מילוי כל מבחנה, הפכו אותן כדי להבטיח ערבוב נאות של הדם ושל חומר נוגד הקרישה.

רכז את הדם במבחנה קונית של 50-milliliter. ערבב את הדגימות עם נפח שווה של 3%Dextran 500 סטרילי בטמפרטורת החדר על ידי היפוך עדין, והשאר את המבחנה במצב אנכי למשך 18 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבר את השכבה העליונה בצבע קש למבחנה נקייה, עד שלא ניתן יהיה לאסוף אותה עוד ללא זיהום מהשכבה האדומה התחתונה.

סבבו במערבל צנטריפוגי את השכבה העליונה. השליכו את הנוזל העליון (supernatant), והשביו ידנית את המשקע (pellet) ב-10 milliliters של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של תמיסת הפרדת תאים של polysucrose ב-sodium diatrizoate בטמפרטורת החדר למבחנה קונית של 50-milliliter.

שכבב את התאים בזהירות מעל תמיסת ההפרדה. הפרד את התאים באמצעות סרכזגה. השלף והשלך את שלוש השכבות העליונות של הפלזמה, התאים המונונוקלאריים של טסיות הדם ומדורג הצפיפות.

בצע ליזה של כל שאר כדוריות הדם האדומות באמצעות 10 milliliters של מים בטמפרטורת החדר. לאחר 30 שניות, הוסף 10 milliliters של 1.8%sodium chloride סטרילי בטמפרטורת החדר כדי להחזיר את הטוניות. ערבב את התאים על ידי היפוך עדין של המבחנה.

כעת אספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה. השעיקו בעדינות את המשקע הלבן ב-10 milliliters של PBS סטרילי. לאחר ספירה, סנטריפוגו את התאים שוב והשעיקו את המשקע בריכוז של five times 10 to the sixth תאים ל-milliliter ב-PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.

במידת הצורך, ייבשו באוויר נפח קטן של תאים על למסת זכוכית, ולאחר מכן צבעו אותם באמצעות ערכה לצביעה וקיבוע מהיר בהתאם להוראות היצרן. אם בידוד הנויטרופילים הצליח, לפחות 95% מהתאים בעלי הגרעין צריכים להיות גרנולוציטים עם זיהום מינימלי של אריתרוציטים כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ אור. מיד לאחר בידוד הנויטרופילים, העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן סטרילי של 70-micron והוסיפו 5×10⁴ תאים לבארי הבדיקה של פלטת 96-well המכילה מצע גידול לדגירה של 30 דקות ב-39 °C ו-4% CO2.

לאחר שהתאים נצמדו, הוסף לבארי הבדיקה, וכן לשני בארי ביקורת (blank) המכילים PBS בלבד, את האגוניסט הרלוונטי בתוספת RPMI ללא phenol red ומועשר ב-FCS שעבר אינאקטיבציה בחום, עד לנפח סופי של 100-200 microliters. לאחר מכן, הוסף לתאים צבע חומצות גרעין מתאים שאינו חודר לתא והחזר את הפלטה לאינקובטור. לאחר תקופת הדגירה המתאימה, מדוד את הפלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרופלטה.

גירוי של נויטרופילים של כלבים באמצעות platelet-activating factor למשך שעה אחת מוביל לעלייה ממוצעת פי ארבעה בפלואורסצנציה בהשוואה לתאי ביקורת שלא גורו. PMA, לעומת זאת, הוא אגוניסט איטי יותר שאינו מראה עלייה בפלואורסצנציה של נויטרופילים לפני שעתיים של הפעלה, אך בסופו של דבר מייצר עלייה דומה לאורך זמן. פלואורסצנציה של צבע לחומצות גרעיניות אינה ספציפית ליצירת neutrophil extracellular trap, שכן היא תתרחש גם אם יש מוות תאי במנגנונים אחרים או אם הריאגנטים מזוהמים ב-DNA.

לדוגמה, בניסוי מייצג זה, תכשיר LPS מסחרי הפיק פלואורסצנציה גבוהה מאוד בהיעדר נויטרופילים, ככל הנראה עקב זיהום ב-DNA בקטריאלי. לאחר ששולטה הטכניקה, ניתן להשלימה בערך בשישה שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטפל בנויטרופילים בעדינות.

אין להשתמש במיקסר (vortex) על התאים, ויש לשאוב את העל-נוזלים בעזרת פיפט במקום לשפוך אותם. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה, כדי לאשר שה-DNA שהשתחרר תואם ל-NETosis. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההמטולוגיה לבחון את האינטראקציה של DNA משתחרר על קריש הדם ואת ההשפעה של אגוניסטים חדשים של NET, כולל פלזמה של מטופלים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים נויטרופילים של כלבים ומודדים את תגובתם לאגוניסטים.