ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לייצר חלבון המבוסס על התחום החוץ-תאי של מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין או MOG, שניתן להשתמש בו כדי לגרום לדלקת מוח אוטואימונית ניסיונית או EAE. פרוטוקול זה מאפשר לכל מעבדה לייצר חלבון MOG על מנת להשתמש בו כאנטיגן לגרימת EAE. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא אינו מסתמך על ציוד מיוחד לטיפול בחלבון, אלא ניתן להשתמש בציוד סטנדרטי שנמצא כמעט בכל מעבדה אימונולוגית.

ובכן, פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לחלבון תג MOG בהתבסס על גרסת העכבר, הוא אמור לעבוד עבור מערכות ביטוי חלבון MOG אחרות המשלבות היט לטיהור. יש לחסן חמישה מיליליטר של מרק מעוקר עם ציר הגליצרול BL 21 MOG ולדגור אותו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. הוסף 500 מיקרוליטר של 100 מיליגרם למיליליטר אמפיצילין לכל אחת מ-500 מיליליטר צלוחיות המכילות 500 מיליליטר של LB סטרילי. מעבירים מיליליטר אחד מתרבית הלילה לכל אחת משתי צלוחיות מרק LB.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך חמש שעות או עד צפיפות אופטית של 0.6. לאחר הגעה לצפיפות התאים הרצויה, הוסף 0.5 מיליליטר של IPTG טוחנת אחת לכל בקבוק תרבית. דגרו על הבקבוק, קבעו 37 מעלות צלזיוס ו -200 סל"ד למשך ארבע שעות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר ו -75 סל"ד למשך הלילה.

חלקו את התרביות באופן שווה בין בקבוקי 250 מיליליטר התואמים לצנטריפוגה במהירות גבוהה ושמרו את הבקבוקים על קרח מנקודה זו ואילך. גלולה את תאי החיידקים ב 22, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש ושלבו את כל כדורי החיידקים בסך הכל 30 מיליליטר של מאגר ליזאט.

העבירו את הנפח הזה לצינור תחתון של 50 מיליליטר המסוגל לרכז במהירות גבוהה. הנח את השפופרת באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך זמן הדגירה, נער את הצינור פעמיים כדי להשעות מחדש את התאים.

לאחר הדגירה, העבירו את הצינור לקרח וסוניקציה של התמיסה ב-20 קילו-הרץ ומשרעת של 70% דולקים למשך שלוש שניות וכבויים למשך שלוש שניות למשך חמישה פולסים, סוניקציה של התמיסה לשישה סיבובים בסך הכל של חמישה פולסים, מה שמאפשר לתמיסה להתקרר בקרח בין הסיבובים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה ב-24,000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז השעו מחדש את הגלולה ב-30 מיליליטר של מאגר A ודגרו על התמיסה בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, סוניקציה של התמיסה על קרח כמו קודם, ולאחר מכן הוסף 17.2 גרם של גואנידין הידרוכלוריד לתמיסה.

דגרו את הדגימה על קרח למשך שעה כדי להמיס את חלבון תג ה-MOG. כדי לטעון ולאזן את שרף הניקל, שטפו תחילה את השרף על ידי הוספת 40 מיליליטר מים לכל צינור המכיל שרף. הניחו את הצינורות בצורה אופקית על נדנדה ותנו להם לערבב במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר סיום, צנטריפוגה את הצינורות ב 4500 פעמים גרם למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט על ידי פיפטינג כדי למנוע הפרעה לגלולה. לאחר מכן הוסף 40 מיליליטר של מאגר מטען לכל צינור.

מעבירים את הצינורות על נדנדה ונותנים להם לערבב במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני שהצנטריפיקציה נעשית שוב כמו קודם. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 40 מיליליטר של מאגר B לצינורות. העבירו את הצינורות על נדנדה ותנו להם לערבב במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני צנטריפיקציה של הצינורות בשרף פעם נוספת.

כדי לטהר את חלבון תג ה-OG, העבירו את כל נפח החלבון המסיס לצינור הראשון המכיל שרף ניקל. לאחר הערבוב, הניחו את הצינור אופקית על נדנדה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר איחוי מרכזי של הצינור ב-4500 פעמים גרם למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הסופרנטנט הזה לצינור השני של שרף הניקל ודגרו כמו קודם.

בינתיים, השעו מחדש את שרף הניקל בצינור הראשון במאגר אבולוציה של 40 מיליליטר והניחו את הצינור אופקית על נדנדה בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לפני הצנטריפיזציה כמו קודם. העבירו את הסופרנטנט המכיל את חלבון תג ה-MOG הנרמז לבקבוק של 250 מיליליטר שכותרתו חלבון מתויג MOG מטוהר שמור את הבקבוק הזה על ארבע מעלות צלזיוס.

בכל שלב של השטיפה, אסוף את הסופרנטנט שנוצר בבקבוק זה. הוסף 40 מיליליטר של מאגר רצועה לניקל הקיים בצינור הראשון והניח אופקית על נדנדה למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה את הצינור, השליכו את הסופרנטנט וטענו מחדש את הניקל שעלה כמו קודם.

לאחר שתסיים, התקדם עם הצינור השני כפי שנעשה עבור הצינור הראשון. בסך הכל ארבעה סבבים של ספיגה של החלבון המסיס על שרף הניקל הטעון והפליטה ישחזרו את רוב החלבון. חותכים כ -30 סנטימטרים של צינורות דיאליזה מעור נחש.

אבטח קצה אחד עם המוסטט נעילה על ידי קיפול קצה עור הנחש שלוש פעמים והידוק הקצה המקופל עם ההמוסטט. מלאו את עור הנחש בחלבון תג MOG מדולל. לאחר מכן הסר את כל בועות האוויר מעור הנחש על ידי אילוץ אותם החוצה מהקצה הפתוח.

לבסוף, אטום את הקצה השני של הצינור באמצעות המוסטט נעילה שני. לאחר מכן, מלאו דלי גדול בליטר אחד של מאגר אצטט אחד עם ארבעה גואנידין טוחנות. הנח עד שני חלקים של צינורות דיאליזה המכילים חלבון תג MOG לתוך הדלי.

בעזרת סרט, אבטח את ההמוסטטים לצד הדלי כדי להשאיר מקום למוט ערבוב מגנטי להסתובב באין מפריע בתחתית. הכניסו את הדלי לחדר של ארבע מעלות צלזיוס על צלחת חצאית מגנטית והפעילו אותו לקצב סיבוב איטי. הדיאליזה אורכת לפחות שלושה ימים כדי להפחית בהדרגה את כמות הגואנידין במאגר.

בדוק באופן קבוע כדי לוודא שהצינור מתחיל שלם ושהקצוות סגורים היטב. לאחר ארבע עד חמש שעות, הוסף ליטר אחד של מאגר אצטט אחד לדלי הדיאליזה. חזור על תהליך זה כל ארבע עד חמש שעות בסך הכל שלוש פעמים כדי לגרום לסך של ארבעה ליטרים בדלי.

לאחר השלכת מחצית מהמאגר בדלי, מלאו מחדש בליטר אחד של מאגר x אצטט אחד והקימו את הצינור ומוט הערבוב. לבסוף, החליפו את כל נפח ארבעת הליטר בדלי בארבעה ליטרים של מאגר טרי אחד x אצטט והניחו לערבב במשך ארבע עד חמש שעות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לבצע את השלב הזה ביום ריכוז החלבון.

כדי לרכז את חלבון תג ה- OG, מרפדים עט בנייר אלומיניום ומכסים את רדיד האלומיניום ב- PEG 3350 ו- PEG 1000 ביחס של אחד לאחד. ה-PEG 3350 יכול לסייע במניעת צבירת חלבון במהלך הריכוז והוא חומר משמר יעיל בהקפאה. שים את חלבון תג ה-MOG המכיל צינורות עור נחש על גבי רדיד האלומיניום וכסה ב-PEG 8000.

תן לזה לשבת בטמפרטורת החדר ובדוק את עוצמת הקול באופן קבוע עד שהנפח שווה או מתחת לנפח הסופי המשוער. אם העט הופך רווי יתר על המידה במים במהלך תהליך הריכוז, הגדר מחבת טרייה עם נייר אלומיניום ו-PEG. דגימות חלבון שנלקחות לאורך פרוטוקול הטיהור או מופעלות על ג'ל דף SDS כדי לאשר את הטוהר.

מוצג ג'ל מייצג המציג את תג ה-MOG המטוהר ביותר ב-31.86 קילודלטון. כדי לוודא שחלבון תג ה-MOG התקפל כהלכה, הקישור של חלבון תג ה-MOG ל-CD19 חיובי, CD4 שלילי, תשעה תאי B מבלוטות לימפה מ-C57 עכברים שחורים או עכברי IgH MOG המבטאים שרשרת כבדה של אימונוגלובולין ספציפית לחלבון MOG הוערכה באמצעות ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה דורש מינימום של 10 ימים מתחילתו ועד סופו.

לאורך כל הליך הבידוד חשוב לעקוב אחר החלבון ולזכור מה צריך לשמור ומה צריך להשליך. אל תשכח בעת שימוש בניקל גופרתי הקסהידרט המשמש לטעינת שרף הניקל, הוא מסוכן ביותר ויש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע שאיפה או מגע עם העור או העיניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר ולטהר חלבון תג MOG משלך.

לאחר הטיהור, חלבון תג MOG יכול להיות מתחלב באדג'ובנט מלא של פרוינד ולהשתמש בו כחיסון לגרימת EAE. EAE המושרה על ידי תג MOG יכול לשמש לחקר המעורבות של סוגי תאים מרובים כגון תאי CD4 או CDAT או תאי B באוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית. בניגוד לפפטיד קצר, המוגבל ב-MHC, ניתן להשתמש באנטיגן חלבון בכל זן של עכברים.