שימוש במחסנית סינון עבור הסינון של מי דוגמאות הפקת DNA הסביבה
25 בנובמבר 2016
אנו מתארים פרוטוקול לסינון דגימות מים עם מחסנית מסנן וחילוץ DNA סביבתי (eDNA) מבלי לחתוך את המארז כדי להסיר את המסנן. פרוטוקול זה פותח עבור מטברקוד דנ"א מדגים, אולם הוא ישים גם לדנ"א סביבתי מאורגניזמים אחרים.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לסנן דגימות מים באמצעות מחסיר סינון ולחלץ DNA סביבתי ללא צורך בחיתוך המעטפת להוצאת המסנן, לצורך metabarcoding של eDNA מאורגניזמים מימיים שונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האקולוגיה, כגון ניטור מגוון ביולוגי ואקולוגיה של קהילות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמחסרי הסינון יכולים להכיל נפחי מים גדולים יותר, וניתן לבצע את הסינון ואת חילוץ ה-DNA באופן סטרילי.
כדי להתחיל בהליך זה, חברו צינור ואקום גבוה למחבר הכניסה של משאבת שאיבה. חברו את הקצה השני של הצינור לסעפת (manifold). ודאו ששלושת שסתומי ה-T האדומים בסעפת נמצאים במצב כבוי (off).
בשלב הבא, לבשו זוג כפפות נקי. הכניסו מחבר luer נקבה בקצה העליון של צינור הגומי לוואקום. לאחר מכן, הכניסו מחבר ואקום בקצה התחתון.
חבר בזהירות את מחבר הלור (luer) הנקבי לפתח יציאה של מחסנית המסנן. לאחר מכן, חבר את מחבר הוואקום לפקק סיליקון. שפוך ליטר אחד של מי הדגימה לתוך השקית הפלסטית שהוכנה.
סגור את פקק הבורג באמצעות מחבר luer-lock זכר. לאחר מכן, חבר בזהירות יציאת כניסה של מחסנית המסנן המורכבת אל מחבר ה-luer-lock הזכר. ודא שכל החיבורים מהודקים.
לאחר מכן, תלה את השקית מפלסטיק על שני שיניים בפאנל הרשת. הכנס פקק סיליקון לפתח הכניסה של המניפולד. לאחר מכן, הפעל את השואב.
פתחו את שסתומי-T האדומים לצורך סינון. הפעילו את המניפולד עד שסנן המחליף יתייבש. לאחר מכן, סגרו את שסתומי-T האדומים.
חזרו על תהליך זה במלואו עד לסינון הכמות הרצויה של מים. לאחר שכל המים שנדגרו סוננו, הוציאו בזהירות את מחסנית הסינון מהשקית מפלסטיק ומהמכל של השואב. סגרו את שני קצוות המחסנית עם מכסי luer המתאימים.
לאחר מכן, באמצעות טוש עמיד בממסים, סמנו את המחסנית ואת מכסה ה-luer של כניסת הדגימה. אחסנו בטמפרטורה של 20 °C עד לביצוע מיצוי ה-DNA. עבור דגימות הגדולות מארבעה ליטרים, הכינו בקבוק ספר (book bottle) של עשרה ליטרים כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.
הוסיפו את דגימת המים לסינון. לאחר מכן, הכניסו בחוזקה טיפ של פיפטה של ten milliliter אל השסתום של בקבוק הספר. הכניסו בחוזקה את פתח הכניסה של מחסנית המסנן אל טיפ הפיפטה.
לאחר מכן, הכניסו פקק סיליקון לפתח הכניסה של המניפולד. הפעילו את השואב. לאחר מכן, פתחו את שסתומי ה-T האדומים לסינון.
הפעילו את הסעף עד שהמחסנית המסננת תתייבש. לאחר השלמת הסינון, סגרו את שסתומי ה-T האדומים. הוציאו בזהירות את המחסנית מהשקית הפלסטית וממחבר הוואקום.
לאחר מכן, סגרו את שני קצוות המחסנית בעזרת פקקי luer המתאימים. השתמשו בטוש עמיד לממסים כדי לסמן את המחסנית ואת פקק ה-luer של הכניסה. אחסנו בטמפרטורה של 20 degrees Celsius עד לביצוע הפקת ה-DNA.
חממו מראש אינקובטור ל-56 °C. לאחר מכן, גזרו את המכסה הצירים ממשפרונית של 2.0 µL והשליכו את המכסה. הסירו את מכסה הלור (luer) של פתח הכניסה ממחסנית המסנן.
לאחר מכן, הכניסו את פתח הכניסה לתוך מבחנה בנפח 2.0 milliliter. בעזרת סרט איטום (self-sealing film), אטמו היטב את החיבור בין המחסנית למבחנת האיסוף. לאחר מכן, הכניסו את היחידה המאוחדת למתאם צנטריפוגה עבור מבחנה קונית בנפח 15 milliliter.
סובב את המחסנית בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-5000 ×g כדי להסיר את הנוזל הנותר במסנן. עם סיום הסבב, הוצא את מבחורת האיסוף ממחסנית המסנן והשליכה אותה. לאחר מכן, סגור שוב את פתח הכניסה.
בשלב הבא, ערבבו 20 µl של תמיסת protein A-Case, 220 µl של phosphate-buffered saline ו-200 µl של buffer AL. הסירו את מכסה הכניסה והוסיפו את התערובת למחסנית באמצעות פיפטה, על ידי הכנסת הפיפטה באופן מלא לתוך פתח הכניסה. סגרו שוב את פתח הכניסה. לאחר מכן, הניחו את מחסנית המסנן על שייקר סיבובי.
הניחו את השייקר הסיבובי (rotary shaker) בתוך האינקובטור שחומם מראש, והגדירו את השייקר ל-20 rpm למשך 20 דקות. במהלך הדגירה, סמנו מבחנה חדשה בנפח 2.0 milliliter בעזרת טוש עמיד לממסים. לאחר מכן, הכניסו אותה לתוך מבחנה קונית בנפח 50 milliliter.
לאחר השלמת הדגירה, הסירו את מכסה הכניסה. לאחר מכן, הכניסו את פתח הכניסה לתוך מבחנה חדשה בנפח 2.0 milliliters. סגרו את המבחנה הקונית עם מכסה הברגה.
סבבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-5000 ×g כדי לאסוף את ה-DNA שהופק. לאחר מכן, הוציאו את המחסנית מהמבחנה בנפח 2.0 milliliter באמצעות פינצטה סטרילית. סגרו את המבחנה וטהרו את ה-DNA שהופק כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.
בפרוצדורה זו, נפחים שונים של מי ים מסוננים דרך אותו גבס (manifold) באמצעות שני סוגי מסננים ייחודיים, ולאחר מכן מופק eDNA. מחסנית הסינון זיהתה, בממוצע, 50% יותר מינים מאשר מסנני סיבי הזכוכית. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשני שעות, במידה ותבוצע כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לסנן דגימות מים באמצעות מחסנית סינון, וכיצד למיין eDNA מבלי שיהיה צורך לחתוך את המארז כדי להוציא את המסנן, לצורך metabarcoding של eDNA מאורגניזמים מימיים שונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתווה שיטה לסינון דגימות מים באמצעות מחסנית סינון לצורך הפקת DNA סביבתי (eDNA) ללא צורך בחיתוך של המארז. הפרוטוקול מיועד בעיקר למטבארקודינג (metabarcoding) של eDNA מדגים, אך ניתן להחילו אותו גם על אורגניזמים מימיים אחרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ניתוח DNA סביבתי (eDNA)
- טכניקות מטאברקודינג
- ניטור אקולוגי
רקע
- eDNA מספק תובנות לגבי מגוון ביולוגי ואקולוגיה של קהילות.
- שיטות מסורתיות דורשות לעיתים קרובות טכניקות פולשניות כדי לגשת למסננים.
- שיטה זו מאפשרת עיבוד של נפחי מים גדולים יותר.
- ניתן לבצע סינון והפקת DNA בסביבה סטרילית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לא פולשנית להפקת eDNA.
- סיוע בניטור מגוון ביולוגי במערכות אקולוגיות מימיות.
- שיפור היעילות של metabarcoding של eDNA.
שיטות שנמצאו בשימוש
- חיבור צינורית ואקום גבוה למשאבת שאיבה.
- חיבור צינורית לסעפת עם שסתומי בקרה.
- סינון דגימות מים באמצעות מחליט סינון.
- מיצוי eDNA מהמסנן ללא פתיחת המארז.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר מיצוי מוצלח של eDNA מנפחי מים גדולים יותר.
- שומר על סטריליות במהלך תהליכי הסינון והמיצוי.
- ניתן ליישום על מגוון אורגניזמים מימיים מעבר לדגים.
- משפר את המהימנות של מחקרי eDNA metabarcoding.
מסקנות
- שיטה זו מפשטת את מיצוי ה-eDNA מדגימות מים.
- היא תומכת במחקר אקולוגי על ידי אספקת כלי חסון להערכת מגוון ביולוגי.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומים אחרים של ניטור סביבתי.
שאלות נשאלות שוב ושוב
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיצוי יעיל של DNA סביבתי (eDNA) מדגימות מים בנפח גדול באמצעות מחליפי מסננים מאפשר ניטור של מגוון ביולוגי במערכות מימיות באופן לא פולשני ובספיקת תפוקה גבוהה. גישה זו תומכת בגילוי מוקדם ובתיקוף מטרות על ידי אספקת נתונים כמותיים ואמינים על נוכחות מינים ללא הפרעה לבתי גידול. יכולת ההרחבה והסטריליות של השיטה רלוונטיות ישירות עבור צוותי ביו-פארמה המפתחים או מתקפים סמנים ביולוגיים סביבתיים ובדיקות אקולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מונחית-השערה של מגוון ביולוגי מימי באמצעות שימוש ב-eDNA כמדד מולקולרי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של יעדים אקולוגיים על ידי איסוף נתוני מינים מקיפים מנפחי מים גדולים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בפיתוח סמנים ביולוגיים סביבתיים באמצעות דגימה סטנדרטית ולא פולשנית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין דגימות eDNA מתוקפות עבור תהליכי עבודה של metabarcoding ואנליזה מולקולרית בהמשך.
- משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי שמירה על סטריליות ומיזעור הסיכון לזיהום.
- מאפשר סריקה רחבה ובספיקות גבוהה של דגימות סביבתיות לצורך זיהוי וכמותיות של מינים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים (translational biomarkers) באמצעות מתן אפשרות לניטור לא פולשני של בריאות המערכת האקולוגית.
- מספק רצף מדגימה סביבתית ועד לניתוח מולקולרי, ובכך תומך בקידום של בדיקות אקולוגיות מותאמות לסיכון.
- מפחית עמימות מכניסטית במחקרים סביבתיים פרה-קליניים על ידי אספקת נתוני eDNA כמותיים הניתנים לשחזור.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול סינון והפקה זה משלב בין דגימה סביבתית לבין פיתוח בדיקות מולקולריות, ותומך בתהליכי עבודה החל משלב הגילוי המוקדם ועד לאישוש פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים במחקרי מגוון ביולוגי מימי.
- סריקה: מספק דגימות eDNA מוכנות לבדיקה עם זיהומים מינימליים לצורך ניתוחים אמינים בהמשך התהליך.
- אנליטיקה: מספק פלטי זיהוי מינים כמותיים לצורך ניתוח השוואתי וסטטיסטי.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה לסממנים ביולוגיים של בריאות המערכת האקולוגית ואסטרטגיות ניטור לא פולשניות.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע פרוטוקול בר-קיימא וניתן להרחבה עבור יישומים מגוונים של eDNA מימי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות בתיקוף מטרות אקולוגיות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, הסטריליות והיכולת להרחבה (scalability) של תהליכי עבודה ב-eDNA.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ובפיתוח בדיקות יעיל מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון של תוכניות לבדיקות וסממנים ביולוגיים סביבתיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות סטריליות ובתהליכי עבודה של אקולוגיה מולקולרית.
- דורש גישה לתשתיות של סינון בוואקום, אינקובטורים וצנטריפוגציה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית לטיפול בדגימות ולסימון שלהן.
- ניתן להתאמה לסביבות מימיות שונות ולנפחי דגימה משתנים.
- תלוי בפרוטוקולים מאושרים של טיהור DNA ואנליזה בשלבים הבאים.
