שימוש במחסנית סינון עבור הסינון של מי דוגמאות הפקת DNA הסביבה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לסנן דגימות מים עם מחסנית פילטר ולחלץ DNA סביבתי מבלי לחתוך את המארז כדי להסיר את המסנן מ-metabarcoding eDNA מאורגניזמים ימיים שונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האקולוגי, כגון ניטור מגוון ביולוגי ואקולוגיה קהילתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמחסניות המסנן יכולות להכיל נפחי מים גדולים יותר וניתן לבצע את הסינון וחילוץ ה-DNA בצורה סטרילית.

כדי להתחיל בהליך זה, חבר צינורות ואקום גבוהים למחבר הכניסה של משאבת שואב. חבר את הקצה השני של הצינור לסעפת. ודא ששלושת שסתומי ה- T האדומים בסעפת נמצאים במצב כבוי.

לאחר מכן, לבש סט כפפות נקי. הכנס התאמת לואר נקבה בקצה העליון של צינור הגומי הוואקום. לאחר מכן, הכנס מחבר ואקום בקצה התחתון.

חבר בזהירות את אביזר הלואר הנשי ליציאת יציאה של מחסנית המסנן. לאחר מכן, חבר את מחבר הוואקום לפקק סיליקון. שופכים ליטר אחד של מים שנדגמו לשקית הניילון המוכנה.

סגור את מכסה הבורג עם מחבר נעילת ה-luer הזכר. לאחר מכן, חבר בזהירות יציאת כניסה של מחסנית המסנן המורכבת עם מחבר הנעילה הזכר. ודא שכל החיבורים מאובטחים.

לאחר מכן, תלו את שקית הניילון משני שיניים על לוח הרשת. הכנס פקק סיליקון ליציאת הכניסה של הסעפת. לאחר מכן, הפעל את השואב.

פתח את שסתומי ה-T האדומים לסינון. הפעל את הסעפת עד שמחסנית המסנן יבשה. לאחר מכן, סגור את שסתומי ה- T האדומים.

חזור על כל התהליך הזה כדי לסנן את כמות המים הרצויה. לאחר סינון כל המים שנדגמו, הסר בזהירות את מחסנית המסנן משקית הניילון ומיכל הוואקום. מכסה את שני קצוות המחסנית במכסי הלואר המתאימים.

לאחר מכן, בעזרת עט חסין ממס, סמן את המחסנית ואת מכסה הכניסה. יש לאחסן בחום של 20 מעלות צלזיוס עד לביצוע מיצוי DNA. לדוגמאות גדולות מארבעה ליטר, הכינו בקבוק ספר של עשרה ליטר כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

הוסף את דגימת המים לסינון. לאחר מכן, הכנס בחוזקה קצה פיפטה של עשרה מיליליטר לשסתום של בקבוק הספר. הכנס היטב את יציאת הכניסה של מחסנית המסנן לקצה הפיפטה.

לאחר מכן, הכנס פקק סיליקון ליציאת הכניסה של הסעפת. הפעל את השואב. לאחר מכן, פתח את שסתומי ה- T האדומים לסינון.

הפעל את הסעפת עד שמחסנית המסנן יבשה. לאחר השלמת הסינון, סגור את שסתומי ה- T האדומים. הסר בזהירות את המחסנית משקית הניילון ומחבר הוואקום.

לאחר מכן כסה את שני קצוות המחסנית במכסי הלואר המתאימים. השתמש בעט חסין ממס כדי לתייג את המחסנית ואת מכסה הכניסה. יש לאחסן בחום של 20 מעלות צלזיוס עד לביצוע מיצוי DNA.

מחממים חממה ל 56 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חותכים את המכסה הציר מצינור של 2.0 מיליליטר וזורקים את המכסה. הסר את מכסה הכניסה ממחסנית המסנן.

לאחר מכן, הכנס את יציאת הכניסה לצינור של 2.0 מיליליטר. בעזרת סרט איטום עצמי, אטום היטב את החיבור בין המחסנית לצינור האיסוף. לאחר מכן, הכנס את היחידה המשולבת למתאם צנטריפוגה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה את המחסנית למשך דקה אחת ב 5000 פעמים גרם כדי להסיר את הנוזל שנותר במסנן. לאחר השלמת הצנטריפוגה, הסר את צינור האיסוף ממחסנית המסנן והשליך את הצינור. לאחר מכן, סכם את יציאת הכניסה.

לאחר מכן, מערבבים 20 מיקרוליטר של תמיסת חלבון A-Case, 220 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט ו-200 מיקרוליטר של בופר AL. הסר את מכסה הכניסה והוסף את התערובת לתוך המחסנית באמצעות פיפטה, והכנס את הפיפטה לחלוטין לפתח הכניסה. סיכום יציאת הכניסה. לאחר מכן, הנח את מחסנית המסנן על שייקר סיבובי.

מניחים את השייקר הסיבובי בחממה שחוממת מראש, ומכוונים את השייקר ל -20 סל"ד למשך 20 דקות. במהלך הדגירה, סמן צינור חדש של 2.0 מיליליטר עם עט חסין ממס. לאחר מכן, הנח אותו בצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר השלמת הדגירה, הסר את מכסה הכניסה. לאחר מכן, הכנס את יציאת הכניסה לצינור החדש של 2.0 מיליליטר. מכסה את הצינור החרוטי במכסה בורג.

צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-5000 פעמים גרם לאיסוף ה-DNA שחולץ. לאחר מכן, הסר את המחסנית בצינור 2.0 מיליליטר באמצעות מלקחיים מעוקרים. כסו את הצינור וטהרו את ה-DNA שחולץ כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

בהליך זה, ארבעה נפחים שונים של מי ים מסוננים על אותה סעפת באמצעות שני מסננים ייחודיים, ולאחר מכן מופק דנ"א סביבתי. מחסנית המסנן זיהתה, בממוצע, 50% יותר מינים מאשר מסנני סיבי הזכוכית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנן דגימות מים עם מחסנית פילטר, וכיצד לחלץ eDNA מבלי שתצטרך לחתוך את המארז כדי להסיר את המסנן מ-metabarcoding eDNA מאורגניזמים מימיים שונים.