Name: שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: למד סינתזת פפטואידים עם פונקציונליות קטיונית מעורבת ממונומרי ליזין וארגינין לטיפול בלישמניה מקסיקנה. שיטה זו מציגה יתרון בפיתוח תרופות חדשות למחלות טרופיות מוזנחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים המועצה למחקר הנדסה המדעים הפיזיקליים (EPSRC) עבור תמיכה כספית (HLB). אנו מודים גם Sridevi Maalika Ramanoudjame על סיועה בזמן הצילומים של הליך זה.

<ol><li>Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+method+for+the+preparation+of+peptoids+oligo%28N-substituted+glycines%29+by+submonomer+solid-phase+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).</li>
<li>Bolt, H. L., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+method+for+the+synthesis+of+peptoids+containing+both+lysine-type+and+arginine-type+monomers%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers.</a> Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).</li>
<li>Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+peptoids+that+mimic+the+structure+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2015).</li>
<li>Chongsiriwatana, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoids+that+mimic+the+structure%2C+function%2C+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).</li>
<li>Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+Anti-leishmanial+Effects+of+Linear+Peptoids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids.</a> Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).</li>
<li>Kapoor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptoids+Are+Effective+against+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).</li>
<li>Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activities+of+twenty+lysine-peptoid+hybrids+against+clinically+relevant+bacteria+and+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi.</a> Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).</li>
<li>Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+Cyclic+Peptoids+That+Exhibit+Antimicrobial+Activity+by+Disrupting+Staphylococcus+aureus+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes.</a> Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).</li>
<li>Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Linear+and+Cyclic+Peptoid+Oligomers+as+Potent+Antimicrobial+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents.</a> Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).</li>
<li>Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+the+Chemical+Space+of+Anti-leishmanials%3A+a+Structure-Activity+Relationship+Study+of+Peptoids+against+Leishmania+mexicana%2C+a+Causative+Agent+of+Cutaneous+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Chem+Comm%22%5BJournal%5D)">Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis.</a> Med Chem Comm. , (2016).</li>
<li>The World Health Organisation. Leishmaniasis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/leishmaniasis/en/">http://www.who.int/leishmaniasis/en/</a> (2016).</li>
<li>Chon, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+overuse+and+resistance+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+therapy%22%5BJournal%5D)">Antibiotic overuse and resistance in dermatology.</a> Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).</li>
<li>Alvar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis+Worldwide+and+Global+Estimates+of+Its+Incidence%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence.</a> PLOS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+trypanosomiases+and+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).</li>
<li>Kedzierski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis+Vaccine%3A+Where+are+We+Today%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Global+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today?</a> J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).</li>
<li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in leishmaniasis.</a> Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+Host-Defense+Peptides%3A+Cationic%2C+Amphipathic+Peptoids+with+Potent+Anticancer+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity.</a> PLOS ONE. 9, (2014).</li>
<li>Wender, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Design%2C+Synthesis%2C+and+Evaluation+of+Molecules+That+Enable+or+Enhance+Cellular+Uptake%3A+Peptoid+Molecular+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).</li>
<li>Schröder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoidic+Amino-+and+Guanidinium-Carrier+Systems%3A+Targeted+Drug+Delivery+into+the+Cell+Cytosol+or+the+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li>
<li>Kömel, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptoids%3A+Introduction+of+novel+cationic+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains.</a> Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).</li>
<li>Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+membrane+activity+of+%CE%B1-peptide%2F%CE%B2-peptoid+chimeras%3A+Influence+of+amino+acid+composition+and+chain+length+on+the+activity+against+different+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains.</a> BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).</li>
<li>Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Arginine+and+Lysine+Residues+in+the+Translocation+of+a+Cell-Penetrating+Peptide+from+%2813%29C%2C+%2831%29P+and+%2819%29F+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR.</a> Biochem. 48, 4587-4595 (2009).</li>
<li>Andreev, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidino+groups+greatly+enhance+the+action+of+antimicrobial+peptidomimetics+against+bacterial+cytoplasmic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes.</a> BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).</li>
<li>Foged, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+membrane-destabilising+properties+of+alpha-peptide%2Fbeta-peptoid+chimeras%3A+lessons+for+the+design+of+new+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides.</a> BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).</li>
<li>Vedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiplasmodial+and+prehemolytic+activities+of+alpha-peptide-beta-peptoid+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras.</a> Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).</li>
<li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep-Calc.com%3A+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Computer-Aided+Mol+Des%22%5BJournal%5D)">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).</li>
<li>Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+developmental+cycle+of+Leishmania+mexicana+in+axenic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture.</a> Parasitol. 108, 1-9 (1994).</li>
<li>Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+separate+growth+phases+during+the+development+of+Leishmania+in+sand+flies%3A+implications+for+understanding+the+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle.</a> Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).</li>
<li>Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeo%2C+J+%22Comp+Biomaterials%22">Comp Biomaterials</a>. Ducheyne, P., et al. 2, Elsevier. 53-76 (2011).</li>
<li>Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dde+-+A+selective+primary+amine+protecting+group%3A+A+facile+solid+phase+synthetic+approach+to+polyamine+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates.</a> Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).</li>
<li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+%28alpha-peptoids%29+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li>
<li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+Submonomer+Synthesis+of+Peptoid+Polymers+and+their+Self-Assembly+into+Highly-Ordered+Nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets.</a> J Vis Exp. , e3373(2011).</li>
<li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li>
<li>Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Alamar+Blue+assay+for+cellular+growth+and+viability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro.</a> J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> Peptoids ויותר הנלמד בתוך וביולוגיה כימית ושדות כימיה רפואית ביישומים כגון הרפוי הרומן 3-5, סוכני משלוח תא 18,20 וכלי אבחון. 29 בדרך כלל, רצפים אלה הם קטיוני לספק מידה של הסלקטיביות עבור הפתוגן מעל בתאי יונקים, היכולת לחדור דרך קרומי התא, וכן לסייע מסיסות במערכות מימיות. ישנן דוגמאות רבות של peptoids קטיוני המכילים אך ורק lysine- או ארגינין-מימטיים שאריות בספרות. עם זאת, עד כה, את הסינתזה של peptoids המכילה את כל שאריות קטיוני אלה באותו הרצף התעכבה בשל חוסר הליך סינטטי מתאים. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר peptoids קטיוני מעורב להיות מסונתז באופן יעיל רצוי מאוד כפי שהוא מציע מסלול לווסת את התכונות ביולוגיות וכימיות של peptoids amphipathic. NT &quot;&gt; השיטה שלנו משתמשת עיבוד לסינתזה הנפוצה submonomer peptoid ומתירה תוספת של שני מונומרים lysine- ו ארגינין מסוג בתוך אותו הרצף. היא משתמשת זיווגים בטמפרטורת החדר והקים הגנת כימית קבוצה כך הוא צפוי כי שיטה זו יהיה שימושי עבור רוב קבוצות מחקר. כדי להוסיף שכבת הגנה מאונכת עבור שאריות ארגינין-הסוג, גידול diamine מוגן מתווסף בתנאי עקירה סטנדרטיים ולאחר מכן מוגן צימוד 60 דקות עם DDE-OH. מגוון diamines יכול להיות השתמש המאפשר שרשרות צד מן 2 פחמנים עד 6 פחמנים ארוכים כדי להיות מותקנים, כלומר, 1,2-diaminoethane אל diaminohexane 1,6 בהתאמה. להמסה גם DDE-OH ההגנה ב DMF ו היא קבוצת הגנה יעילה מאוד סלקטיבית אמינים ראשוניים. הקבוצה-גינת DDE משאיר אמינות שניוני מעושה, למשל, התחנה הסופית N המוגן של שרשרת peptoid. 30 מגבלה אחת היא שכל synהתזה נערכה באופן ידני; עם זאת, הוא צפוי כי תנאי הצימוד פתחו את השיטה נוחה לשימוש עם פפטיד אוטומטי / סינתיסייזרים peptoid. על שרף deprotection של קבוצות DDE נעשית באמצעות פתרון הידרזין 2% ב DMF לעזוב אמינים חינם שניתן guanidinylated על שרף באמצעות pyrazole-1-carboxamidine. שישה ושווי של pyrazole-1-carboxamidine ושישה ושווי של DIPEA משמשים לכל אמין בחינם על השרף (כלומר, שש שחלופות מונומר אחד מסוג N Arg להיות מותקנות). שוב, התגובה הזו היא גם יעילה מגיב pyrazole-1-carboxamidine יש מסיסות טובה DMF. השלמת התגובה נתפסת בדרך כלל באמצעות LC-MS לאחר 60 דקות בטמפרטורת החדר. בשל הרבגוניות של שיטת submonomer, מגוון רחב של אמינים ראשוניים ניתן להשתמש בשלב העקירה כך תנאים עשויים צריכים להיות מותאמים כדי להגדיל אפי צימודciency ותשואות מוצרים כוללים או טוהרות. 31 עבור הרצפים שנדונו לעיל, ללא תנאים מיוחדים כהכרחיים זיווגים מוצלחים. עם זאת, פעמי עקירה יותר או ריכוזיים אמין גבוהה יוכל לשמש עבור התקות בעייתיות (כלומר, עבור אמיני nucleophilic גרועים או sterically המגושמים). אמינים מסוימים עשויים שלא להיות מסיסים לחלוטין DMF, ובמקרה זה מומלץ לפזר אלה N -methyl-2-pyrrolidone (NMP), או ממסים מתאימים אחרים לתגובות-שלב מוצק במקום כמו שיטת מרכז קודם לסינתזת submonomer של peptoids. 32 כדי לשלב מונומרים המכילים heteroatoms מוגנים ב הרשתות בצד, acetylation באמצעות חומצה chloroacetic הוכח כיעיל על ידי קבוצות אחרות. 33 בנוסף, ניתן להשתמש שרפים אחרים בשיטה זו להניב peptoids עם functionalization מסוף C שונה. וואנג שרפים שרפי כלוריד 2-chlorotrityl משמשים באופן שיגרתיסינתזה submonomer של peptoids. לדוגמא, שיטה זו שמשה בהצלחה עם שרף כלוריד 2-chlorotrityl בקבוצה שלנו. 2 תומך מוצק שונה ידרוש הליך טוען שונה רינק אמיד דן כאן (תלוי השרף הספציפי בשימוש) אז זה צריך להיבדק עם הספרות לפני סינתזה. בדומה סינתזה פפטיד, התנאים מחשוף הסופי של peptoid את שרף יכול להיות מותאם גם עבור רצף מסוים. בפרוטוקול זה, קוקטייל מחשוף TFA שמש (עם triisopropylsilane ומים כמו אוכלי נבלות). Peptoids המוצג כאן הכיל רק הגנת בוק שהיא קבוצה יציבה סביר חומצה. כדי להבטיח המלא deprotection של רצפים עם חלק גדול יותר של שאריות מוגנות או חומצה מגינה פחות יציב קבוצות, פעמים מחשוף יותר עשויות להיות נחוצות (כלומר, פעמים מחשוף העולה על 2 שעות מומלצות רצפים המכילים PBF או-bu שליישוניםאסתר Tyl קבוצות מוגנות). נבלות אלטרנטיביות יכולות לשמש גם עבור רשתות בצד מיוחדות (למשל, ethanedithiol או 2-mercaptoethanol משמשים לעתים קרובות פפטידים שיש שרשרות צד המכיל גופרית כמו ציסטאין ומתיונין או). את assay הביולוגי המוצג הנו מבחן רעיל סטנדרטי אשר ניתן לשנות כדי להתאים שורות תאים שונות. חשוב לציין כי כל צלחת 96-היטב צריכה להכיל שולטת מספיק כדי לאפשר אמון התוצאות שהתקבלו. במקרה זה, B amphotericin משמש כביקורת חיובית כפי שהוא סם ידוע המשמש לטיפול במחלה DMSO משמש כביקורת שלילית כמו זו היא הממס המשמש לייצור מניות מתחמות עבור assay. אם שורות תאים אחרות נמצאות בשימוש, אלטרנטיבית, שולטת מתאימה יש לקבל ומאומתים לפני השימוש. L. מקסיקנה הוא מודגרות עם peptoid בריכוזים בין 100 ל 2 מיקרומטר עבור שעה אחת, ולאחר מכן הטפיל / פתרון peptoid הוא מדולל על ידיגורם של עשר עבור דגירת הלילה (כלומר, בארות בתחילה עם 100 מיקרומטר peptoid מניות מדוללות עד 10 מיקרומטר). מגיב כדאיות התא מתווסף כל טוב (10% של נפח היטב הכולל) בסוף assay. שינוי צבע גלוי נתפס בין בארות עם טפילי קיימא (ורוד), בארות שליטה ללא טפילי קיימא (כחול) ספקטרום בין עם מספרי ביניים של טפילי קיימא. הקרינה היא פרופורציונלית למספר של תאי חיים תואם את הפעילות המטבולית של התאים; צבע resazurin (לא ניאון) מומר resorufin ניאון על ידי תגובות צמצום תאים פעילים מבחינה מטבולית. 34 ב assay זה, זמן הדגירה עם מגיב כדאיות התא עבר אופטימיזציה עבור L. מקסיקנה. פעמי דגירה עם המגיב הכדאי ישתנה עבור צלחות זורעות בריכוזי תאים שונים או עם שורות תאים שונות (למשל שיטה זו יכולה לשמש גםעם בתאי יונקים). תלויים קורא צלחת המדויקת בשימוש, שיקולים צריכות להתבצע לפני מדידות קרינה נלקחות. כל בועות אוויר בבארות להסירו כדי להבטיח שניתן לנקוט קריאה מדויקת. חלק מקוראי הצלחת לקרוא מעומק הצלחות, ובמקרה תחתי שטוח 96 צלחות גם אמור לשמש. מכונות אחרות יכולות לקרוא מהחלק העליון של הצלחת, כך את המכסה של הצלחת צריכה להסיר לפני המדידה. לבסוף, בעתיד, פרוטוקול זה עשוי להתיישב עם סינתיסייזרים אוטומטיים המסוגלים ביצוע רצפים רבים במקביל. בנוסף, הסינתזה של peptoids מחזורית כמו כן ניתן בשיטה זו. פרוטוקול זה אמור לספק לחוקרים עם הליך סינטטי מעשיות שיכולים לשמש לגשת פיגומי peptoid רומן עם שני מונומרים lysine- ו ארגינין-סוג, אשר עשוי להיות שימוש ביישומים רבים, כוללים חומרים או שדות מרפאים.

Peptoids (או פולי N -substituted glycines) הם קבוצה של-mimetics פפטיד המציעים תכונות דומות לאלו של פפטידים וככזה נחקרות יותר ויותר עבור יישומים רפואיים וחומרים. בשנת פפטידים, שרשרת הצד של כל חומצת אמינו מחוברת פחמן-α של עמוד השדרה האמידה; ב peptoids הרשתות בצד מוזזים על אטום החנקן של עמוד השדרה. באופן מכריע, זה נותן peptoids עמידות גבוהה יותר בפני proteolysis. Peptoids מסונתז נפוץ בשיטת submonomer חלוץ ידי צוקרמן et al., שם מונומרים peptoid יכולים להיבנות על ידי haloacetylation הרציף של פונקציונליות אמינה צורף תמיכה מוצקה והעקירה הבאה של ההלוגן באמצעות אמין עיקרי. 1 הקבוצה שלנו פתחה לאחרונה הסתגלות לשיטה submonomer זו כדי לאפשר שאריות peptoid lysine- ו ארגינין-סוג להיכלל בתוך אותו רצף peptoid עבור first זמן. 2 גישה זו מוצק שלב ידנית peptoid סינתזה משתמשת ריאגנטים זמינים מסחרי וציוד מעבדה משותף, מה שהופך אותו לנגיש עבור רוב המעבדות. Peptoids הוכח צריך פעילויות מבטיחות נגד מגוון רחב של חיידקים גראם שליליים, מיני חיידקים ופטריות חיוביים גראם כי הם דומה פפטידים מיקרוביאלית ידועים רבים. 3-9 בעבודתנו, peptoids שמש תרכובות אנטי זיהומיות חדשות לטיפול של leishmaniasis המחלה הטרופי המוזנחת. Leishmaniasis 5,10 שכיח יותר מ -80 מדינות ברחבי העולם, ההערכה היא כי למעלה מ -12 מיליון בני אדם נדבקים באופן גלובלי. 11 המחלה נגרמת על ידי טפילים protozoan המועברות על ידי נשיכה של sandfly. מינים שושנת יריחו יכול לגרום leishmaniasis עורית, תנאי המוביל הצטלקות ופגיעה ריריות, או לנו זרים הקרביים מסכני חייםhmaniasis, הגורם לניזק איבר קטלני. אין חיסון זמין כעת למחלה זו וטיפולים קיימים להסתמך על מספר קטן של תרופות שיש להן תופעות לוואי חמורות. בנוסף, התנגדות לתרופות קיימות היא בעיה מתעוררת ורציני טיפולים חדשים כל כך זקוק נואשים לטיפול leishmaniasis ביעילות בעתיד. 12-16 ביישומים מיקרוביאלית אלה, peptoids נועדו לעתים קרובות להיות amphipathic בתערובת של קטיוני מונומרים הידרופובי. 3,4 זה יכול לתת peptoids מידה מסוימת של סלקטיביות לכיוון תאים חיידקיים, להפחית רעילות לתאי יונקים, וכדי לשפר את פעילותם מובילי מולקולרית . 17-20 רוב peptoids אנטי זיהומיות בספרות מכילות שרשרות צד קטיוני כי מורכבות בלעדיות של מונומרים מהסוג ליזין או פונקציונלי אמינו או שאריות מסוג ארגינין. מפלצות פפטיד-peptoid, שבו הרשתות קטיוני מורכבות אליזין או ארגינין חומצות מינו, גם היה מסונתז כדי לבחון את השפעת קבוצות קטיוני על פעילות ורעילות. 21-25 ניתן peptoids פולי-ליזין מסונתז בקלות באמצעות אמינים בוק מוגן זמינים מסחרית. Peptoids פולי-ארגינין דיווח יכול להתבצע באמצעות שיטה המשתמשת pyrazole-1-carboxamidine כסוכן guanidinylation. 18 עם זאת, זה יכול להתבצע רק לאחר peptoid כבר בקע מן השרף והגנת בוק על רשתות בצד סיר, כך כל שאריות ליזין מסוג בתוך הרצף הופכות שאריות ארגינין. במאמץ כדי לכוונן את מאפייני כימי וביולוגי של תרכובות, פיתחנו שיטה המאפשרת פונקציונליות קטיוני כפול (למשל, N ליס ו- N Arg) להיכלל בכל סדרה נתונה peptoid בפעם הראשונה. 2 בזאת, אנו מתארים את הסינתזה, טיהור ואפיון של two peptoids הרומן שמכילים הן שאריות lysine- ו ארגינין-סוג באותו רצף. השיטה משתמשת מאונך N -Boc ו- N -Dde הגנה על שרף עם pyrazole-1-carboxamidine בתור מגיב guanidinylation. ההערכה הביולוגית של peptoids אלה מתוארת גם מבחני cytotoxicity נגד שושנת יריחו מקסיקנה, הגורם הסיבתי של leishmaniasis עורית. זה מספק שיטה מעשית לגשת peptoids עם פונקציונליות קטיוני כפולה ועל מנת להעריך את פעילותם הביולוגית. צפוי כי שיטה זו תסייע לסינתזה של peptoids amphipathic ידי הקהילה peptoid בעתיד.

<table><tbody><tr><td>מחסניות מיצוי פאזה מוצקה מפוליפרופילן עם שתי מחסניות</td><td>Crawford Scientific</td><td>12131017 ו-12131015</td><td>20 מ"ל ו-6 מ"ל המשמשות בתכשיר זה</td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>טוקיו התעשייה הכימית (אירופה)</td> <td>T0431-100g</td><td>>98%; זהירות: עלול לגרום לכוויות חמורות ולגירוי בדרכי הנשימה</td></tr><tr><td>N,N'-diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td>><td>98%; זהירות: מסוכן לעיניים, לעור ובאמצעות שאיפת נשימה, עלול גם לגרום לרגישות</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>10346180 HPLC; זהירות: חשד לטרטוגן</td></tr><tr><td>אצטוגן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10407440</td> דיכלורומתאן פישר <td>בדרגת HPLC</td></tr><tr><td></td><td>10354263</td><td></td><td>99.8%; זהירות: חשד למסרטן</td></tr><tr><td>חומצה ברומקטית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>17000-100 גרם</td><td>>99%; זהירות: גורם לכוויות ומסוכן לעור, לעיניים ולדרכי הנשימה</td></tr> <tr><td>(S)-(-)-אלפא מתילבנזילאמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>115568-100G</td><td>98%; אזהרה: מזיק בבליעה, רעיל במגע עם העור, גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, משמש לסינתזה של מונומר Nspe</td></tr><tr><td>N-Boc 1,4-diaminobutane</td><td>Tokyo Chemical Industry (אירופה)</td> <td>A1373-25g</td><td>>98%; זהירות: גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, המשמש לסינתזה של מונומר NLys</td></tr><tr><td>N-Boc 1,2-diaminoethane</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1371-25g</td><td>>97%; זהירות: גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, המשמש לסינתזה של מונומר Nae</td></tr><tr><td>1,2-diaminobutane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D13208-100G</td><td>99%; זהירות: נוזל ואדים דליקים, מזיקים בבליעה או בשאיפה, רעילים במגע עם העור, גורמים לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, המשמשים בסינתזה של מונומר NhArg</td></tr><tr><td>1,4-diaminoethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td>><td>99.5%; זהירות: נוזל ואדים דליקים, מזיקים בבליעה או בשאיפה, רעילים במגע עם העור, גורמים לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים, המשמשים לסינתזה של מונומר NnArg &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1H-פיראזול-1-קרבוקסמידין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>402516-10G</td><td>בצורת מלח HCl; אזהרה: מזיק בבליעה ועלול לגרום לתגובה אלרגית בעור, גורם לנזק חמור לעיניים</td></tr><tr><td>Hydrazine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>דרגת ריאגנט; זהירות: חשוד כמסרטן, קטלני בשאיפה וגורם לכוויות קשות בעור ובעיניים</td></tr><tr><td>2-אצטיל דימדון</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>Rink שרף אמיד</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 רשת, טעינה גבוהה</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>>99.5%, חומר מבוקר, ולכן יש לקבל אישור מתאים לפני הרכישה; זהירות: נוזל ואדים דליקים מאוד, מזיקים בבליעה ורעילים במגע עם העור או בשאיפה, גורמים לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים, מזיקים לחיים במים עם השפעות ארוכות טווח</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781-50G</td><td>98%; זהירות: נוזל ואדים דליקים, גורמים לגירוי בעור ולגירוי חמור בעיניים</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>DAL1025</td><td>לא מסווג כמסוכן</td></tr><tr><td>מדיום חרקים של שניידר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S9895-1L</td><td>אבקה, יש להכין מדיום לפני השימוש בהתאם להוראות היצרנים; אפשר להתחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש במבחנים ביולוגיים</td></tr><tr><td>96 לוחות באר</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>תחתית שטוחה (כדי לאפשר מדידת פלואורסצנטיות מלמטה), מאגרי ממס שטופלו בתרבית רקמות</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>בשימוש עם פיפטה רב-ערוצית</td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה</td><td>Starlab Group</td><td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td><td>נפח הקצה תלוי בפיפטה המשמשת. 10&nbsp; ומיקרו; l, 10 - 200&nbsp; ומיקרו; l ו-1,000&nbsp; ומיקרו; l מומלץ לבדיקות</td></tr><tr><td>25 ס"מ3 צלוחיות תרבית תאים</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד (דרגת ביולוגיה מולקולרית)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D8418-50ML</td><td>לא מסווג כמסוכן</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מומת בחום</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>10082139-100 מ"ל</td><td>ג'יבקו</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמופישר&nbsp;</td><td>15140148-20 מ"ל</td><td>קיצור: P/S</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46006-100mg</td><td>Amphotericin B trihydrate, תקן אנליטי VetranalTM</td></tr></tbody></table>

שיטה יעילה עבור הסינתזה של peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה הידנית של פאזה מוצקה של פפטואידים ליניאריים המכילים שני מונומרים קטיוניים בעלי תפקוד שונה. בהליך זה ניתן לכלול מונומרים פפטואידים 'ליזין' פונקציונליים אמינו ופונקציונליים של גואנידו 'ארגינין' באותו רצף פפטואידי. הליך זה משתמש בהגנה על שרף (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) או Dde, תנאים אורתוגונליים להגנת Boc של מונומרים ליזין. ביטול ההגנה שלאחר מכן מאפשר תגובת גואנידינילציה יעילה על שרף ליצור את שאריות הארגינין. ההליך תואם את שיטת הסוב-מונומר הנפוצה לסינתזה פפטואידית, המאפשרת לייצר פפטואידים פשוטים באמצעות ציוד מעבדה נפוץ וריאגנטים זמינים מסחרית. מתוארת הסינתזה, הטיהור והאפיון המייצגים של שני פפטואידים מעורבים. מתוארת גם הערכת תרכובות אלו כנוגדי זיהום פוטנציאליים במבחני סקר נגד לישמניה. הטפיל הפרוטוזואי L. mexicana הוא גורם סיבתי ללישמניאזיס עורית, מחלה טרופית מוזנחת הפוגעת בעד 12 מיליון אנשים ברחבי העולם.

כתוצאה מכך נציג, סינתזה ואפיון של שני 12 peptoids שאריות המכיל שני מונומרים מסוג ליזין מונומרים סוג שני-ארגינין כל יתוארו. התוצאות הבאות מן assay cytotoxicity מוצגות גם. שני peptoids [(N nArg N SPE N SPE) (N AE N SPE N SPE)] 2 (א) ו- [(N hArg N SPE N SPE) (SPE N SPE N ליס N)] 2 (ב) היו מסונתז באמצעות 120 מ&quot;ג רינק אמיד שרף כל (טעינה = 0.79 מילימול / g). כל הצעדים acetylation ועקירה בוצעו כמתואר לעיל, עם כל ריאגנטים לרכוש מסחרית. שאריות אלה, אמינים הבאים שימשו בשלב עקירה: N SPE (S) - (-) - α-methylbenzylamine, N AE N - (-butoxycarbonyl טרט) -1,2-קוטרinoethane, N ליס N - (-butoxycarbonyl טרט) -1,4-diaminobutane. עבור השאריות הנגזרות ארגינין, את diamines המוגן הבא היו מצמיד: N hArg 1,4-diaminobutane או N nArg 1,2-diaminoethane, ואחריו הגנה על-שרפתי עם 2-acetyldimedone (DDE-OH). לאחר רצף כולה כבר מסונתז, הידרזין deprotection של DDE מניב אמינים חופשי guanidinylate. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" /> איור 1. מבנים Peptoid (א) [(N nArg N SPE N SPE) (N AE N SPE N SPE)] 2 ו (ב) [(N hArg N SPE N SPE) (N <stro<html> ng&gt; SPE ליס N SPE N)] 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" /> איור 2. השיטה לסנתז peptoids ארגינין / ליזין המעורב. אני. צעד עקירה רגיל בשיטת submonomer עם diamine; ii. תוספת של DDE-OH, 90 דקות להגן אמין בחינם; iii. תוספות בהמשך להאריך את שרשרת peptoid בשיטת submonomer; iv. Deprotection של DDE באמצעות הידרזין 2% ב DMF; . נ Guanidinylation של אמין בחינם על שרף עם pyrazole-1-carboxamidine ו DIPEA ב DMF; vi. מחשוף חומצי מן השרף deprotection של קבוצות בוק.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בעקבות מחשוף מן השרף lyophilization, המוצרים הגולמיים התקבלו אבקות לבנות: (א) 154 מ&quot;ג, (ב) 163 מ&quot;ג. מוצרים היו מטוהרים באמצעות RP-HPLC כמתואר עם 50 מקסימום זריקות מ&quot;ג באמצעות משאבת LC עם גלאי UV-VIS (λ = 250 ננומטר) על טור אנליטית, 250 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ, 5 מיקרומטר; קצב הזרימה = 2 מ&quot;ל / דקה. שברים המתאימים למסת היעד אוחדו וקבלו כמו אבקות לבנות: (א) 54 מ&quot;ג (ב) 65 מ&quot;ג, תשואות סופיות של כ 30% לשברים&gt; 90% טהורים. זהויות התרכובת הסופיות לאחר הטיהור אושרו על ידי LC-MS (ראה איור 3) באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש מצויד UPLC וגלאי photodiode מערך. ספקטרומטריית מסה מדויקת התבצעה באמצעות אותו ספקטרומטר על t<html> הוא [M + 2H] 2 + יונים. המשפט שלהלן מחושב והמוני נצפה נמצאו הסכם קרוב (איור 4): (א) מחושבים = 896.0026 האמו, ציינו = 896.0038 האמו; (ב) מחושב = 952.0691 האמו, ציין = 952.0730 האמו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" /> איור 3. LC-MS עבור peptoids מטוהרים. (א) m / z = 1,792 ו- (ב) m / z = 1,903. איפה החלק העליון הוא TIC, ספקטרום LC-MS באמצע, הכרומתוגרמה UV התחתון ב 220 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" /> איור 4. נתונים ספקטרומטריית מסה מדויק עבור peptoids (א) ו- (ב).&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. טוהר מוצרים הוערכה באמצעות (משאבת LC עם גלאי UV-VIS על טור אנליטית, 4.6 מ&quot;מ x 100 מ&quot;מ, 3.5 מיקרומטר; קצב הזרימה = 1 מ&quot;ל / דקה) אנליטי RP-HPLC, ו דמיינו ב 220 ננומטר, ספיגת עמוד השדרה של אמיד. איור 5 א ו 5 ב מראה כי תרכובות הם הומוגניים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" /> איור 5. HPLC אנליטי עבור peptoids המטוהר (א) ו- (ב). ישנו B 0-100% שיפוע מעל 30 דקות, בתנור טור ב 40 ° C (A = 95% H 2 O, 5% MeCN, 0.05 TFA%;. B = 95% MeCN, 5% H 2 O, 0.03% TFA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">אנא CL</a>איכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. Peptoids המטוהר (א) ו- (ב) נבדק מבחני cytotoxicity נגד L. מקסיקנה amastigotes axenic. מניות קפוא של L. מקסיקנה היו מופשרת והפכה לבמת amastigote המוכנה עבור assay. 72 שעות לאחר ההפשרה, הטפילים צריכים להיות promastigotes הבמה חרקים בצורתם procyclic, בשלב יומן עם תאי מתחלקים רבים. בשלב זה טפילים ניתן להפוך בשלב amastigote באמצעות שינוי pH וטמפרטורה תיאר. 27 ביום 9 של טרנספורמציה, הטפילים יהיה בשלב promastigote metacyclic זיהומיות שאינם משכפלים. לבסוף ב יום 14, הטפילים צריכים להיות בשלב amastigote פתוגניים שבו טפילים חסרי שוטונים המאפיין של promastigotes. 28 5 פתרונות מניות מ&quot;מ של תרכובות נעשו בכיתה תרבית תאים DMSO ונבדקו triplicates עלמינימום של שני מקרים על מנת להבטיח מערך נתונים חזק נאסף. תוכנית צלחת 96-היטב נציג מוצג באיור 6. בסוף assay, מגיב כדאיות התא התווסף היטב כל הקרינה נמדדה כמתואר לחשב את הכדאיות של טפילים בכל ריכוז נבדק (ראה איור 7 ). ערכים 50 ED חושבו peptoid (א)&gt; 100 מיקרומטר ו peptoid (ב) 37 מיקרומטר בהתאמה. ברי השגיאה זממו, להראות את השונות בין בארות כמו סטיית תקן וזה ניתן לראות כי אלה הם סבירים עבור רוב והברים. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" /> איור 6. תוכנית צלחת גם נציג 96 עבור assay cytotoxicity על 2 פתרונות peptoid (כולל בקרות חיוביות ושליליות). Med + = בינוני (Medium חרקים שניידר, pH 5.5, 20% FBS, 1% P / S). ל MEX. =8 x 10 6 / מ&quot;ל התרבות הטפיל + med. AmphoB = 5 מ&quot;מ ב DMSO. Peptoid = 5 מ&quot;מ מניות פתרון ב DMSO. בארות ריקות אמורות להכיל מים סטריליים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" /> איור 7. תוצאות assay cytotoxicity נגד L. טפילי amastigote axenic מקסיקנה באמצעות peptoid (א) ו- (ב). ניתן לראות כי peptoid (ב) הוא יעיל יותר מאשר peptoid (א) לצמצם את אחוז טפילי קיימא, עם שני תרכובות שפעה תלויה במינון. ברי השגיאה זממו להראות את השונות בין בארות כמו סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מוצג פרוטוקול לסינתזה של פפטואידים בעלי פונקציונליות קטיונית מעורבת באותו רצף (מונומרים מסוג ליזין וארגינין). מתוארת גם בדיקה עוקבת של תרכובות אלה נגד Leishmania mexicana, הטפילים הפרוטוזואיים הגורמים ללישמניאזיס עורית.

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר מונומרים מסוג ליזין וארגינין באותה רצף פפטואידי, ולהעריך את פעילותם של תרכובות אלה נגד Leishmania mexicana, הטפילים הגורמים למחלה הטרופית המוזנחת לישמניאזיס עורי. קיים צורך דחוף בטיפולים חדשניים עבור לישמניאזיס עורי, ופרוצדורה זו יכולה לסייע בזיהוי ופיתוח של פפטואידים כמחלקה חדשה של חומרים אנטי-אינפקטיביים פוטנציאליים למחלה טרופית מוזנחת זו. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שניתן לסנתז פפטואידים המכילים פונקציונליות קטיונית מעורבת.דבר זה רצוי מאוד שכן הוא יכול לסייע בוויסות של הפעילויות הביולוגיות של הרצפים. למרות שבדיקה זו מבוצעת נגד הצורה היונקית של הטפיל, ניתן להשתמש בה גם נגד שלב החרק של Leishmania mexicana או להחילה אותה על שורות תאים של יונקים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא שימושית מאוד מכיוון שהיא מראה את אופי הסינתזה השלב-אחרי-שלב וכן את תרבית הטפיל בנקודות שונות במחזור החיים של Leishmania mexicana.כדי להתחיל בהליך זה, הכין תמיסות ב-dimethylformamide כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף 0.1 millimoles של שרף rink amide מוגן ב-Fmoc לכלי תגובה מפוליפרופילן בנפח 20-milliliter בעל פקק ושני מסנני פריט (frits). הוסף חמישה milliliters של dimethylformamide והשאר את הכלי למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, נקו את ה-DMF באמצעות פלטפורמת ואקום להפקה ממוצק (solid phase extraction). בשלב הבא, הוסיפו 2 mL של תמיסת piperidine שהוכנה מראש. הניחו את הכלי על פלטפורמת ניעור במהירות של 450 RPM בטמפרטורת החדר ונערו במשך חמש דקות.רוקנו את התמיסה באמצעות תחנת ואקום. לאחר מכן, הוסיפו 2 mL של תמיסת piperidine ונערו באותם תנאים למשך 15 דקות. עם סיום הניעור, רוקנו את התמיסה באמצעות תחנת ואקום.הוסיפו שני milliliters של DMF וערבבו למשך 30 שניות כדי לשטוף את הסורבן. רוקנו את ה-DMF וחזרו על השטיפה שלוש פעמים. כדי להתחיל בסנתזת הסוב-מונומר, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת bromoacetic acid שהוכנה ו-0.2 milliliters של תמיסת DIC שהוכנה.נערה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שפכו את התמיסה ושטפו שלוש פעמים באמצעות 2 mL של DMF בכל פעם. הוסיפו 1 mL של תמיסת אמין שהוכנה מראש.לאחר מכן, נער את השרף למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. נקז את התמיסה ושטוף את השרף שלוש פעמים באמצעות 2 mL של DMF בכל פעם. לאחר מכן, הוסף 1 mL של תמיסת ברומואצטית (bromoacetic acid) ו-0.2 mL של תמיסת DIC.נערה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לנקז את התמיסה ולשטוף שלוש פעמים באמצעות 2 mL של DMF בכל פעם. כדי להחדיר מונומר עם פונקציונליזציית גואנידין, הוסף 1 mL של תמיסת דיאמין לא מוגנת לשרף.נערה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שפכו את התמיסה ושטפו את השרף עם שני מיליליטר של DMF שלוש פעמים. הוסיפו 0.5 מיליליטר של תמיסת 2-acetyl dimedone שהוכנה.נער하시오 במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, רוקנו את התמיסה ושטפו את השרף עם שני מיליליטר של DMF שלוש פעמים. המשיכו בסינתזת הסוב-מונומר עד להשגת הרצף הרצוי.לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של תמיסת hydrazine מוכנה ונערעו במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. רוקנו את התמיסה וחזרו על הפעולה שלוש פעמים. לאחר מכן, שטפו את השרף שלוש פעמים באמצעות שני מיליליטרים של DMF לכל שטיפה.הוסיפו DIPEA ושש מולקולות שוות של pyrazole-1-carboxamidine עבור כל אמין חופשי ברצף הפפטואיד. נערעו למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. עם סיום הניעור, רוקנו את התמיסה.שטפו את הסומך שלוש פעמים באמצעות 2 mL של dichloromethane לכל שטיפה. ייבשו את הסומך באוויר למשך 10 דקות ואחסנו לשימוש עתידי. ניתן לבצע ניסוי של ניתוק (cleave) לאחר הוספת האמינים כדי לבדוק את התקדמות הסינתזה.כדי להתחיל את השלב הסופי של הניתוק, יש להוסיף ארבעה milliliters של תמיסת ניתוק (cleavage cocktail) לאותה קסוכת תגובה מסוננת ששימשה לסנתזה ולכסות את הכלי. יש לנער במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, באמצעות קסוכת התגובה המסוננת, יש לסנן את תמיסת הניתוק מהשרף לתוך בקבוק תחתית עגולה.יש לאדות את תערובת הניתוק (cleavage cocktail) באמצעות אידור סיבובי (rotary evaporator). הוסף 2 mL של דיאתיל אתר (diethyl ether) אנאידרי כדי להשקיע את הפפטואיד. הסר את הדיאתיל אתר באמצעות פיפטה והשלך אותו.לאחר מכן, חזור על תהליך השקיעה בדיאתיל אתר שלוש פעמים. עם השלמת השקיעה, המס את הפפטואיד הגולמי ב-10 milliliters של תמיסת אצטוניטריל ומים מחמיצים שהוכנה מראש. העבר את התמיסה למכל שנשקל מראש.לאחר מכן, הקפיאו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס ועבדו בליופיליזציה ( Freeze-drying) לאבקה יבשה המוכנה לטיהור באמצעות HPLC פאזה הפוכה. לאחר גידול של טפילי *Leishmania mexicana* והמרתם לשלב האמסטיגוט האקסני, התחילו את בדיקת הפעילות הציטוטוקסית על ידי הכנת תמיסות סטוק של התרכובות כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. הוסיפו שני מיקרוליטרים של תמיסת סטוק פפטואיד בריכוז 5 מילימולר, ביקורת amphotericin B וביקורת DMSO לשורה העליונה של פלטת 96 בארות, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.באמצעות פיפט רב-ערוצי, העבירו 48 µL של מצע טרי לשורה העליונה. העבירו 25 µL של מצע טרי לכל שאר השורות. לאחר מכן, בצעו דילול סדרתי על ידי העברת 25 µL של תמיסה מהשורה העליונה, הוספתה לשורה שמתחתיה וערבוב.חזרו על הדילול עבור כל הפלטה, תוך השלכת 25 µL האחרונים שנשאבו מהשורה התחתונה. לאחר מכן, העבירו תרבית טפילים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 mL. צנטריפוגו למשך חמש דקות ב-447 ×g.שפכו את המצע הישן והוסיפו 10 milliliters של מצע טרי. לאחר מכן, באמצעות פיפטה, השביו בעדינות את משקע הטפילים במצע החדש. ספרו באמצעות hemocytometer משופר מסוג Neubauer ודללו את התרבית לשמונה מיליון טפילים ל-milliliter.לאחר דילול התרבית, יש להוסיף 25 µL של טפילים לכל באער. יש לדגור את הפלטה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 32 °C. עם סיום הדגירה, יש להוציא 40 µL מהתמיסה מכל באער.הוסף 90 µL של מצע טרי לכל באר והדגר בטמפרטורה של 32 °C למשך 24 שעות. לאחר מכן, הוסף 10 µL של תמיסה לבדיקת חיות תאים מבוססת רזאזורין לכל באר. הדגר בטמפרטורה של 32 °C למשך ארבע שעות.לאחר השלמת האינקובציה, השתמשו בקורא לוחיות למדידת הפלואורסצנציה. נתחו את הנתונים על ידי הסרת הרקע הממוצע והשוואת הפלואורסצנציה של הבארות לאחר נורמליזציה ביחס לבקרי ה-DMSO. במחקר זה, שתי פפטואידים סונתזו תוך שימוש ב-120 milligrams של rink amide resin לכל אחת.המוצרים מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה בפאזה הפוכה (reverse-phase HPLC), ופרקציות התואמות למסה המטרה מאוגדות ומתקבלות כאבקות לבנות. הכמות שנאספה עבור שני הפפטואידים מוצגת כאן, עם תשואות של כ-30% עבור פרקציות בדרגת טוהר של מעל 90%.ניכר כי שני הפפטואידים הם הומוגניים. התוצאות המייצגות של בדיקות הציטוטוקסיות נגד L Mexicana מוצגות כאן. תמיסות סטוק של התרכובות בריכוז 5 mM הוכנו ב-DMSO בדרגת תרבית תאים, ונבדקו בשלוש חזרות לפחות פעמיים כדי להבטיח נתונים מהימנים.ניתן לראות כי פפטואיד B יעיל יותר מפפטואיד A בהפחתת אחוז הטפילים החיים, כאשר לשניהם יש השפעה תלוית-מינון. לאחר צפייה בשיטה זו, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מסנתזים, מאפיינים ומטהרים פפטואידים המכילים מונומרים מסוג ליזין ומסוג ארגינין, וכיצד להשתמש בהם בבדיקות ציטוטוקסיות נגד Leishmania mexicana. השיטה שלנו להוספת פונקציונליות קטיונית כפולה לפפטואידים מוסיפה רק שלב פשוט אחד נוסף לשיטת הסב-מונומר הנפוצה לסינתזת פפטואידים.בעקבות שיטה זו, ניתן להוסיף סוב-מונומרים מסוג לזין או ארגינין באורכים שונים כדי לסייע בהגברת גיוון הספריה, לדוגמה, עם שרשראות צד באורך של שני עד שישה פחמנים. בעת ביצוע הסינתזה של הפפטואיד, חשוב מאוד לזכור לשטוף היטב את הסורבנט (resin) בין השלבים כדי למנוע תוצרי הוספה או מחיקה לא רצויים. שיטה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים לבחון את הפעילות הביולוגית של פפטואידים עם פונקציונליזציה קטיונית מעורבת, ולהשוות פעילות זו לזו של פפטואידים המכילים מונומרים מסוג לזין או ארגינין באופן בלעדי.לבסוף, אין לשכוח כי הטפילים ומספר מהריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה עלולים להיות מסוכנים ביותר. לכן, חשוב להשתמש תמיד בציוד מגן אישי הולם ולעבוד בתוך מנדף כימי או במabilis בטיחות מיקרוביולוגי במידת הצורך.

an-efficient-method-for-synthesis-peptoids-with-mixed-lysine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Peptoid פשוטה בכלל ידנית סינתזה שיטה מעורבים ציוד בסיסי ריאגנטים זמינים מסחרית הוא התווה, המאפשר peptoids להיות מסונתז בקלות ברוב המעבדות. סינתזה, טיהור ואפיון של 36mer peptoid amphiphilic מתואר, כמו גם הרכבה עצמית שלה לתוך הפערים הורה nanosheets.

מוצק שלב Submonomer סינתזה של פולימרים Peptoid שלהם ואת הרכבה עצמית לתוך מאוד מסודרים Nanosheets

סינתזה יעילה מוצק בשלב פפטיד של trimer BIS-peptide פונקציונליות ניצול "בטיחות לתפוס" הליך מחשוף שרף HMBA מתואר.

סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש &quot;בטיחות תפוס&quot; מתודולוגיה

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא superfamily של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים, peptoids ופפטידים מפוגלים-N. כאן אנו מתארים שיטה סינתטית המשלבת את שניהם מפוצלת וברכה ואסטרטגיות תת מונומר לסנתז ספרייה חד מתחם אחד אגל PTAs.

סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

ניתן להשתמש במערכי פפטידים המסונתזים בשיטת SPOT כדי לנתח את ספציפיות הסובסטרט של חלבון ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) ולהגדיר את ספקטרום הסובסטרט של PKMTs כדי להבין את תפקידם הביולוגי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לסנתז מערכי פפטידים, לבצע מתילציה שלהם עם PKMTs ולנתח את התוצאות.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

מתוארת שיטה פשוטה וכללית לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות הקרנת מיקרוגל. הליך זה מאפשר סינתזה של פפטידים מחזוריים של עמוד השדרה עם אוסף של קונפורמציות שונות תוך שמירה על שרשראות הצד והחלקים הפרמקופוריים., ולכן מאפשר לסנן את הקונפורמציה הביו-אקטיבית.

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

כאן, המחברים מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל להגדרת אפיטופ אנטיגני ליניארי באמצעות נוגדן חד שבטי מטוהר וסריקת פפטידים באמצעות הכלאה של כתמי נקודות. לאחר מכן ניתן להשתמש באפיטופ שזוהה ביישומים טיפוליים ואבחנתיים.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

פרוטוקול המתואר לסינתזה ידנית של oligo-peptoids ואחריו רצף ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה.

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

הסינתזה של חומרים פעילי שטח פפטיד מבוססי פוליאמין (PPAs) הוא אתגר משמעותי בשל נוכחותם של nitrogens אמין מרובים, אשר דורשת שימוש מושכל של הגנה על קבוצות כדי להסוות את תגובתי פונקציות אלה. בנייר זה, אנו מתארים שיטה נתיישב עבור הכנת אלה סוג חדש של מולקולות וההספק עצמית.

פרוטוקול נתיישב לסינתזה של הרכבה עצמית מבוסס פוליאמין פפטיד חומרים פעילי שטח (PPAs), Biomaterials קשורים

פרוטוקול מוצג לסינתזה של תרופות מקודד מידע ועבור הרכבה עצמית מכוונת של הפטואידים האלה לתוך סולמות מולקולריים באמצעות אמינים ו-aldehydes כזוגות דינמיים בעלי הקשר הדינמי, לואיס חומצי נדיר-אדמה triflates מתכת כריאגנטים רב תפקידים.

סינתזה של מידע-מיסב פטואידים והרכבה עצמית בימוי דינמי

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ללא תאים לייצור פרוטאוליפוזום באיכות גבוהה בשיטת דו-שכבתית-דיאליזה באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה וליפוזומים. שיטה זו מספקת אמצעים מתאימים לניתוח פונקציונלי של חלבוני ממברנה, סינון מטרות תרופות ופיתוח נוגדנים.

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור והערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית והציטוטוקסיות של הפפטיד הקטיוני Mel4 ושל הפפטיד המדמה RK758. על ידי שילוב סינתזה כימית, ביטוי רקומביננטי ובדיקות פונקציונליות סטנדרטיות, הוא מספק תהליך עבודה יעיל לייצור ובדיקה של פפטידים וחיקוי מולקולות קטנות.

ייצור ובדיקות של פפטידים אנטימיקרוביאליים והחיקויים שלהם

למד סינתזת פפטואידים עם פונקציונליות קטיונית מעורבת ממונומרי ליזין וארגינין לטיפול בלישמניה מקסיקנה. שיטה זו מציגה יתרון בפיתוח תרופות חדשות למחלות טרופיות מוזנחות.

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

גלה סרטונים נוספים