שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכניס מונומרים מסוג ליזין וארגינין לאותו רצף פפטואידים ולהעריך את הפעילות של תרכובות אלה כנגד Leishmania mexicana, הטפילים הסיבתיים למחלה הטרופית המוזנחת לישמניאזיס עורית. יש צורך דחוף בטיפולים חדשים ללישמניאזיס עורית, והליך זה יכול לסייע בזיהוי ופיתוח פפטואידים כסוג חדש של נוגדי זיהום פוטנציאליים למחלה טרופית מוזנחת זו. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שניתן לסנתז פפטואידים המכילים פונקציונליות קטיונית מעורבת.

זה רצוי מאוד מכיוון שהוא יכול לעזור לווסת את הפעילות הביולוגית של הרצפים. למרות שזה בודק את צורת היונקים של הטפיל, ניתן להשתמש בו גם נגד שלב החרקים של Leishmania mexicana או ליישם אותו על קווי תאים של יונקים. הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מאוד מכיוון שהיא מראה את האופי ההדרגתי של הסינתזה וגם את תרבות הטפילים בנקודות שונות במחזור החיים של Leishmania mexicana.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסות בדימתילפורממיד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף 0.1 מילימול של שרף אמיד זירת החלקה מוגן FMOC לכלי תגובה פוליפרופילן מכוסה בנפח 20 מיליליטר עם שני פריטים. מוסיפים חמישה מיליליטר דימתילפורממיד ונותנים לכלי לעמוד 60 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, רוקנו את ה-DMF באמצעות פלטפורמת ואקום של מיצוי פאזה מוצקה. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של תמיסת פיפרידין מוכנה. הנח את הכלי על פלטפורמת שייקר ב-450 סל"ד בטמפרטורת החדר ונער במשך חמש דקות.

מסננים את התמיסה באמצעות תחנת הוואקום. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר תמיסת פיפרידין ונערו באותם תנאים למשך 15 דקות. לאחר השלמת הטלטול, יש לנקז את התמיסה באמצעות תחנת ואקום.

מוסיפים שני מיליליטר DMF ומערבבים במשך 30 שניות כדי לשטוף את השרף. מסננים את ה-DMF וחוזרים על הכביסה שלוש פעמים. כדי להתחיל בסינתזה תת-מונומר, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חומצה ברומואצטית מוכנה ו -0.2 מיליליטר תמיסת DIC מוכנה.

לנער במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מסננים את התמיסה ושוטפים שלוש פעמים באמצעות שני מיליליטר DMF בכל פעם. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת אמין מוכנה.

לאחר מכן, יש לנער את השרף למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. מסננים את התמיסה ושוטפים את השרף שלוש פעמים באמצעות שני מיליליטר DMF בכל פעם. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חומצה ברומואצטית ו -0.2 מיליליטר תמיסת DIC.

לנער במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מסננים את התמיסה ושוטפים שלוש פעמים באמצעות שני מיליליטר DMF בכל פעם. כדי להציג מונומר פונקציונלי גואנידין, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת דיאמין לא מוגנת לשרף.

לנער במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מסננים את התמיסה ושוטפים את השרף עם שני מיליליטר DMF שלוש פעמים. הוסף 0.5 מיליליטר תמיסת דימדון מוכנה של 2 אצטיל.

לנער במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מסננים את התמיסה ושוטפים את השרף עם שני מיליליטר DMF שלוש פעמים. המשך בסינתזה של תת-מונומר עד ליצירת הרצף הרצוי.

לאחר מכן, מוסיפים ארבעה מיליליטר תמיסת הידרזין מוכנה ומנערים שלוש דקות בטמפרטורת החדר. מסננים את התמיסה וחוזרים על הפעולה שלוש פעמים. לאחר מכן, שטפו את השרף שלוש פעמים באמצעות שני מיליליטר DMF לכל שטיפה.

הוסף DIPEA ושישה מקבילים של פיראזול-1-קרבוקסמידין לכל אמין חופשי ברצף הפפטואידים. לנער במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלמת הטלטול, יש לנקז את התמיסה.

שוטפים את השרף שלוש פעמים בעזרת שני מיליליטר דיכלורומתאן לכל שטיפה. יבש את השרף באוויר למשך 10 דקות ואחסן לשימוש עתידי. ניתן לבצע חריץ בדיקה לאחר תוספות אמין כדי לבדוק את התקדמות הסינתזה.

כדי להתחיל את המחשוף הסופי, הוסף ארבעה מיליליטר של קוקטייל מחשוף לאותה מחסנית תגובה פריטית המשמשת לסינתזה וכסה את הכלי. לנער במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעזרת כלי התגובה המצועצע, מסננים את קוקטייל המחשוף מהשרף לבקבוק עם תחתית עגולה.

אידוי קוקטייל המחשוף באמצעות מאייד סיבובי. הוסף שני מיליליטר של אתר דיאתיל נטול מים כדי לזרז את הפפטואיד. בעזרת פיפטה, הסר את אתר הדיאתיל והשליך.

לאחר מכן, חזור על משקעי האתר הדיאתיל שלוש פעמים. לאחר השלמת המשקעים, ממיסים את הפפטואיד הגולמי ב -10 מיליליטר של אצטוניטריל מוכן ותמיסת מים מחומצת. מעבירים לכלי שקול מראש.

לאחר מכן, מקפיאים במינוס 20 מעלות צלזיוס ועוברים ליופיליזציה לאבקה יבשה מוכנה לטיהור על ידי HPLC בשלב הפוך. לאחר תרבית טפילי Leishmania mexicana וטרנספורמציה לשלב האמסטיגוט האקסני, התחל את בדיקת הציטוטוקסיות על ידי הכנת תמיסות מלאי תרכובות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת מלאי פפטואידים של חמישה מילי-מולריות, בקרת אמפוטריצין B ובקרת DMSO לשורה העליונה של לוח של 96 בארות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 48 מיקרוליטר של מדיום טרי לשורה העליונה. הוסף 25 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל השורות האחרות. לאחר מכן, בצע דילול סדרתי על ידי פיפטינג של 25 מיקרוליטר של תמיסה מהשורה העליונה, הוספתו לשורה למטה וערבוב.

חזור על הדילול עבור כל הצלחת והשליך את 25 המיקרוליטרים האחרונים שנזרקו מהשורה התחתונה. לאחר מכן, העבירו תרבית טפילים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. צנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 447 פעמים גרם.

יוצקים את המדיום הישן ומוסיפים 10 מיליליטר מדיום טרי. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, השעו בעדינות את גלולת הטפילים במדיום החדש. ספירה באמצעות נויבאואר שיפרה את ההמוציטומטר ודיללה את התרבית לשמונה מיליון טפילים למיליליטר.

לאחר דילול התרבות, הוסיפו 25 מיקרוליטר טפילים לכל באר. דוגרים את הצלחת למשך 60 דקות בחום של 32 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הדגירה, הסר 40 מיקרוליטר של תמיסה מכל באר.

הוסיפו 90 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל באר ודגרו בחום של 32 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת כדאיות תאים מבוססת רזזורין לכל באר. דגירה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

לאחר השלמת הדגירה, השתמש בקורא צלחות כדי למדוד את הקרינה. נתח את הנתונים על ידי הסרת הרקע הממוצע והשוואת הקרינה של בארות לאחר נורמליזציה עם כריתה לבקרות DMSO. במחקר זה, שני פפטואידים מסונתזים באמצעות 120 מיליגרם של שרף אמיד זירת החלקה כל אחד.

המוצרים מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה בשלב הפוך, ושברים המתאימים למסת היעד משולבים ומתקבלים כאבקות לבנות. הכמות שנאספה עבור שני הפפטואידים מוצגת כאן עם יבול של כ-30% עבור שברים מעל 90% טהורים. טוהר המוצר מוערך באמצעות HPLC אנליטי בשלב הפוך ומוצג ב-220 ננומטר, הספיגה של עמוד השדרה של האמיד.

שני הפפטואידים נראים הומוגניים. התוצאות המייצגות של מבחני הציטוטוקסיות כנגד L Mexicana מוצגות כאן. תמיסות מלאי של חמישה מילי-מולרים של התרכובות מיוצרות ב-DMSO בדרגת תרבית תאים ונבדקות בשלוש פעמים לפחות פעמיים כדי להבטיח נתונים חזקים.

ניתן לראות כי פפטואיד B יעיל יותר מפפטואיד A בהפחתת אחוז הטפילים הקיימים, כאשר לשניהם יש השפעה תלוית מינון. לאחר צפייה בשיטה זו, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז, לאפיין ולטהר פפטואידים המכילים גם מונומרים מסוג ליזין וגם מסוג ארגינין וכיצד להשתמש בהם במבחני ציטוטוקסיות נגד לישמניה מקסיקנה. השיטה שלנו להוסיף פונקציונליות קטיונית כפולה לפפטואידים מוסיפה רק צעד אחד פשוט נוסף לשיטת התת-מונומר הנפוצה של סינתזת פפטואידים.

בעקבות שיטה זו, ניתן להוסיף תת-מונומרים מסוג ליזין או ארגינין באורכים שונים כדי לעזור להגדיל את מגוון הספרייה, למשל, עם שרשראות צד באורך של שניים עד שישה פחמנים. בזמן ניסיון הסינתזה הפפטואידית, חשוב מאוד לזכור לשטוף היטב את השרף בין השלבים כדי למנוע הוספה או מחיקה לא רצויים של מוצרים. שיטה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור את הפעילות הביולוגית של פפטואידים מעורבים בעלי תפקוד קטיוני ולהשוות פעילות זו לאלה המכילים מונומרים מסוג ליזין או ארגינין באופן בלעדי.

לבסוף, אל תשכח שהטפילים וכמה מהריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה יכולים להיות מסוכנים ביותר. לכן, חשוב להשתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים ולעבוד בתוך קולט אדים או ארון בטיחות מיקרוביולוגי במידת הצורך.