Hyperpolarized ¹³ ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית מטבולית C והדמיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע היפרפולזציה של מולקולות המסומנות בפחמן 13 באמצעות קיטוב גרעיני דינמי, ולמדוד את ההמרה האניזמטית שלהן באמצעות תהודה מגנטית של פחמן 13, הדמיה רטרוסקופית, במבחנה. שיטה זו מגדילה את אות התהודה של הפחמן פי 10,000 עד 100,000, ומאפשרת להבחין בין התרכובות השכבתיות לבין התוצרים המטבוליים שלהן, ולהתמקם בגוף על ידי הדמיה. היתרון העיקרי של שיטה זו, בהשוואה למשל, לטכניקות VR, הוא שהיא מספקת מבט על חילוף החומרים של חומרים טבעיים באורגניזמים חיים בזמן אמת.

כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חילוף החומרים של סרטן וכפי שהוא במבחנה. ניתן ליישם אותו גם על מודלים של בעלי חיים ומטופלים אנושיים. היישום של טכניקה זו עולה על לוקליזציה של הגידול.

ניתן להשתמש בו כדי למצוא ולהבחין בין תת-סוגים של גידולים מטבוליים, ולעקוב אחר הטיפול לצד טכניקות מתקדמות. כדי להתחיל בהליך, הכינו תחילה תמיסה של מילי-מולרית אחת של גדוטראט מגלומין, ופירובט מרוכז 13 פחמן אחד. הוסף לתערובת טריטיל רדיקל OX063 כדי להשיג ריכוז סופי של 15 מילימולרית ולהמיס אותה לחלוטין.

בתוכנת DNP Polarizer, לחץ על Cool Down'כדי להפחית את הטמפרטורה של תוספת הטמפרטורה המשתנה, או VTI, מתחת ל-1.4 קלווין. לאחר שה-VTI התקרר, הניחו כשמונה מיקרוליטר מתמיסת הדגימה המסומנת בפחמן 13 בכוס דגימת פלסטיק. חבר את הכוס למוט הכנסת הדגימה.

בתוכנה, לחץ על הכנס מדגם'בחר מדגם רגיל'ולאחר מכן הבא'זה מעלה את מחזיק המדגם ופותח את שסתומי הכניסה ל-VTI, ומאפשר הכנסת דגימה. בהנחיה, השתמש במוט ההחדרה כדי לדחוף את הדגימה לתוך ה-VTI. נתק את הדגימה ומשוך בזהירות את מוט ההחדרה.

ודא שהדגימה נותקה מהמוט ולא נדחפה החוצה מה-VTI במהלך הליך הסגירה. לחץ על הבא'כדי לסגור את השסתומים ולהוריד את הדגימה להליום הנוזלי, ולאחר מכן לחץ על סיום'כדי למצוא תדר קיטוב אופטימלי, הפעל תחילה את תוכנת RINMR. במסך התצורה, לחץ על בחר מדגם'ובצע מיקרו ניקוי'צור את הקובץ שבו יאוחסנו הנתונים.

חזור לתוכנת DNP Polarizer. בחר בכרטיסייה כיול, הגדר את הפרמטרים של טאטוא המיקרוגל ולאחר מכן התחל את תהליך ניקוי המיקרוגל. לאחר סיום טאטוא המיקרוגל, שימו לב לתדר עם משרעת אות נמדדת מקסימלית.

חזור לתוכנת RINMR ובחר Solid Build Up'לאחר מכן, בתוכנת DNP Polarizer, לחץ על Polarization'הזן את תדר המיקרוגל האופטימלי ואת ההספק. לחץ על הבא'אפשר ניטור הצטברות קיטוב' ולחץ על סיום'קטב את הדגימה למשך זמן מספיק כדי להשיג קיטוב של מעל 95%. במהלך הקיטוב, חבר בקבוק איסוף לצינור הפליטה של דגימת ההיפרפולרייזר, והנח אותו ליד הספקטרומטר.

הגדר ספקטרומטר NMR של טסלה אחת עם סדרת סריקת פחמן 13 של פולסי RF של 110 מעלות במרווחים של שלוש שניות. במהלך קיטוב פירובט, התחל בהכנת תרבית תאים. הסר את מדיום התא מצלוחיות תרבית התאים.

שטפו את התאים עם כ -10 מיליליטר מי מלח עם חוצץ פוספט. הוסף חמישה מיליליטר טריפסין לבקבוק התרבות. דגרו על התרבית למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השביתו את הטריפסין עם כחמישה מיליליטר של מדיום F12K המכיל 10% סרום עגל עוברי בנפח.

לאחר מכן, העבירו את נפח תרחיף התאים המכיל את מספר התאים הרצוי לצינור צנטריפוגה מפלסטיק. צנטריפוגה את דגימת התא ב-1200 גרם למשך חמש דקות. השליכו את ה-supernatant ותלו מחדש את המזרן במדיום F12K מספיק עם 10% FCS כדי להשיג נפח סופי של 800 מיקרוליטר.

העבירו את המתלה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, והניחו את הצינור במיכל פלסטיק מלא במים חמים. כדי להתחיל באיסוף נתונים באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית פחמן 13, לאחר הכנת דגימת התא וקיטוב הפירובט גדול מ-95 אחוזים, לחץ על הפעל פירוק בתוכנת DNP Polarizer. טען את נפח הפירוק של חומר הפירוק דרך השסתום העליון של תא הפירוק.

העבר את מקל הפירוק למצב פעיל. אשר על ידי לחיצה על הבא'לאחר שדגימת התא מוכנה לניסוי, לחץ על סיום' בתוכנת DNP Polarizer כדי לאתחל את תהליך הפירוק. המתן עד לסיום תהליך הפירוק.

הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת הפירובט ההיפרפולרית ל-800 מיקרוליטר של דגימת התא. מערבבים היטב עם פיפטה, ואז מניחים כ -600 מיקרוליטר מהתערובת בצינור NMR של חמישה מילימטרים. טען את צינור ה-NMR לתוך הספקטרומטר ולחץ על הפעל כדי להתחיל במדידה.

לאחר מכן, העבר את מקל ההמסה עם הדגימה המצורפת למצב הניקוי ולחץ על סיום בתוכנת DNP Polarizer. כדי להתחיל בהדמיית תהודה מגנטית של פחמן 13, לאחר תחילת תהליך ההיפרפולריזציה, העבירו 800 מיקרוליטר של דגימת תאים מושעים מחדש עם מספר תאים של לפחות 10 לשמינית למזרק של שלושה מיליליטר. חבר את המזרק לצנתר ארוך והנח את המזרק על מצע סריקת MRI.

ודא שהקטטר ארוך מספיק כדי להגיע מחוץ לסורק ה-MRI. הניחו פנטום כיול, המכיל עשרה פחמן מולארי 13 אוריאה עם 10% גדוטראט מגלומין ליד המזרק. הנח סליל מקלט RF מכוון פחמן 13 על המזרק.

הכנס את מיטת הסריקה לסורק כך שהאובייקט המעניין יהיה באיזוסנטר של סורק ה-MRI. חבר את בקבוק החיבור לצינור הפליטה של דגימת ההיפרפולרייזר והנח אותו קרוב לקצה הצנתר. הפעל רצף לוקליזציה סטנדרטי של שלושה מישורים והתאם את מיקום המזרק במידת הצורך.

לאחר מכן, הגדר והפעל רצף אנטומי משוקלל פרוטון T2 המכסה את לוקליזציה של המזרק. מהתמונות האנטומיות המתקבלות, בחר חמש פרוסות רציפות של אזור העניין, כולל פנטום הפחמן 13. הגדר רכישת כיול ספקטרוסקופי של פחמן 13, ובחר את רצף הכיול של בלוק דו-ממדי מספריית רצף הדופק.

הורד את רצף הדופק לסורק והפעל סריקה מוקדמת ספקטרוסקופית. בתרשים גודל הספקטרום, הגדר את שיא הפנטום של כיול הפחמן 13 למרכז תדר הסורק. הגדר את רווחי המקלט למקסימום ולחץ על סריקה' כדי להפעיל את רצף הכיול.

רשום את רווח השידור המדווח ואת התדר המרכזי. לאחר מכן, הגדר רכישת הדמיה של הסטה כימית של פחמן 13 עבור הפרוסות האנטומיות שנבחרו. בחר את רצף ההדמיה הספקטרוסקופי הדו-ממדי והורד את רצף הדופק לסורק.

הפעל את הסריקה המוקדמת הספקטרוסקופית, והתאם את התדר המרכזי ואת רווח השידור על סמך ערכי הכיול כדי לסיים את הגדרת ספקטרומטר ה-MRI. ברגע שהפירובט מגיע לקיטוב של 95%, לחץ על הפעל פירוק בתוכנת DNP Polarizer וטען את סוכן הפירוק. העבר את מקל הפירוק למצב פעיל.

לחץ על הבא ולאחר מכן על סיום'כאשר הדגימה ההיפר-פולרית המומסת מגיעה לבקבוק האיסוף, שאב כ-1 מיליליטר מהתמיסה ההיפר-פולרית לתוך מזרק, והזריק אותה לתוך הצנתר כך ש-200 מיקרוליטר יגיעו לדגימת התא. לחץ על סריקהכדי להתחיל ברכישת נתוני הניסוי. לאחר סיום איסוף הנתונים, העבר את מקל ההמסה עם הדגימה המצורפת למצב הניקוי, ולחץ על סיום בתוכנת DNP NMR.

קצב החליפין המטבולי של פירובט ללקטט נחקר בתאי PC3 של קרצינומה של הערמונית על ידי ניטור עוצמות האות של ספקטרוסקופיה של פחמן 13 NMR של לקטט ופירובט היפרפולריזציה ביחס לתדירות וזמן. הערכים הקינטיים של הלקטט הוערכו על ידי מודל יחס פשוט ועל ידי מודל דיפרנציאלי של חילופי שני אתרים, ונורמלו למספר התאים. בשני המודלים נצפתה מגמה של ירידה בייצור הלקטט עם מספר גדל והולך של תאים.

זה מיוחס לריכוזי תאים גבוהים יותר וצמיגות גדולה יותר של הדגימה. דגימות עם ספירת תאים מתחת לשניים כפול עשר לשבע מראות יחס אות לקטט לרעש קטן מאוד ולכן ערכי סטיית תקן גדולים המצביעים על כך שדגימות צריכות להכיל לפחות את מספר התאים הזה כדי לקבל נתונים אינפורמטיביים. לוקליזציה מרחבית הושגה באמצעות MRI עם רזולוציה ספקטרלית טובה המאפשרת לרכוש תמונות פחמן 13 עבור אזורי תדר ספציפיים.

ההתפלגות המרחבית נקבעה מהנתונים הגולמיים. תמונת הפחמן 13 יכולה גם להיות רשומה במשותף עם תמונת הפרוטונים שנרכשה בעבר. לאחר שליטה וביצוע נכון, ניתן לבצע ניסוי זה תוך פחות מ-60 דקות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע היפרפולריזציה של מולקולה רצויה באמצעות טכניקת הקיטוב הגרעיני הדינמי וכיצד לבצע ספקטרוסקופיה פשוטה של NMR וניסויי הדמיית תאים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיות מהיר מאוד. לאחר שהדגימה ההיפר-פולרית עוזבת את המקטב, זכור שאתה מאבד את כל אות ה-NMR שצברת תוך פחות משתי דקות.

לסיכום, ניתן להשתמש ב-DNP לפירוק עבור מגוון יישומים. זה כולל חקר מחלות כמו סוכרת, או התבוננות בשינויים מטבוליים של סוגים שונים של סרטן, אך גם מדידת pH של רקמות.