Name: דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: למדו למדוד קצב דיפוזיה של חלבונים בממברנות תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת קולטנים בתאים חיים ותורמת להבנת יעילות תאי הרג טבעי בטיפול אימונותרפי בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר Vladana Vukojeviç, מרכז לרפואה מולקולרית, קרולינסקה לשמירה על המכשיר Zeiss Confocor 3 ועבור עצות מועילות לגבי מדידות תא. מחקר זה מומן על ידי מענקים Vetenskapsrådet (מספר מענק 2012- 1629), מגנוס Bergvalls stiftelse, ומן Stiftelsen קלאס Groschinskys minnesfond.

<ol><li>Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+structure+and+dynamics+of+cell+membranes%3A+an+update+of+the+Singer-Nicolson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).</li>
<li>Bagawath-Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+Induce+Faster+Membrane+Diffusion+of+MHC+Class+I+and+the+Ly49A+Receptor+in+a+Subpopulation+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+for+the+study+of+membrane+dynamics+and+protein%2Flipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions.</a> Methods. 46, 116-122 (2008).</li>
<li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).</li>
<li>Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lpor.200910041/abstract">Fluorescence correlation spectroscopy in vivo.</a> Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).</li>
<li>Lidke, D. S., Wilson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+quantifying+protein+behaviour+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells.</a> Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).</li>
<li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+single+particle+tracking%3A+from+methods+to+biophysical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Rep Prog Phys. 78, 124601(2015).</li>
<li>Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).</li>
<li>Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImFCS%3A+a+software+for+imaging+FCS+data+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization.</a> Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).</li>
<li>Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-techniques%3A+advances+in+receptor+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">The F-techniques: advances in receptor protein studies.</a> Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Widengren, J., Thyberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+cell+surface+measurements--photophysical+limitations+and+consequences+on+molecular+ensembles+with+heterogenic+mobilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities.</a> Cytometry A. 68, 101-112 (2005).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Meinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+NK+cell+magnetic+bead+isolation+methods+on+phenotype+and+function+of+murine+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells.</a> J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).</li>
<li>Bacia, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+dual-color+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).</li>
<li>Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+coefficients+of+several+rhodamine+derivatives+as+determined+by+pulsed+field+gradient-nuclear+magnetic+resonance+and+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy.</a> J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).</li>
<li>Petrasek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).</li>
<li>Stromqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+FCCS+procedure+applied+to+Ly49A-MHC+class+I+cis-interaction+studies+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes.</a> Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).</li>
<li>Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100036a009">Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study.</a> J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).</li>
<li>Humpolickova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 91, L23-L25 (2006).</li>
<li>Guo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+approach+to+the+analysis+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+data+II%3A+application+to+simulated+and+in+vitro+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data.</a> Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).</li>
<li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).</li>
<li>Chiu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+%28mICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435(2016).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290(2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה עבור FCS יכול לשמש להערכת דינאמיקה מולקולארית של מולקולות פני השטח על כל סוגי תאים חיסוניים (Murine, אדם, או מינים אחרים). אמצעי FCS במרחב ובזמן דינאמיקה מולקולארית עד רזולוצית מולקולה בודדת בתאים חיים. הצפיפות המולקולרית, וכן את דינמיקת קצב אשכולות דיפוזיה של החלבונים בעלי עניין, ניתן לחלץ מן עקומות autocorrelation. תיוג פלורסנט הוא בעלת חשיבות מרכזית עבור ניסויי FCS מוצלחים. חלבונים של ריבית על קרום...

פונקציות תאים חיסוניים רבות מסתמכות על דיפוזיה אינטראקציות מולקולריות בתוך ממברנות. ממברנות ביולוגיות הם מורכבים, וישנם גורמים רבים שעשויים להיות חשובים לתפקוד של תאי מערכת החיסון יכול להשפיע על מהירות של דיפוזיה translational של חלבונים בתוך קרומים תאיים 1. הראינו לאחרונה כי הרג טבעי (NK) תאים, לימפוציטים שייך למערכת החיסון המולדת, להפגין דיפוזיה הפרש של שני חלבונים למדו בבית קרום התא בהתאם למצב של תא NK הפעלה 2. מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) היא טכניקה כי הוא מסוגל לכימות שיעורי דיפוזיה מולקולרית בתוך ממברנות ביולוגיות. זה מדווח על קצב הדיפוזיה הממוצע של fluorescently שכותרתו מולקולות בנפח קבוע, בדרך כלל מוקד מיקרוסקופ confocal. היא מבוססת על מדידת תנודות קרינה המתרחשת על תנועה מולקולרית במערכת במצב עמיד. FCS כבר בשימוש נרחב ללימוד דיפוזיה של צבעי ניאון וחלבונים, הוא פתרון ובתוך ממברנות שומנים בדם. פרמטרי פלט נוספים המשפיעים על קצב הדיפוזיה יכולים להיות גם למדו בעקיפין בדרך זו (למשל, שינויים קונפורמציה של חלבונים או אינטראקציות של מולקולות על קרום תא) 3, 4. FCS בולטת לעומת טכניקות אחרות בשל הרגישות הגבוהה שלו, מה שמאפשר את האפשרות לגילוי מולקולה בודדת. זה עובד גם עבור ריכוזים מולקולריים nanomolar למגוון millimolar, אשר אופיינית עבור רמות ביטוי אנדוגני של רוב החלבונים 5. יתר על כן, FCS יכול לתת קירוב המספר המוחלט של חלבונים בתוך הנפח למד, בעוד רוב הטכניקות אחרות רק לתת מידע ביחס על רמות ביטוי חלבון. שיטות אחרות כדי למדוד את שיעורי דיפוזיה מולקולרית בתוך ממברנות כוללים fluoהתאוששות rescence לאחר photobleaching (FRAP), חלקיק בודד מעקב (SPT), FCS חריר המרובה, ושיטות התמונה קורלציה. FRAP ושיטות תמונת מתאם טכניקות הרכב, אשר בדרך כלל לא מספקות מידע על מספרם המוחלט של מולקולות 10. לעומת SPT, התפוקה של FCS היא גבוהה ביחס המאפיין את הממוצע באוכלוסייה. הניתוח הוא גם פחות תובעני מאז קצב הדיפוזיה הממוצע של המולקולות הנוכחות בתוך מוקד הליזר נמדד, ולא בשיעור של מולקולות בודדות. כמו כן, אלא אם כן מיקרוסקופים מיוחדים זמינים 11, SPT לא יכול לתת שום מידע על ריכוזי, מאז תיוג SPT תקן חייב להיות נמוך מאוד על מנת לאפשר זיהוי של מולקולות בודדות. מצד השני, FCS מחייב המולקולות הנחקרת להיות ניידות. זה פשוט לא מזהה כל שברים המשוערת נייחים או מולקולות נעו לאט יותר. שיעור דיפוזיה של מולקולותמתגוררים בתוך המוקד שאורכן עולה על עשירית מהזמן הרכישה לא להיות מיוצג כראוי במדידות FCS 3, 12. לכן, מקדמי דיפוזיה שרשמו FCS נוטים להיות מהיר יותר מאשר שיעורי דיפוזיה דיווחו מטכניקות כמו FRAP ו SPT, שבו קרוב ל-נייח איטית מאוד שברים נלקחים בחשבון גם כן. SPT גם ייתן תיאור מפורט יותר של ההשתנות של שיעורי דיפוזיה בתוך האוכלוסייה המולקולרית מ FCS יהיה. FCS מכמת את התנודות של עוצמת קרינה לאורך זמן בתוך הנפח הנרגש. במקרה של מדידות קרום, זה מתרגם ל השטח המואר של הממברנה. במאמר זה, אנו מנצלים את העובדה כי תנודות כאלה הן המושרה על ידי מולקולות המפגינות דיפוזיה בראונית ובכך עוברות פנימה וחוצה של נפח העירור. ישנם גם מספר מקורות אפשריים אחרים עבור fluctuaהמשא ב האות הקרינה, כגון מהבהב או נוכחות של טריפלט ב fluorophores, השפעות סביבתיות, מחייב unbinding של ליגנד, או תנועה של קרום התא כולו. מקורות שגיאה המשוערים אלה צריכים להילקח בחשבון בעת תכנון ניסוי FCS כדי לפרש את התוצאות במדויק 12, 13. בדרך כלל, שיעורי דיפוזיה לרוחב ממברנות ביולוגיות נמוכים בשל צפיפות ואינטראקציות, הוא בין חלבונים בממברנה ובין חלבוני שלד התא. מבחינה הסטורית, השימוש FCS בממברנות ובכך כבר הקשה על ידי חוסר fluorophores צילום יציב, אשר נדרשים כדי למנוע הלבנה בזמני המעבר המורחבים דרך התמקדות עירור 14. עם זאת, היום, יש שפע של אפשרויות עבור צבעי צילום יציב מתאימים. שיפורים משמעותיים גלאי ורכיבי חומרה אחרת גם לאפשר זיהוי של prote הניאוןכל פרטי צבעים של בהירות נמוכה יותר. כאן, פרוטוקול בסיסי עבור היישום של FCS באמצעות לימפוציטים העיקרי בעכברים, שבו החלבון של עניין מסומן עם fluorescently מתויג נוגדן, מתואר. גישה כדי להתאים את עקומות autocorrelation כדי לחלץ את מקדם הדיפוזיה ואת הצפיפות המולקולרית מוצגת גם. הפרוטוקול שיתפשר עוקב אחריו בקלות על ידי אימונולוגים ללא ניסיון קודם של טכניקות ללמוד דיפוזיה של מולקולות. עם זאת, הבנה בסיסית של מיקרוסקופיה confocal צפויה (כדי לקבל הבנה בסיסית זו, ראה התייחסות 15). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות יחסית לתאי השעיה אחרים, הוא שורות תאי תאים ראשוניים. עבור משתמשים מנוסים יותר FCS, שיטות ניתוח מעודנות יותר להתקיים, שחלקם מתוארים הדיון.

<table><tbody><tr><td>ערכת בידוד תאים MACS NK עכבר II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>בחירה שלילית של תאי NK</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>סיגמא-אדלריך</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מומת בחום חוצץ מלח</td> <td>-</td><td></td> <td>תוצרת בית&nbsp;</td></tr><tr><td>מכון הזיכרון רוזוול פארק מדיום 1640</td><td>PAA חברת תרבית התאים&nbsp;</td><td>E15-848</td> שיבוט נוגדנים <td>בינוני שקוף</td></tr><tr><td>2.4G2</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>553140</td><td>לחסימת קולטני FC.</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-Ly49A&nbsp;</td><td></td><td></td><td>נוגדן חד שבטי המיוצר בבית ומצומד בבית ל-Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד H-2Dd&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>מצומד בבית ל-MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>צבע פלואורסצנטי לצימוד נוגדנים.</td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8920</td><td>מדולל במים מזוקקים (1.10)</td></tr> <tr><td>פולי-ליזין (20 kDa) מושתל בפוליאתילן גליקול (2 kDa)</td> <td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td> <td>מדולל ב-PBS (pH 7.4) עד 0.5 מ"ג/מ"ל.</td></tr><tr><td>רודמין 110 כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>432202</td><td>מקדם דיפוזיה ידוע: 3.3 פעמים; 10 ומינוס; 10 m2/sec 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A20006</td><td>מקדם דיפוזיה ידוע: 4.4 & פעמים; 10 ומינוס; 10 m2/sec 20</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה: Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה: Matlab עם ארגז כלים מתאים עקומה</td><td>Matlab</td><td>גרסת R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>תרמו-מדעי&nbsp;</td><td>155411</td><td>8 בארות, 1.0 תחתית בורוסיליקט</td></tr></tbody></table>

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד דיפוזיה של מולקולות בתוך ממברנות ביולוגיות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. FCS יכול לכמת את מקדם ריכוז דיפוזיה מולקולרית של מולקולות שכותרתו fluorescently בקרום התא. טכניקה זו יש את היכולת לחקור את מאפייני דיפוזיה המולקולריים של מולקולות בקרום הפלזמה של תאים חיסוניים מצב יציב (כלומר, בלי תהליכים המשפיעים על התוצאה בזמן המדידה בפועל). FCS מתאים ללימוד דיפוזיה של חלבונים כי הם לידי ביטוי ברמות אופייניות חלבונים אנדוגניים ביותר. כאן, שיטה פשוטה וחזקה כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של חלבוני קרום על לימפוציטים עיקרי באה לידי ביטוי. דרך יעילה לבצע מדידות על תאי חיים מוכתם נוגדן נפוץ תצפיות שהתרחשו לאחר הרכישה מתוארת. הפיתוחים האחרוניםבפיתוח של צבעי ניאון צילום יציב יכול להיות מנוצל על ידי conjugating הנוגדנים של עניין לנכס צבעים שאינם להלבין בהרחבה במהלך המדידות. בנוסף, זה מאפשר זיהוי של גופים להתפוגג אט אט, אשר היא תכונה נפוצה של חלבונים הביע קרום התא. הליך הניתוח כדי לחלץ פרמטרי ריכוז דיפוזיה מולקולריים מן עקומות autocorrelation שנוצרו מודגש. לסיכום, פרוטוקול בסיסי למדידות FCS מסופק; ניתן בעקבותיו ידי אימונולוגים עם הבנה של מיקרוסקופיה confocal אך ללא ניסיון קודם אחרים של טכניקות למדידת פרמטרים דינמיים, כגון שיעורי דיפוזיה מולקולרית.

תוצאה אופיינית יפיק עקומת autocorrelation עם זמן המעבר בטווח של 10 מילי-שניות ל -400 מילי-שניות עבור חלבונים בממברנה. מספר מולקולות יכול להשתנות בין 0.5 ל סביב 200 לכל מיקרומטר 2 עבור חלבונים הביע באופן אנדוגני. בדוק היטב כי CPM אינו נמוך מהצפוי. המשמעות יכולה להיות כי קיימת השפעה של אות הרקע. ככלל אצבע, האות CPM על תאים מקובל לניתוח לא צריך להיות נמוך מ -33% של ה- CPM עבור לשדר נוגדנים בחופשיות באותו כוח לייזר. ה- CPM צריך סולם ליניארי ...

מתוארת שיטה למדידת דיפוזיה של חלבון בממברנות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS). במאמר זה מודגם השימוש בנוגדנים לסימון פלואורסצנטי.

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא למדוד את קצב הדיפוזיה של חלבון מסומן בממברנות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה של התא, כגון זיהוי תאי הרג טבעיים עם דינמיקה פעילה יותר של קולטני הממברנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משמשת עם תאים חיים, כך שהיא משקפת במדויק את המצב הטבעי על אופן תנועת המולקולות.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אימונותרפיה של סרטן אם תכונות שונות של תאי הרג טבעיים, כגון דיפוזיה מולקולרית, קשורות לתפקודם שניתן לחזות טוב יותר את יעילותם. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תנועה מולקולרית בתאי חיסון, ניתן ליישם אותה גם על תאים ראשוניים וקווי תאים אחרים בכל דיסציפלינה. פתח את התוכנה במצב מומחה, כאשר האפשרות סרוק תמונות חדשות נבחרה.בחר את עדשת אובייקט המים 40X במיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי. תחת הכרטיסייה רכישה, לחץ על לחצני התצורה והסריקה כדי לפתוח את בקרת התצורה ואת בקרת הסריקה. תחת הכרטיסייה ConfoCor, לחץ על מדידה כדי לפתוח את חלון המדידה.לאחר מכן, צור תיקיה לשמירת מדידות ה-FCS. התחל מסד נתונים חדש של תמונות על-ידי לחיצה על חדש תחת הכרטיסיה קובץ. הפעל את מנורת הלוגן.באמצעות כפתור הלייזר, הפעל את הלייזרים הרלוונטיים כדי לעורר את הפלואורופורים. לאחר מכן ציין את ההגדרות עבור לכידת תמונה בחלון בקרת תצורה. זה כולל את לייזר העירור, מסנני עירור ופליטה, נתיב אור וגלאים בשימוש.באופן דומה, עבור אל מדידה חלון והתאם את הגדרות FCS תחת הכרטיסייה תצורת מערכת. הפעל את ערוצי הזיהוי עבור הקלטות FCS על ידי החלפת Ch 1 עבור הערוץ הירוק, ו-Ch 2 עבור הערוץ האדום. בזמן שהלייזר מתייצב, מה שעשוי להימשך עד 30 דקות, כוונן את חור הסיכה.ראשית, הנח טיפת צבע של 50 מיקרוליטר במרכז לבאר אחת של שקופית זכוכית כיסוי בעלת שמונה תאים המצופה בפולי-L-ליזין. הבארות הסמוכות משמשות לביצוע מדידות תאים מכיוון שהכיול תלוי בשקופיה. שים טיפת מים מזוקקים על עדשת אובייקט המים 40X ומקם את השקופית.לאחר מכן לחץ על Vis כדי לבחור את מקור האור הנראה ולהתמקד במיקום המרכזי של טיפת הפלואורופור. בחלון מדידת התוכנה, בחר בכרטיסייה רכישה ותחת פוזיציות, החלף את המיקום הנוכחי. לאחר מכן חזור לכרטיסייה תצורת מערכת באותו חלון, והגדר עוצמה גבוהה או רוויה עבור הלייזר הירוק.כדי לבדוק את יציבות האות, לחץ על התחל כדי לפתוח חלון חדש המציג את עקומת מעקב הזמן והמתאם האוטומטי. בדוק שהאות הפלואורסצנטי גבוה, יציב ושציר ה-y מראה תנודות בתחום הקילו-הרץ. ערכים נמוכים יותר יכולים לנבוע ממיקוד לא מדויק או מפגיעה בצבע.לאחר מכן, בחלון המדידה, בחר בלחצן O Adjustment. לאחר מכן בחר את ערוץ הזיהוי הנכון ולחץ על Auto Adjust X.אם הגבול העליון של העקומה שנוצרה חסר או אינו ממורכז, סמן את האפשרות Rough והקש שוב על Auto Adjust X. לאחר התאמת כיוון X, עשה את אותו הדבר עבור כיוון Y על ידי לחיצה על כוונון אוטומטי Y.בטל את הבחירה בגס והחלף בין כוונון X ל-Y על ידי לחיצה על כוונון אוטומטי עד שלשניהם יהיו ערכים מקסימליים ברורים ויציבים.אם התאים מסומנים על ידי שני פלואורופורים שונים, הוסף טיפה של תמיסת פלואורופור אדומה לתא סמוך. לאחר מכן כייל את הערוץ השני. הגדר את הלייזר האדום לעוצמה גבוהה וחזור על הליך כיול היציבות.לאחר מכן, אנו מודדים את זמן המעבר של פלואורופורים המתפזרים בחופשיות דרך המיקוד. ואנו משתמשים בשלב זה כדי לחשב את השטח של קרום התא שנמצא במוקד. כדי להתחיל, התמקדו בטיפת תמיסה על ידי ביצוע קפדני של הליך ההתאמה.לאחר מכן עבור ללשונית רכישה בחלון מדידה והגדר את זמן הרכישה ל-30 שניות עם שלוש חזרות. הגדר את עוצמת הלייזר לרוויה קרובה ולחץ על התחל כדי לבצע מדידה. רשום את הספירה לכל מולקולה או CPM לאחר השלמת המדידה.לאחר מכן בצע מדידות חדשות תוך ביצוע הפחתה איטרטיבית בעוצמת הלייזר. בתוך תחום הספק זה, כלול את ההספק הצפוי של מדידות התאים הקרובות. לאחר מכן בדוק שערכי העלות לאלף הופעות משתנים באופן ליניארי עם עוצמת הלייזר.בתנאי ששאר הסולם הוא ליניארי, רוויה בעוצמה הגבוהה ביותר מקובלת. בפעם הראשונה שנעשה שימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים חדשים, בצע מדידת FCS של נוגדנים מפוזרים בחופשיות כדי לכמת את העלות הצפויה לאלף חשיפות. וחשוב להשתמש בבארות המצופות ב-PEG Poly-L-Lysine לנוגדנים בחינם.לצורך הליך זה, מצפים שקופית תא עם 200 מיקרוליטר פולי-ליזין המושתל בפוליאתילן גליקול. תן לתמיסה להיצמד למשך שעה בטמפרטורת החדר. ניתן לקרר את תמיסת המלאי עד שבועיים.ואת מלאי האבקה יש לאחסן במקפיא. מאוחר יותר, הסר את הנוזל ואפשר לתא להתייבש באוויר. במיקרוסקופ, יש לדלל את הנוגדן ב-PBS בין 1 ל-10 מיקרוגרם למיליליטר.המשך למדוד את זמן המעבר של נוגדנים חופשיים כמתואר בסעיף הקודם עבור פלואורופורים חופשיים. כדי לבצע מדידה בתא, הוסף 125 מיקרוליטר של תאים ב-PBS בתוספת 1% FCS מתרחיף התא המסומן בנוגדנים. ו-150 מיקרוליטר של מכון הזיכרון רוזוול פארק שקוף מדיום 1640 לבאר ריקה במגלשת הזכוכית המצופה PLL.תנו לתאים לדגור בחושך בטמפרטורת המדידה לפחות 20 דקות לפני שתמשיכו, כך שהתאים יוכלו להתחבר ולהתאזן. התחל את ההדמיה עם סריקות XY מהירות כדי למצוא את עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית הדרושה לצפייה בתאים. לאחר מכן מרכז את התמונה על תא עגול בעל בהירות ממוצעת שבו הממברנה מוגדרת בבירור.זה חיוני שלא יהיה אות פלואורסצנטי בציטופלזמה. התקרב עד שהתא יכסה את רוב התמונה. לאחר מכן התמקדו בחלק העליון של קרום התא.התחל במרכז התא והתקדם כלפי מעלה עד שמרכז התמונה מראה אזור עגול קטן עם פלואורסצנטיות אחידה. מיקום זהיר של הפוקוס הוא קריטי. אם המוקד אינו בקרום, הקרינה שזוהתה לא תגיע מקולטני הממברנה המסומנים בפלואורסצנט.ולכן התוצאות לא ישקפו את התנהגותם. כעת תחת הכרטיסייה רכישה של חלון המדידה, בחר מיקום למדידת FCS על ידי הפעלת הכוונת. לאחר מכן הגדר את מספר החזרות בין שש ל-10 והגדר את זמן המדידה ל-10 שניות לכל חזרה.כעת חזור לכרטיסייה תצורת מערכת של חלון המדידה והורד את עוצמת הלייזר למדידות FCS בין 1 ל-10 מיקרו-וואט. לאחר מכן לחץ על התחל. אם עקבות העוצמה יורדות ביותר מ-30% במהלך 10 השניות הראשונות, התא הולבן יותר מדי ויש למדוד תא אחר בעוצמה נמוכה יותר.אם האות אבד, כוונן את המיקוד בכיוון Z והפעל מחדש את המדידה. לאחר השלמת המדידה, הסתכל בחלון בקרת הסריקה כדי לבדוק שהתא עדיין ממורכז כדי לוודא שהממברנה שלו נמדדה. אם התא זז, מחק את הנתונים.כעת עבור לחלון מתאם אוטומטי ומחק ידנית חזרות בודדות המכילות תמרוני זום, הלבנה, אשכולות גדולים או חפצים אחרים. השתמש בלחיצה ימנית ובחר Delete כדי להסיר את החפצים. בחירת החפצים בפועל דורשת תרגול.הסרת חזרות היא תהליך פשוט, אך יש להעריך את החזרות בצורה נכונה כדי לדעת מה צריך להסיר ואילו לא. לאחר מכן שמור את הקובץ הסופי בפורמט FCS. שמור רק תאים שנותרו בהם לפחות ארבע חזרות לאחר הסרת החפצים להמשך ניתוח.עקומת מתאם אוטומטית של קולטן ממברנה טיפוסית היא חלקה ובעלת זמן מעבר בטווח של 10 עד 400 אלפיות השנייה. הגדר את התחומים המתאימים כך שגם ההתחלה וגם הסוף של החלק המשופע התלול ביותר, המייצג דיפוזיה, מיוצגים. באמצעות מודל של דיפוזיה חופשית בשני ממדים כדי להתאים לנתונים, שימו לב לחלק המשופע ביותר של העקומה.תנודות קטנות בסביבות שנייה אחת בסולם טאו, הנראות בשארית, מקובלות. אם העקומה מתאימה בצורה גרועה, אך לתא אין בעיות נראות לעין, כגון תנועה, הלבנה או אשכולות, סביר להניח שערכי ההתחלה או הגבולות העליונים והתחתונים של המודל צריכים להשתנות. לאחר שהמודל מתאים היטב לעקומת המתאם האוטומטי, חלץ את הערכים של הפרמטרים המשתנים.מספר המולקולות יכול לנוע בין 0.5 לסביבות 200 למיקרון רבוע עבור חלבונים בעלי ביטוי אנדוגני. בדוק שערך העלות לאלף הופעות ממדידת התאים הוא לפחות 33% מזה שנרשם מנוגדנים מפוזרים בחופשיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את קצב הדיפוזיה של חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על התאים על הקרח עד כ-20 דקות לפני תחילת המדידה. אין למדוד דגימות יותר משעתיים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיה על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד קצב הדיפוזיה מתאם לרמת הביטוי של חלבון מסוים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה המולקולרית והאימונולוגיה לחקור דינמיקה של חלבונים בתאים חיים.

molecular-diffusion-plasma-membranes-primary-lymphocytes-measured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

טכניקה לחקור את הרפסודה השומנים חלוקה של חלבונים ניאון על הממברנה של התאים החיים המתואר. הוא מנצל את הפער בזמנים דיפוזיה של חלבונים המצויים בתוך או מחוץ רפסודות שומנים בדם. הרכישה יכולה להתבצע באופן דינמי בתנאי בקרה, או אחרי כן התרופה.

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות כדי לזהות את האינטראקציה בין חלבוני פני התא במגעים בין תאי התא. על ידי ביטוי קולטן ההידבקות הטרנסממברנה של עניין המסומן בחלבון פלואורסצנטי וערבוב שתי אוכלוסיות תאים שונות המכילות שתי תוויות פלואורסצנטיות מופרדות ספקטרלית, האינטראקציה הטרנסית בין קולטנים של שני תאים שכנים בעלי פלואורסצנטיות בצבעים שונים מוערכת באמצעות מתאם צולב בתנודות של עוצמת הפלואורסצנטיות.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של חלבונים במגעים עם תאים

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד למתאם טכניקת ניתוח תנודות k-Space תמונת ספקטרוסקופיה (kICS) למדידת מקדמי דיפוזיה של כותרתו fluorescently חלבוני קרום פלזמה בתאי יונקים חיים.

קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת הדיפוזיה הרוחבית של מין פעיל על פני השטח בממשק נוזל-נוזל על ידי מיזוג חד-שכבת טיפה על חד-שכבה שטוחה.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

כאן, אנו מציגים עבור חלקיק יחיד מעקב וניתוח תמונות המאפשר הערכה כמותית של דיפוזיה מקדמים, סוגי תנועה וגדלי אשכול של חלקיקים אחד שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פרוטוקול.

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול כיצד לבנות מיקרוסקופ ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS) של וריאציה נקודתית כדי למדוד דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים.

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

למדו למדוד קצב דיפוזיה של חלבונים בממברנות תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת קולטנים בתאים חיים ותורמת להבנת יעילות תאי הרג טבעי בטיפול אימונותרפי בסרטן.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים