דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא למדוד את קצב הדיפוזיה של חלבון מסומן בממברנות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה של התא, כגון זיהוי תאי הרג טבעיים עם דינמיקה פעילה יותר של קולטני הממברנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משמשת עם תאים חיים, כך שהיא משקפת במדויק את המצב הטבעי על אופן תנועת המולקולות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אימונותרפיה של סרטן אם תכונות שונות של תאי הרג טבעיים, כגון דיפוזיה מולקולרית, קשורות לתפקודם שניתן לחזות טוב יותר את יעילותם. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תנועה מולקולרית בתאי חיסון, ניתן ליישם אותה גם על תאים ראשוניים וקווי תאים אחרים בכל דיסציפלינה. פתח את התוכנה במצב מומחה, כאשר האפשרות סרוק תמונות חדשות נבחרה.

בחר את עדשת אובייקט המים 40X במיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי. תחת הכרטיסייה רכישה, לחץ על לחצני התצורה והסריקה כדי לפתוח את בקרת התצורה ואת בקרת הסריקה. תחת הכרטיסייה ConfoCor, לחץ על מדידה כדי לפתוח את חלון המדידה.

לאחר מכן, צור תיקיה לשמירת מדידות ה-FCS. התחל מסד נתונים חדש של תמונות על-ידי לחיצה על חדש תחת הכרטיסיה קובץ. הפעל את מנורת הלוגן.

באמצעות כפתור הלייזר, הפעל את הלייזרים הרלוונטיים כדי לעורר את הפלואורופורים. לאחר מכן ציין את ההגדרות עבור לכידת תמונה בחלון בקרת תצורה. זה כולל את לייזר העירור, מסנני עירור ופליטה, נתיב אור וגלאים בשימוש.

באופן דומה, עבור אל מדידה חלון והתאם את הגדרות FCS תחת הכרטיסייה תצורת מערכת. הפעל את ערוצי הזיהוי עבור הקלטות FCS על ידי החלפת Ch 1 עבור הערוץ הירוק, ו-Ch 2 עבור הערוץ האדום. בזמן שהלייזר מתייצב, מה שעשוי להימשך עד 30 דקות, כוונן את חור הסיכה.

ראשית, הנח טיפת צבע של 50 מיקרוליטר במרכז לבאר אחת של שקופית זכוכית כיסוי בעלת שמונה תאים המצופה בפולי-L-ליזין. הבארות הסמוכות משמשות לביצוע מדידות תאים מכיוון שהכיול תלוי בשקופיה. שים טיפת מים מזוקקים על עדשת אובייקט המים 40X ומקם את השקופית.

לאחר מכן לחץ על Vis כדי לבחור את מקור האור הנראה ולהתמקד במיקום המרכזי של טיפת הפלואורופור. בחלון מדידת התוכנה, בחר בכרטיסייה רכישה ותחת פוזיציות, החלף את המיקום הנוכחי. לאחר מכן חזור לכרטיסייה תצורת מערכת באותו חלון, והגדר עוצמה גבוהה או רוויה עבור הלייזר הירוק.

כדי לבדוק את יציבות האות, לחץ על התחל כדי לפתוח חלון חדש המציג את עקומת מעקב הזמן והמתאם האוטומטי. בדוק שהאות הפלואורסצנטי גבוה, יציב ושציר ה-y מראה תנודות בתחום הקילו-הרץ. ערכים נמוכים יותר יכולים לנבוע ממיקוד לא מדויק או מפגיעה בצבע.

לאחר מכן, בחלון המדידה, בחר בלחצן O Adjustment. לאחר מכן בחר את ערוץ הזיהוי הנכון ולחץ על Auto Adjust X.אם הגבול העליון של העקומה שנוצרה חסר או אינו ממורכז, סמן את האפשרות Rough והקש שוב על Auto Adjust X. לאחר התאמת כיוון X, עשה את אותו הדבר עבור כיוון Y על ידי לחיצה על כוונון אוטומטי Y.בטל את הבחירה בגס והחלף בין כוונון X ל-Y על ידי לחיצה על כוונון אוטומטי עד שלשניהם יהיו ערכים מקסימליים ברורים ויציבים.

אם התאים מסומנים על ידי שני פלואורופורים שונים, הוסף טיפה של תמיסת פלואורופור אדומה לתא סמוך. לאחר מכן כייל את הערוץ השני. הגדר את הלייזר האדום לעוצמה גבוהה וחזור על הליך כיול היציבות.

לאחר מכן, אנו מודדים את זמן המעבר של פלואורופורים המתפזרים בחופשיות דרך המיקוד. ואנו משתמשים בשלב זה כדי לחשב את השטח של קרום התא שנמצא במוקד. כדי להתחיל, התמקדו בטיפת תמיסה על ידי ביצוע קפדני של הליך ההתאמה.

לאחר מכן עבור ללשונית רכישה בחלון מדידה והגדר את זמן הרכישה ל-30 שניות עם שלוש חזרות. הגדר את עוצמת הלייזר לרוויה קרובה ולחץ על התחל כדי לבצע מדידה. רשום את הספירה לכל מולקולה או CPM לאחר השלמת המדידה.

לאחר מכן בצע מדידות חדשות תוך ביצוע הפחתה איטרטיבית בעוצמת הלייזר. בתוך תחום הספק זה, כלול את ההספק הצפוי של מדידות התאים הקרובות. לאחר מכן בדוק שערכי העלות לאלף הופעות משתנים באופן ליניארי עם עוצמת הלייזר.

בתנאי ששאר הסולם הוא ליניארי, רוויה בעוצמה הגבוהה ביותר מקובלת. בפעם הראשונה שנעשה שימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים חדשים, בצע מדידת FCS של נוגדנים מפוזרים בחופשיות כדי לכמת את העלות הצפויה לאלף חשיפות. וחשוב להשתמש בבארות המצופות ב-PEG Poly-L-Lysine לנוגדנים בחינם.

לצורך הליך זה, מצפים שקופית תא עם 200 מיקרוליטר פולי-ליזין המושתל בפוליאתילן גליקול. תן לתמיסה להיצמד למשך שעה בטמפרטורת החדר. ניתן לקרר את תמיסת המלאי עד שבועיים.

ואת מלאי האבקה יש לאחסן במקפיא. מאוחר יותר, הסר את הנוזל ואפשר לתא להתייבש באוויר. במיקרוסקופ, יש לדלל את הנוגדן ב-PBS בין 1 ל-10 מיקרוגרם למיליליטר.

המשך למדוד את זמן המעבר של נוגדנים חופשיים כמתואר בסעיף הקודם עבור פלואורופורים חופשיים. כדי לבצע מדידה בתא, הוסף 125 מיקרוליטר של תאים ב-PBS בתוספת 1% FCS מתרחיף התא המסומן בנוגדנים. ו-150 מיקרוליטר של מכון הזיכרון רוזוול פארק שקוף מדיום 1640 לבאר ריקה במגלשת הזכוכית המצופה PLL.

תנו לתאים לדגור בחושך בטמפרטורת המדידה לפחות 20 דקות לפני שתמשיכו, כך שהתאים יוכלו להתחבר ולהתאזן. התחל את ההדמיה עם סריקות XY מהירות כדי למצוא את עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית הדרושה לצפייה בתאים. לאחר מכן מרכז את התמונה על תא עגול בעל בהירות ממוצעת שבו הממברנה מוגדרת בבירור.

זה חיוני שלא יהיה אות פלואורסצנטי בציטופלזמה. התקרב עד שהתא יכסה את רוב התמונה. לאחר מכן התמקדו בחלק העליון של קרום התא.

התחל במרכז התא והתקדם כלפי מעלה עד שמרכז התמונה מראה אזור עגול קטן עם פלואורסצנטיות אחידה. מיקום זהיר של הפוקוס הוא קריטי. אם המוקד אינו בקרום, הקרינה שזוהתה לא תגיע מקולטני הממברנה המסומנים בפלואורסצנט.

ולכן התוצאות לא ישקפו את התנהגותם. כעת תחת הכרטיסייה רכישה של חלון המדידה, בחר מיקום למדידת FCS על ידי הפעלת הכוונת. לאחר מכן הגדר את מספר החזרות בין שש ל-10 והגדר את זמן המדידה ל-10 שניות לכל חזרה.

כעת חזור לכרטיסייה תצורת מערכת של חלון המדידה והורד את עוצמת הלייזר למדידות FCS בין 1 ל-10 מיקרו-וואט. לאחר מכן לחץ על התחל. אם עקבות העוצמה יורדות ביותר מ-30% במהלך 10 השניות הראשונות, התא הולבן יותר מדי ויש למדוד תא אחר בעוצמה נמוכה יותר.

אם האות אבד, כוונן את המיקוד בכיוון Z והפעל מחדש את המדידה. לאחר השלמת המדידה, הסתכל בחלון בקרת הסריקה כדי לבדוק שהתא עדיין ממורכז כדי לוודא שהממברנה שלו נמדדה. אם התא זז, מחק את הנתונים.

כעת עבור לחלון מתאם אוטומטי ומחק ידנית חזרות בודדות המכילות תמרוני זום, הלבנה, אשכולות גדולים או חפצים אחרים. השתמש בלחיצה ימנית ובחר Delete כדי להסיר את החפצים. בחירת החפצים בפועל דורשת תרגול.

הסרת חזרות היא תהליך פשוט, אך יש להעריך את החזרות בצורה נכונה כדי לדעת מה צריך להסיר ואילו לא. לאחר מכן שמור את הקובץ הסופי בפורמט FCS. שמור רק תאים שנותרו בהם לפחות ארבע חזרות לאחר הסרת החפצים להמשך ניתוח.

עקומת מתאם אוטומטית של קולטן ממברנה טיפוסית היא חלקה ובעלת זמן מעבר בטווח של 10 עד 400 אלפיות השנייה. הגדר את התחומים המתאימים כך שגם ההתחלה וגם הסוף של החלק המשופע התלול ביותר, המייצג דיפוזיה, מיוצגים. באמצעות מודל של דיפוזיה חופשית בשני ממדים כדי להתאים לנתונים, שימו לב לחלק המשופע ביותר של העקומה.

תנודות קטנות בסביבות שנייה אחת בסולם טאו, הנראות בשארית, מקובלות. אם העקומה מתאימה בצורה גרועה, אך לתא אין בעיות נראות לעין, כגון תנועה, הלבנה או אשכולות, סביר להניח שערכי ההתחלה או הגבולות העליונים והתחתונים של המודל צריכים להשתנות. לאחר שהמודל מתאים היטב לעקומת המתאם האוטומטי, חלץ את הערכים של הפרמטרים המשתנים.

מספר המולקולות יכול לנוע בין 0.5 לסביבות 200 למיקרון רבוע עבור חלבונים בעלי ביטוי אנדוגני. בדוק שערך העלות לאלף הופעות ממדידת התאים הוא לפחות 33% מזה שנרשם מנוגדנים מפוזרים בחופשיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את קצב הדיפוזיה של חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על התאים על הקרח עד כ-20 דקות לפני תחילת המדידה. אין למדוד דגימות יותר משעתיים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיה על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד קצב הדיפוזיה מתאם לרמת הביטוי של חלבון מסוים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה המולקולרית והאימונולוגיה לחקור דינמיקה של חלבונים בתאים חיים.