מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת

המטרה הכללית של מחקר זה היא לבסס מערכת תרבית זיהומים של נגיף זיקה in vitro המבוססת על תאי יונקים, כדי לחקור את שחזור נגיף הזיקה, וכן להשתמש בפלטפורמה ה-in vitro לפיתוח תרופות. פרוטוקול מפורט זה, המוגש שלב אחר שלב, עבור מערכת תרבית תאים זיהומית של נגיף הזיקה, יכול לסייע בהבנת המנגנון של פתוגנזה של מחלה המתווכת על ידי נגיף הזיקה ואת התפתחות העוצמה של הנגיף. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור רחב-היקף של נגיף הזיקה לצורך פיתוח תרופות וחיסונים.

התחילו בקציר של תאי Vero בצפיפות תאים של 80% בבקבוק תרבית T75, על ידי שאיבת המדיום מהבקבוק ושטיפת התאים בשני מיליליטר של phosphate-buffered saline. הוסיפו שני מיליליטר של 0.25% trypsin והדגרירו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. לאחר ההדגירה, הוסיפו שמונה מיליליטר של מדיום גידול המכיל סרום כדי לבטל את פעילות ה-trypsin. לאחר מכן, העבירו את התאים לנבובת של 15 מיליליטר. בשלב הבא, הוציאו 10 µL של תאים וערבבו עם כמות שווה של 0.4% trypan blue. טענו את התערובת שהוכנה לסרטית של תא תאים והשיגו את מספר התאים החיוניים באמצעות סופר תאים אוטומטי. זרעו סהכול של שבעה מיליוני תאים לבקבוק T160 בנפח של 30 מיליליטר. למחרת, הכינו ריכוז מתאים של multiplicity of infection של אינוקולום של נגיף Zika ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית נטול סרום לכל בקבוק.

טיפול בטוח בנגיף הוא קריטי למניעת התפשטות הזיהום.

הסר את המצע המרוקן מהבקבוק מסוג T160 ולאחר מכן הוסף את מלוא 10 milliliters של האינוקולום הוויראלי שהוכן טרי. דגרי את הבקבוקים שחושכו ב-37 degrees Celsius עם 5%CO2 למשך ארבע עד שש שעות. פזר את האינוקולום על ידי הטיה עדינה של הבקבוק הצידה בכל שעה של הדגירה. עם סיום ההדגירה, החלף את האינוקולום ב-30 milliliters של מצע גידול חם המועשר בסרום. לאחר מכן, המשך את תרבית הנגיף למשך 96 השעות הבאות. לאחר ארבעה ימים, וודא את התקדמות הזיהום על ידי התבוננות בהופעת פלאקים ויראליים על השכבה החד-תאית של התאים, באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast). צלם תמונות לפי הצורך בהגדלה של 40x ו-200x.

אספו את העל-נוזל (supernatants) מתרבית התאים בנקודת הזמן של 96 שעות, וסבבו את העל-נוזל בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר שיירי תאים. לאחר הסבב בצנטריפוגה, הסירו בזהירות את העל-נוזלים מבלי להסיע את המשקע של שיירי התאים, והעבירו אותם למבחנות של 15 milliliters.

אחסן את העל-נוזלים של תרבית הווירוסים במכסות (aliquots) מרובות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

כדי לקבוע את תרקיז הנגיף, ראשית זרעו תאי Vero נאיביים למגש של 12 בארות בריכוז של 1x10⁵ תאים לבארה, בנפח של 2 מיליליטר. למחרת, הכינו דילולות סדרתיות של פי 10 של תעליכי תרבית נגיפית, שנאספו מבקבוק T160 באמצעות מצע ללא סרום.

בעת הכנת דילולים סדרתיים של עלי-נוזל (supernatant) מתרבית נגיפים לצורך בדיקות תיתור (titer assays), הקפידו לטפל בנגיף באופן בטוח כדי למנוע זיהום.

בשלב הבא, הסירו את המצע המרוקן מכל באר בלוח 12 הבארי המכיל תאי Vero, והוסיפו 400 microliters של האינוקולום המדולל על תאי Vero בשלוש חזרות. דגרו את הלוחות המוחדרים באינקובטור לתרביות רקמה למשך ארבע עד שש שעות.

בסיום הדגירה, החליפו את התוסיף בשני מיליליטר של מצע מועשר בסרום לכל באער. 48 שעות לאחר ההדבקה, ספרו את המוקדים הוויראליים בדילולים המתאימים, באמצעות מיקרוסקופ בניגודיות פאזה (phase contrast). חשבו את הטר של הנגיף כיחידות יוצרות פlaque למילליליטר.

לאחר הדבקת תאי Vero בלוחית בעלת 12 בארות עם טיטרים גבוהים ונמוכים של נגיף הזיקה, ודגירה למשך 48 ו-96 שעות, השכפול של הגנום מוערך באמצעות qPCR להבדיקת ביטוי הגנום של נגיף הזיקה, ובאמצעות אימונוציטוכימיה עבור RNA דו-גדילי.

עבור אימונוציטוכימיה, הסר את המצע מהבארים של פלטת ה-12-well, והוסף מיליליטר אחד של methanol לכל באר. אפשר לתאים לעבור קיבוע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטוף את התאים המקובעים שלוש פעמים ב-1x PBS. לאחר מכן הוסף תמיסת חסימה (blocking buffer) והדגר למשך שעה בטמפרטורת החדר. דלל את הנוגדן המונוקלונלי של עכבר anti-double-stranded RNA J2 ביחס של 1:100 בתמיסת חסימה, הוסף אותו לתאים, והדגר את התאים בתמיסה זו למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, דלל נוגדן משני goat anti-mouse IgG-594 ביחס של 1:1,000 בתמיסת חסימה, ולאחר שטיפת התאים ב-1x PBS, הוסף אותו לתאים והדגר אותם למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים ב-1x PBS, צבע את הגרעינים באמצעות צבע Hoechst, ובחן את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 100x.

שש שעות לאחר זריעה של פלטת 12 בארות בתאי Vero נאיביים, כפי שבוצע לפני כן, יש להוסיף את הציטוקינים הרלוונטיים בריכוזים המצוינים, בשכפולים ביולוגיים. 12 שעות לאחר הטיפול, בצעו הדבקה בנגיף זיקה, והוסיפו בארות של ביקורת שלילית ללא הדבקה. ארבע שעות לאחר ההדבקה, החליפו את האינוקולום הנגיפי במצע מטופל בציטוקינים ולאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 44 שעות נוספות. 48 שעות לאחר ההדבקה, ספרו את הפlaques הנגיפיים באמצעות מיקרוסקופ ניגוד פאזה (phase contrast), וצלמו תמונות מייצגות של תאים מודבקים בהגדלה של 40x.

גרף זה מציג את התוכן הגנומי של נגיף הזיקה כפי שנמדד באמצעות RT-qPCR. פריימרים עבור Genotype Pan ועבור זן PRVABC-59 הראו רגישות וסגוליות שוות. כצפוי, פריימרים של נגיף הפטיטיס-C לא הגבירו אף מוצר.

כאן מוצגת קינטיקת הגדילה של נגיף הזיקה בנקודות הזמן המצוינות בתאים המודבקים בתרבית נמוכה וגבוהה, בהשוואה לקבוצת ביקורת (mock) שאינה מודבקת. תוצאות מבדיקת האימונוציטוכימיה מראות כי 48 שעות לאחר ההדבקה, התאים המודבקים נמצאים במספר צבירים בודדים, בעוד ש-96 שעות לאחר ההדבקה, מרבית התאים מודבקים. גרף זה מראה את הוויסות של גדילת נגיף הזיקה על ידי ציטוקינים שונים, בהשוואה לקבוצת ביקורת עם נשא (vehicle control).

תמונות ניגודיות-מופע (phase-contrast) אלו מציגות תאים מזוהמים בנגיף הזיקה עם או בלי טיפול בציטוקינים. פלאקים ויראליים שנוצרו על ידי תאים מזוהמים נראים כמו מוקדים. שימו לב שבבארים שעברו טיפול באינטרפרון אין פלאקים ויראליים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיפוי דומיינים ברזולוציה גבוהה של נגיף הזיקה לצורך איתור מיקום חלבונים ויראליים ושחזורם בתאי יתוש ותאי אדם, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון הבהרת המנגנון של פתוגנזה של המחלה ואבולוציה של virulent של הנגיף. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים מערכת תרבית זיהומית של נגיף הזיקה in vitro המבוססת על תאי יונקים כדי לחקור את השחזור של נגיף הזיקה, וכן לגבי השימוש בפלטפורמה in vitro לפיתוח תרופות וחיסונים.