Name: מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת במבחנה אפקט מניעתי של אינטרפרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למד כיצד להקים מערכת תרבית תאים זיהומית של נגיף הזיקה באמצעות תאי Vero. שיטה זו מאפשרת ייצור בקנה מידה גדול לפיתוח תרופות וחיסונים נגד ZIKV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר אהרון ברולט ולד"ר ברנדי ראסל מהמרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), ארה"ב על מתן PRVABC59 לזן הנגיפי של זיקה. אנו מודים לניקולס טן מאוניברסיטת ייל על עריכת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר הפרוגרמטי המוסדי של המרכז הרפואי Cedars-Sinai ל-V.A.

הערה: מתאר סכמטי של זרימת העבודה מוצג באיור 1. 1. תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאי Vero לייצור וירוס זיקה וניתוח של מחזור שכפול נגיפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת צמיחה מלאה המכילה 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, פניצילין (100 יחידות / מ&quot;ל), סטרפטומיצין (100 יחידות / מ&quot;ל), ו -10 מ&quot;מ HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי Vero עם מדיום הגידול להשלים שצוין על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol> 2. הפקת וירוס Zika <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי Vero ב 80% צפיפות תאים באמצעות טריפסין 0.25% ב בקבוק T-75 לספור את התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת מהבקבוק תרבות T-75 ולשטוף את התאים עם 2 מ&quot;ל בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של טריפסין 0.25% ו דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מ&quot;ל של סרום המכיל מדיום הגידול כדי להשבית טריפסין. Pipet מעלה ומטה כדי susתאים pend ולהעביר את התאים צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μl של תאים ומערבבים עם כמות שווה של כחול 0.4% trypan. טען את התערובת המוכנה השקופית הקאמרית ספירת תאים ולקבל תא קיימא ספירה באמצעות דלפק תא אוטומטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים סך של 7 מיליון תאים בנפח 30 מ&quot;ל לתוך בקבוק T-160. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להכין ריבוי המתאים של זיהום (0.01 כדי 0.1 משרד הפנים) של הבידוד וירוס Zika בתוך התקשורת והתרבות חינם 10 מ&quot;ל סרום לכל בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה בילה מהבקבוק T-160 ולאחר מכן להוסיף את הבידוד ויראלי מוכן טרי (10 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלוחיות המחוסנות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 4-6 שעות. מורחים את הבידוד על ידי הטיית צלוחיות בעדינות הצידה בכל שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום הדגירה, להחליף את הבידוד עם תקשורת צמיחת סרום בתוספת חמה (30 מיליליטר) עבור כל בקבוק. ואז להמשיך את התרבות הנגיף למשך 96 שעות הקרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההתקדמות בfection על ידי התבוננות במראה של רובד נגיפי על monolayer התא באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב ולקחת תמונות (איור 2) על פי הצורך בהגדלה 40X ו 200X. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> איור 2:. הפלאק נוצר על ידי וירוס Zika על monolayer של תאי Vero תמונות שדה מוארות של בהגדלה שונה מראות רובד נגיפי זיקה ב -48 HPI. הערת הנוכחות של מוקדי תאים מעוגלים על monolayer. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants תרבית תאים קציר בנקודת 96 שעות זמן בצנטריפוגה supernatant XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant מבלי פסולת pelleted מטריד והעברת to 15 מ&quot;ל צינורות. Ultracentrifugation ב 24,000 XG יכול להתבצע להתרכז חלקיקים נגיפיים (אופציונלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את supernatants תרבות ויראלי aliquots המרובה ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. כייל הנגיף Zika מדידת ידי assay פלאק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל היטב 2 מ&quot;ל נפח באמצעות צלחת 12-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להכין פי 10 דילולים סידוריים של supernatants התרבות ויראלי שנאסף מבקבוק T-160 באמצעות סרום ללא מדיה. הסר את המדיה בילתה מבאר כל ולהוסיף 400 μl של בידוד מוכן על תאי Vero בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלוחיות המחוסנות ב 37 ° C עם 5% CO 2 עבור 4-6 שעות. מורחים את הבידוד על ידי הטיית הצלחת בעדינות הצידה בכל שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, להחליף את הבידוד עם תקשורת בסרום השלים (2 מיליליטר לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 שעות חיסון פוסט, לספור את מוקדי ויראלי באמצעות contr שלבמיקרוסקופ אס &#39;. חשב את כייל הנגיף כיחידות פלאק ויוצרים (PFU) לכל מ&quot;ל. ראה איור 3 עבור assay פלאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון ו להכתים את התאים ב 4% פורמאלדהיד פתרון סגול קריסטל 0.1% מוכנים באתנול 20% להדמיה ברורה של הפלאק. </li></ol> 4. Assay שכפול הגנום ויראלי Zika <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל היטב 2 כרכים מ&quot;ל באמצעות צלחת 12-היטב. למחרת, להכין inocula ויראלי (משרד הפנים של 0.01 ו -0.1; 400 μl / טוב) של כייל נמוך וגבוה באמצעות תקשורת חופשית בסרום בשלושה עותקים. עבור זיהום מדומה, השתמש תקשורת חופשית בסרום (400 μl / טוב) בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 3.2 כדי 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות זמן hr 48 ו -96, לאסוף דגימות עבור רנ&quot;א immunocytochemistry (ICC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות RNA קציר, להסיר את המדיה ולאחר מכן להוסיף 400 μl של פתרון תמוגה ישירות היטב כל לאסוף את lysates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כאל, להסיר את המדיה ואת tתרנגולת לתקן את התאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של מתנול זה היטב דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן lysate התא, לבודד RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA לפי הוראות היצרן. לכמת את RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שעתוק לאחור שני שלבים PCR כמותי (RT-qPCR) כדי לקבוע את תוכן הגנום ZIKV מ- RNA שנקטפו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיפוך לתמלל את RNA, הראשון להקים תערובת התגובה 13 μl המורכב של 5 מיקרוגרם של RNA בודד, 1 μl של dNTPs (10 מ&quot;מ), ו 1 μl hexamer אקראי (250 ng) בצינור 0.2 מ&quot;ל. דגירת הצינור ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן למקם אותו על קרח למשך דקה אחת. בהמשך לכך, להוסיף 1 μl של transcriptase הפוכה, 4 μl של חיץ סינתזה גדיל 5x, 1 μl של 0.1 M dithiothreitol, ו 1 μl של מעכב RNase לתערובת התגובה. דגירת הצינור עבור 5 דקות נוספות על 25 מעלות צלזיוס, ואחריו 60 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, inactivאכול את התגובה על ידי חימום עד 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע qPCR באמצעות 1 μl של cDNA וכתוצאה מכך עם 12.5 μl של תמהיל סופר צבע ירוק 2x המכיל DNA פולימרז ו 1 μl של פריימרים הפרט 10 מ&quot;מ ספציפיות וירוס זיקה [פריימרים גנוטיפ-פאן וירוס זיקה (עבור: 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &quot; ; Rev: 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), תחל זן PRVABC59 גנוטיפ אסיה וירוס זיקה (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; Rev: 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], או וירוס הפטיטיס C (F RTQ JFH: 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; R RTQ JFH: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;), או GAPDH גן משק הסלולר (עבור: 5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; Rev: 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;) בהיקף תגובה 25 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע PCR באמצעות התנאי בטווח 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (40 מחזורים) במערכת ה- PCR בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רמת הביטוי GAPDH מבוסס על סף מחזור (CT) ערך לנרמל את Zמדידת הגנום ika ויראלי. חישוב הדלתא CT (ΔCt) ערך של הגנום Zika בהשוואה לזו של GAPDH ולקבל את הערך 2 ΔCt. ואז, לחשב את השינוי לקפל על ידי לקיחת היחס בין תוכן הגנום מנורמל זיקה בין תאים נגועים נגועים בנקודות זמן מצוינות. ראה איור 4 עבור תוצאות שכפול הגנום ZIKV. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ICC באמצעות תאים קבוע מתנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים קבוע שלוש פעמים עם PBS 1x ולחסום עם חיץ חסימת ICC (סרום עיזים 3%, BSA 3%, 0.1% Triton-x 100 ב PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חד שבטיים העכבר J2 נוגדן אנטי dsRNA (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בשעה דילול של 1: 100 בחסימת חיץ דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם 1x PBS ולהוסיף אנטי עכבר עז משני נוגדן IgG-594 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בשעה דילול 1: 1,000 במאגר חסימת דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 1x PBS ואת הכתם עבור הגרעינים באמצעות לצבוע Hoechst ולבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלת 100X (איור 4). </li></ol></li></ol> 5. הקרנת הספרייה ציטוקין מפני הידבקות בווירוסים Zika <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל גם באמצעות צלחת 12-היטב. ברגע שהתאים מצורפים (6 שעות שלאחר זריעה), להוסיף כל ציטוקינים בריכוזים מצוינים כפילויות ביולוגיות (2 מיליליטר נפח / טוב). כלול רכב (PBS) בקר לבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12 שעות לאחר הטיפול, לבצע זיהום ויראלי זיקה (משרד הפנים של 0.1 ב 400 μl לכל היטב). כלול בארות בקרה שלילית ללא זיהום (מדומה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 4 שעות לאחר הפגיעה, להחליף את הבידוד ויראלי עם התקשורת התייחסו ציטוקינים (2 מ&quot;ל). דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 44 שעות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 לאחר הפגיעה hr, לספור רובד נגיפי באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב ולרכוש תמונות נציג של תאים נגועים ב 40X ההגדלה (איור 5). </li></ol>

<ol><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li>
<li>Lucey, D. R., Gostin, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Zika+Pandemic%3A+Enhancing+Preparedness%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness.</a> JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li>
<li>Schuler-Faccini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Association+Between+Zika+Virus+Infection+and+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).</li>
<li>Foy, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probable+non-vector-borne+transmission+of+Zika+virus%2C+Colorado%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA.</a> Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).</li>
<li>Kuno, G., Chang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+sequencing+and+genomic+characterization+of+Bagaza%2C+Kedougou%2C+and+Zika+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses.</a> Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).</li>
<li>Dick, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).</li>
<li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia.</a> Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).</li>
<li>Baronti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+coding+sequence+of+zika+virus+from+a+French+polynesia+outbreak+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013.</a> Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic%2C+Yap+State%2C+Micronesia%2C+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+Zika+virus+in+Western+Hemisphere%2C+2015+%5BLetter%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter].</a> Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).</li>
<li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li>
<li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311(2013).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy%3A+effects+on+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Perinat+Med%22%5BJournal%5D)">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li>
<li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, פרוטוקול יעיל עבור culturing וירוס Zika במבחנה מוצג. צעדים קריטיים כולל, זיהוי נקודות קצה אופטימלית עבור בהרחבת התרבות הנגיף, מדידת כייל, וכימות שכפול הגנום נמסרו. וירוס Zika הוא פתוגן אנושי, כל כך, תוך טיפול חומרים מזהמים, נהלי בטיחות ביולוגיים הם להיות אחריו בקפדנות. שורת תאי קוף כליות, Vero, שמשה הוכחת מבחני virological שונים. קינטיקה שכפול נגיפי זיקה עשוי להיות שונה בתאים של רקמות ומינים שונים. שורות תאים נוספות ניתן להשתמש כפי שתוארו לעיל 15. וירוס Zi...

וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן אדם חשוב הקשורות מיקרוצפליה והריון עניים ותוצאות 1,4. ZIKV שייך הסט של flaviviruses רלוונטי מבחינה רפואית שיכולה לגרום למומים נוירולוגיות כגון דנגי, קדחת הנילוס המערבי, ווירוסים אנצפליטיס בסנט לואיס. המצב העיקרי של שידור ויראלי הוא על ידי וקטור היתוש Aedes aegypti, ובנוסף, העברה מינית גם דווחה 5,6. ZIKV הפך לנושא בריאות הגלובלי גדול בשל ההתפלגות הגיאוגרפית הנרחב של וקטור יתושי הקשר החזק שלה עם מומים מולדים. ZIKV בודד לראשונה בשנת 1947 מקוף רזוס הזקיף ביער Zika, אוגנדה והתיק הראשון של האדם דווחו בשנת 1952 7,8. אנשים כי להידבק ZIKV הנוכחי עם סימפטומים קלים כגון חום, פריחה, כאבי ראש, דלקת הלחמית, ושרירים / כאבי פרקים. אינפקטד נשים בהריון יכולים לשדר ZIKV לעובר המתפתח 1. Zזיהום IKV גם נקשר תסמונת גיאן-בארה, demyelination אוטואימוניות עצבים היקפיים הפרעת 9. הגנום הויראלי Zika מורכב במובן החיובי, מולקולת רנ&quot;א חד-גדילי שזה בערך 10.8 kilobases באורך. מבנה הגנום מאורגן כמו 5&#39;NCR-C-PRM-E-ns1-NS2A-NS2B-ns3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3&#39;NCR, עם אזורים קידוד אי (NCR) איגוף אזור המקודדים חלבונים 6. Polyprotein יחיד (3419 אא) מתורגם כי הוא שיתוף ופוסט translationally ביקע ל -10 פפטידים קטנים. הן 5&#39;NCR ומבני לולאת גזע 3&#39;NCR RNA לשחק תפקיד קריטי תחילתו של תרגום הגנום נגיפי ושכפול. הרכיבים המבניים של הגנום מורכבים של קפסיד, קרום, וחלבוני מעטפה. החלבונים הלא המבניים הם קריטיים עבור שכפול הגנום. נכון לעכשיו, זני הנגיפים Zika מקובצים לשלוש גנוטיפים עיקריים: אפריקה המערביתבמזרח, אפריקה, ואסיה 6,10-13. הוצע כי שושלת מזרח אפריקה התפשטה במערב אפריקה ואסיה, שם הוא מאוחר יותר התפתח 12. הגנוטיפ אסיה אחראי ההתפרצויות הנוכחיות ביבשת אמריקה. וירוס הזיקה יכול להיות מתורבת בשני יתושים בתאי יונקים. פיברובלסטים עורי ראשיים, תאים דנדריטים בשלים, ובתאים עצביים בקליפת המוח, ותאי Vero חשופים לסכנת הדבקה ויראלית Zika 10,14,15. סוג I וסוג שני II אינטרפרונים הוכחו להגביל את שיעור הגידול ZIKV ב fibroblasts העור 15. המטרות של מחקר זה הן לספק פרוטוקול צעד חכם, מפורט לייצור assaying של PRVABC59 זן ויראלי Zika גנוטיפ אסיאתית מערכת תרבית תאים יונקת וכדי להדגים את התועלת של מערכת התרבות זיהומיות זו כפלטפורמה לפיתוח תרופות. משאב זה הוא בעל פוטנציאל תועלת רב קהילת המחקר ויראלי ונוירולוגיות Zika להבהיר עוד iמנגנוני ts של בפתוגנזה ואבולוציה ויראלי של ארסיות ויראלי.

<table><tbody><tr><td>דולבקו s שונה Eagle' s medium (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% טריפסין, 10x [-] פנול אדום&nbsp; &nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כתם כחול 0.4%</td> <td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>רוזנת &ndash; מונה תאים אוטומטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>ספירת תאים רוזנת&nbsp; שקופיות תא</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy מיני</td><td>קיט Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי נגד dsRNA J2&nbsp;</td><td>אנגלית & ייעוץ מדעי Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>ללא RNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cell Line&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>זן נגיפי זיקה PRVABC59</td><td>המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 אלפא&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>פפרוטק</td><td>200-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-אלפא</td><td>פפרוטק</td><td>300-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אינטרפרון אלפא A&nbsp; &nbsp;</td><td>מו"פ & D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>Interferon beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי עם Nikon Intenselight C-HGFI</td><td></td><td>Nikon בקר ניקון לבקשה</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן מתעוררים מקושר ליקויים התפתחותיים בעובר כגון מיקרוצפליה, פגמי עין, וצמיחה לקויה. ZIKV הוא וירוס RNA של המשפחה Flaviviridae. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושים, אבל יכול גם להיות מופץ על ידי אימהי העברה אנכית עוברת וכן מגע מיני. נכון להיום, לא קיימות אופציות טיפול או חיסון אמין זמינות להגן על אלה שהנגיף יחדור. פיתוח מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס לשחזור, יעיל Zika הוא קריטי לחקר המנגנונים המולקולריים של שכפול ZIKV וכן פיתוח תרופות חיסון. בהקשר זה, פרוטוקול המתאר מערכת התרבות יונקים מבוססי תאים במבחנה Zika וירוס לניתוח בייצור ובצמיחה ויראלי מדווח כאן. פרטים על היווצרות הפלאק על ידי וירוס Zika על monolayer תא ורובד assay למדידת כייל הנגיף מוצגים. קינטיקה שכפול הגנום ויראליביניים replicatory הגנום RNA פעמיים תקועים נחושים. פלטפורמה תרבות זו נוצלה למסך נגד ספריה של קבוצה קטנה של ציטוקינים וכתוצאה מכך לזיהוי-α אינטרפרון (IFN-α), IFN-β ו- IFN-γ כמו מעכבים חזקים של גדילת ויראלי Zika. לסיכום, במבחנת מערכת תרבות ויראלית מדבקת Zika מבחני virological שונים הם הפגינו במחקר זה, אשר יש לו את הפוטנציאל למען קהילת המחקר מאוד הבהרה נוספת המנגנונים בפתוגנזה ויראלי ואת האבולוציה של ארסיות ויראלי. אנטי IFN-alpha ניתן להעריך עוד יותר כאמצעי מניעה מניעתי, שלאחר החשיפה, אפשרות טיפול עבור נגיף Zika באוכלוסיות בסיכון גבוה, כולל בנשים הרות שנדבקו במחלה.

זן ויראלי זיקה (PRVABC59; KU501215 מספר ההצטרפות GenBank) של גנוטיפ אסיה נוצל במחקר זה 12. תאים Vero ב 80% confluency שימשו חוקרת דה נובו זיהום ויראלי Zika. לייצור ויראלי ואפיון Virological עוקב אחד פרקים מוקדמים (P3) וירוס Zika הועסק. הפלאק ויראלי נצפה ביום השני של זיהום. Progenies ויראלי Zika שוחרר מהתא נגוע בתחילה יכול להתפשט תאים שכנים, אשר לגרום להיווצרות פלאק גלוי על תרבות בשכבה (איור 2). השפעת cytopathic ...

Zika Virus (ZIKV), פתוגן מתפתח, קשור להפרעות התפתחותיות בעובר ולמיקרוצפליה. הקמת מערכת תרבית תאים זיהומית יעילה היא חיונית למחקרים על שכפול ZIKV כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות. במחקר זה מומחשות ונדונות בדיקות וירולוגיות שונות הנוגעות לזיק"ו.

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

המטרה הכללית של מחקר זה היא לבסס מערכת תרבית זיהומים של נגיף זיקה in vitro המבוססת על תאי יונקים, כדי לחקור את שחזור נגיף הזיקה, וכן להשתמש בפלטפורמה ה-in vitro לפיתוח תרופות. פרוטוקול מפורט זה, המוגש שלב אחר שלב, עבור מערכת תרבית תאים זיהומית של נגיף הזיקה, יכול לסייע בהבנת המנגנון של פתוגנזה של מחלה המתווכת על ידי נגיף הזיקה ואת התפתחות העוצמה של הנגיף. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור רחב-היקף של נגיף הזיקה לצורך פיתוח תרופות וחיסונים.התחילו בקציר של תאי Vero בצפיפות תאים של 80% בבקבוק תרבית T75, על ידי שאיבת המדיום מהבקבוק ושטיפת התאים בשני מיליליטר של phosphate-buffered saline. הוסיפו שני מיליליטר של 0.25% trypsin והדגרירו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. לאחר ההדגירה, הוסיפו שמונה מיליליטר של מדיום גידול המכיל סרום כדי לבטל את פעילות ה-trypsin. לאחר מכן, העבירו את התאים לנבובת של 15 מיליליטר. בשלב הבא, הוציאו 10 µL של תאים וערבבו עם כמות שווה של 0.4% trypan blue. טענו את התערובת שהוכנה לסרטית של תא תאים והשיגו את מספר התאים החיוניים באמצעות סופר תאים אוטומטי. זרעו סהכול של שבעה מיליוני תאים לבקבוק T160 בנפח של 30 מיליליטר. למחרת, הכינו ריכוז מתאים של multiplicity of infection של אינוקולום של נגיף Zika ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית נטול סרום לכל בקבוק.טיפול בטוח בנגיף הוא קריטי למניעת התפשטות הזיהום.הסר את המצע המרוקן מהבקבוק מסוג T160 ולאחר מכן הוסף את מלוא 10 milliliters של האינוקולום הוויראלי שהוכן טרי. דגרי את הבקבוקים שחושכו ב-37 degrees Celsius עם 5%CO2 למשך ארבע עד שש שעות. פזר את האינוקולום על ידי הטיה עדינה של הבקבוק הצידה בכל שעה של הדגירה. עם סיום ההדגירה, החלף את האינוקולום ב-30 milliliters של מצע גידול חם המועשר בסרום. לאחר מכן, המשך את תרבית הנגיף למשך 96 השעות הבאות. לאחר ארבעה ימים, וודא את התקדמות הזיהום על ידי התבוננות בהופעת פלאקים ויראליים על השכבה החד-תאית של התאים, באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast). צלם תמונות לפי הצורך בהגדלה של 40x ו-200x.אספו את העל-נוזל (supernatants) מתרבית התאים בנקודת הזמן של 96 שעות, וסבבו את העל-נוזל בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר שיירי תאים. לאחר הסבב בצנטריפוגה, הסירו בזהירות את העל-נוזלים מבלי להסיע את המשקע של שיירי התאים, והעבירו אותם למבחנות של 15 milliliters.אחסן את העל-נוזלים של תרבית הווירוסים במכסות (aliquots) מרובות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.כדי לקבוע את תרקיז הנגיף, ראשית זרעו תאי Vero נאיביים למגש של 12 בארות בריכוז של 1x10⁵ תאים לבארה, בנפח של 2 מיליליטר. למחרת, הכינו דילולות סדרתיות של פי 10 של תעליכי תרבית נגיפית, שנאספו מבקבוק T160 באמצעות מצע ללא סרום.בעת הכנת דילולים סדרתיים של עלי-נוזל (supernatant) מתרבית נגיפים לצורך בדיקות תיתור (titer assays), הקפידו לטפל בנגיף באופן בטוח כדי למנוע זיהום.בשלב הבא, הסירו את המצע המרוקן מכל באר בלוח 12 הבארי המכיל תאי Vero, והוסיפו 400 microliters של האינוקולום המדולל על תאי Vero בשלוש חזרות. דגרו את הלוחות המוחדרים באינקובטור לתרביות רקמה למשך ארבע עד שש שעות.בסיום הדגירה, החליפו את התוסיף בשני מיליליטר של מצע מועשר בסרום לכל באער. 48 שעות לאחר ההדבקה, ספרו את המוקדים הוויראליים בדילולים המתאימים, באמצעות מיקרוסקופ בניגודיות פאזה (phase contrast). חשבו את הטר של הנגיף כיחידות יוצרות פlaque למילליליטר.לאחר הדבקת תאי Vero בלוחית בעלת 12 בארות עם טיטרים גבוהים ונמוכים של נגיף הזיקה, ודגירה למשך 48 ו-96 שעות, השכפול של הגנום מוערך באמצעות qPCR להבדיקת ביטוי הגנום של נגיף הזיקה, ובאמצעות אימונוציטוכימיה עבור RNA דו-גדילי.עבור אימונוציטוכימיה, הסר את המצע מהבארים של פלטת ה-12-well, והוסף מיליליטר אחד של methanol לכל באר. אפשר לתאים לעבור קיבוע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטוף את התאים המקובעים שלוש פעמים ב-1x PBS. לאחר מכן הוסף תמיסת חסימה (blocking buffer) והדגר למשך שעה בטמפרטורת החדר. דלל את הנוגדן המונוקלונלי של עכבר anti-double-stranded RNA J2 ביחס של 1:100 בתמיסת חסימה, הוסף אותו לתאים, והדגר את התאים בתמיסה זו למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, דלל נוגדן משני goat anti-mouse IgG-594 ביחס של 1:1,000 בתמיסת חסימה, ולאחר שטיפת התאים ב-1x PBS, הוסף אותו לתאים והדגר אותם למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים ב-1x PBS, צבע את הגרעינים באמצעות צבע Hoechst, ובחן את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 100x.שש שעות לאחר זריעה של פלטת 12 בארות בתאי Vero נאיביים, כפי שבוצע לפני כן, יש להוסיף את הציטוקינים הרלוונטיים בריכוזים המצוינים, בשכפולים ביולוגיים. 12 שעות לאחר הטיפול, בצעו הדבקה בנגיף זיקה, והוסיפו בארות של ביקורת שלילית ללא הדבקה. ארבע שעות לאחר ההדבקה, החליפו את האינוקולום הנגיפי במצע מטופל בציטוקינים ולאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 44 שעות נוספות. 48 שעות לאחר ההדבקה, ספרו את הפlaques הנגיפיים באמצעות מיקרוסקופ ניגוד פאזה (phase contrast), וצלמו תמונות מייצגות של תאים מודבקים בהגדלה של 40x.גרף זה מציג את התוכן הגנומי של נגיף הזיקה כפי שנמדד באמצעות RT-qPCR. פריימרים עבור Genotype Pan ועבור זן PRVABC-59 הראו רגישות וסגוליות שוות. כצפוי, פריימרים של נגיף הפטיטיס-C לא הגבירו אף מוצר.כאן מוצגת קינטיקת הגדילה של נגיף הזיקה בנקודות הזמן המצוינות בתאים המודבקים בתרבית נמוכה וגבוהה, בהשוואה לקבוצת ביקורת (mock) שאינה מודבקת. תוצאות מבדיקת האימונוציטוכימיה מראות כי 48 שעות לאחר ההדבקה, התאים המודבקים נמצאים במספר צבירים בודדים, בעוד ש-96 שעות לאחר ההדבקה, מרבית התאים מודבקים. גרף זה מראה את הוויסות של גדילת נגיף הזיקה על ידי ציטוקינים שונים, בהשוואה לקבוצת ביקורת עם נשא (vehicle control).תמונות ניגודיות-מופע (phase-contrast) אלו מציגות תאים מזוהמים בנגיף הזיקה עם או בלי טיפול בציטוקינים. פלאקים ויראליים שנוצרו על ידי תאים מזוהמים נראים כמו מוקדים. שימו לב שבבארים שעברו טיפול באינטרפרון אין פלאקים ויראליים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיפוי דומיינים ברזולוציה גבוהה של נגיף הזיקה לצורך איתור מיקום חלבונים ויראליים ושחזורם בתאי יתוש ותאי אדם, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון הבהרת המנגנון של פתוגנזה של המחלה ואבולוציה של virulent של הנגיף. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים מערכת תרבית זיהומית של נגיף הזיקה in vitro המבוססת על תאי יונקים כדי לחקור את השחזור של נגיף הזיקה, וכן לגבי השימוש בפלטפורמה in vitro לפיתוח תרופות וחיסונים.

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת שיפור תלוי נוגדנים (ADE) של זיהום בנגיף דנגי באמצעות סרום החלמה של נגיף זיקה. הבדיקה משתמשת בחלקיקים נגיפיים של כתב דנגי (RVPs) המקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק. נוגדנים בסרום נגד נגיף הזיקה מגיבים בהצלבה עם RVPs ליצירת קומפלקס. הנוגדנים הקשורים מגבירים את ספיגת RVP על ידי תאים המבטאים את קולטן Fc, אשר מזוהה באמצעות ציטומטריית זרימה.

בדיקה חוץ גופית לבחינת שיפור תלוי נוגדנים של זיהום ויראלי

הסרטון מדגים בדיקת מבחנה לבדיקת אינטרפרונים בעלי פעילות אנטי-ויראלית נגד נגיף הזיקה, פתוגן אנושי. בתוך התא המארח, נגיף הזיקה עובר הכפלה עם הפנמתו, מדביק תאים שכנים ויוצר אזורים מובחנים או רבדים נגיפיים. אינטרפרון מסוג I, הפועל כסוכן אנטי-ויראלי, מעכב את הכפלת הנגיף, ובכך מונע היווצרות של פלאקים נגיפיים בתא המארח monolayer.

בדיקת מבחנה לבדיקת אינטרפרונים כמעכבים חזקים של צמיחת נגיף זיקה

סרטון זה מדגים הליך להדבקת תאי גזע עצביים עובריים אנושיים בנגיף זיקה. התאים הנגועים יכולים לשמש למחקרים נוספים.

זיהום בנגיף הזיקה של תאי גזע עצביים עובריים

פרוטוקול זה מתאר את ההתאוששות של וירוס זיהום זיהומיות משני שיבוט cDNA שני פלסמיד זיהומיות.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

כאן נתאר שיטת יצירת מודל של Zika הנוצרות על-ידי וירוס microcephaly עכבר. פרוטוקול זה כולל שיטות חיסון גרם עובריים neonatal, מבוגר-שלב של הנגיף Zika.

יצירת מודלים העכבר עבור וירוס Zika-induced הפרעות נוירולוגיות באמצעות הזרקת גרם אסטרטגיות: עובריים Neonatal, למבוגרים

מאמר זה מפרט את שיטות המשמשות כדי להרחיב את תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי תרבות, כמו גם כיצד להבדיל אותם לתוך תת עצביים שונים, האסטרוציטים, תוך שימת דגש על השימוש בתאי גזע עצביים ללמוד Zika בנגיף.

זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical

פרוטוקול להעריך תגובות תא T אנטיגן ספציפי באיברים immunoprivileged של Ifnar1- / - מאתר מודל עבור זיהום בנגיף (ZIKV) Zika מתואר. בשיטה זו הוא מרכזי בשביל לחקור את המנגנונים התאיים של ההגנה, השיגה חיסונים ZIKV, והוא גם יקר להערכת היעילות שלהם.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

אנו מתארים שיטה להעריך את ההשפעה של הקיימת מראש חסינות מפני וירוס דנגה על זיהום בנגיף Zika באמצעות בנסיוב אדם ראשי תאים אנושיים, כימות זיהום על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

המטרה של הפרוטוקול היא להדגים את הטכניקות המשמשות לחקירת מחלה נגיפית על ידי בידוד וכימות וירוס Zika, מאיברים מרובים בעכבר לאחר ההדבקה.

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

בעבודה זו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזים מבוססות replicon ויראלי כדי לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה.

בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

כאן, אנו מדגימים את השימוש בעכבה חשמלית מבוססת תאים (CEI) כשיטה קלה ופשוטה מאוד לחקר זיהום ושכפול נגיף זיקה בתאים אנושיים בזמן אמת. יתר על כן, בדיקת CEI שימושית להערכת תרכובות אנטי-ויראליות.

פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

למד כיצד להקים מערכת תרבית תאים זיהומית של נגיף הזיקה באמצעות תאי Vero. שיטה זו מאפשרת ייצור בקנה מידה גדול לפיתוח תרופות וחיסונים נגד ZIKV.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת

גלה סרטונים נוספים