הפקת קפסולות צמחית עבור יישומי מיקרואנקפסולציה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס תהליך יעיל להפקת קפסולות אקסיין של ספורופולינין (Sporopollenin Exine Capsules), או SECs, עבור יישומי מיקרו-אנקפסולציה. שיטה זו יכולה לספק במהירות לכידה מיקרוסקופית נקייה עבור יישומי מזון ובריאות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לצמצם משמעותית את זמן תהליך ההפקה של ה-SECs כדי להפיק SECs נקיים ושלמים.

על אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תהליך המיצוי המיועל של SEC, ואפיון מפורט שלב אחר שלב, ניתן להשתמש בה גם כדי לבחון הערכות מיקרו-מבניות ומורפולוגיות בסיסיות של ביו-חומרים שונים ממקור צמחי. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה בשל תהליך המיצוי המקובל הנמשך 8 עד 10 ימים, הכולל חומצות קורוזיביות מאוד בטמפרטורות גבוהות. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו מערך רפלקס במנדף כימיים הכולל קונדנסור זכוכית, מערכת לסירקולציית מים ואמבט מים.

כיוון שתהליך המיצוי ב-SEC כרוך בשימוש בחומצות קורוזיביות ביותר ובממס אורגני, יש לבצע את התהליך עם ציוד מגן אישי מתאים, כגון משקפי מגן, חלוק מעבדה, מסכת פנים וכפפות, בהתאם להסמנות הסיכון. שקלו בזהירות 100 grams של נבגי L clavatum מבלי ליצור אבק והרחק מכל מקור הצתה. לאחר מכן, העבירו לאט את הנבגים לבקבוק תחתית עגולה מ-PTFE בנפח של one-liter עם מוט ערבוב מגנטי.

הוסיפו 500 milliliters של acetone לנבגים ונערה בעדינות את הבקבוק כדי ליצור תמיסה הומוגנית. כעת הניחו את הבקבוק במקלח מים המכוון ל-50 degrees Celsius ומחובר למקרר רפלקס. חממו את התמיסה לרפלקס במשך שש שעות תוך ערבוב ב-200 RPM.

לאחר שהתגסיה התקררה בטמפרטורת החדר, סננו אותה באמצעות נייר סינון תחת ואקום ואספו את הנבגים מנוקי השומן לצלוחיות פטרי זכוכית גדולות. ייבשו את הנבגים בטמפרטורת החדר על ידי כיסוי צלוחיות הפטרי בנייר אלומיניום עם חורים למניעת התאיידות הממס. לאחר העברת הנבגים היבשים ומנוקי השומן לבקבוק PTFE בנפח של ליטר אחד, הוסיפו 500 milliliters של תמיסת 85%phosphoric acid.

הנח את הבקבוק באמבט מים שהוצב על 70 °C וחבר אותו לקונדנסור לרפלקס. חמם את התוך תלוי (suspension) לרפלקס למשך 30 שעות תוך כדי ערבוב. לאחר שהתוך תלוי התקרר לטמפרטורת החדר, דלל אותו עם 500 milliliters של מים דה-יונסטריים חמימים, ואסוף את ה-SECs באמצעות סינון בוואקום עם נייר סינון.

לאחר מכן, העבירו את ה-SECs לכוס כימית מזכוכית בנפח של שלושה ליטרים כדי לבצע סדרת שטיפות. בתוך מראת המנדף, הוסיפו 800 millimeters של מים דה-יוניים חמים ל-SECs וערבבו בעדינות במשך 10 דקות. לאחר מכן, סננו את התוך תחת ואקום באמצעות נייר סינון.

העבירו את ה-SECs לכלי זכוכית (beaker) נקי בנפח של שלושה ליטרים. לאחר חזרה על השלבים הקודמים חמש פעמים, הוסיפו ל-SECs כ-600 milliliters של אצטון חם, וערבבו בעדינות במשך 10 דקות. אספו את ה-SECs באמצעות סינון בוואקום והעבירו אותם לכלי זכוכית (beaker) נקי בנפח של שלושה ליטרים.

לאחר חזרה על השלבים הקודמים עם הממיסים המתאימים, העבירו את ה-SECs הנקיים לשישה צלחות פטרי גדולות מזכוכית, וייבשו במנדף בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי להסיר את כל המים. לאחר מכן, ייבשו את ה-SECs בתנור ואקום בטמפרטורה של 60 °C ובואקום של 1 mbar למשך 10 שעות, או עד להשגת משקל קבוע. לאחר מכן, העבירו את ה-SECs המיובשים לבקבוק פוליפרופילן לאחסון בארון ייבוש.

הכינו 1.2 milliliters של תמיסת Bovine Serum Albumin, או BSA, במים דה-יוניים, והעבירו אותה לשפופרת פוליפרופילן של 50 milliliters. הוסיפו 150 milligrams של SECs לתמיסת ה-BSA. ערבלו את התערובת במכשיר vortex למשך 10 דקות כדי ליצור תמיסה הומוגנית.

לאחר כיסוי המבחנה בנייר סינון, העבירו אותה לבקבוק של מייבש בהקפאה (freeze dryer) וייבשו למשך ארבע שעות בוואקום של 1 millibar. לאחר שה-SECs הטעונים ב-BSA יבשו, גרסו את הגושים באמצעות מכתש ועלי. כעת, העבירו את ה-SECs הטעונים ב-BSA למבחנה בנפח 50 milliliter והוסיפו 2 milliliters של מים דה-יוניים כדי להסיר את ה-BSA השארי.

אספו את ה-SECs על ידי סרכזגציה ב-4,704 xg למשך חמש דקות. בסיום, השליכו את הנוזל העליון (supernatant). חזרו על השטיפה עם מים דאיונליים.

לאחר מכן, כסו את המבחנה המכילה את ה-SECs הטעונים ב-BSA בנייר סינון. לאחר מכן, העבירו את ה-SECs למקפיא למשך שעה אחת. ייבשו את ה-SECs בהקפאה (Freeze dry) למשך 24 שעות.

יש לאחסן את ה-SECs במקפיא עד לאפיון נוסף. השתמש בחמישה מיליגרם של SECs הטעונים ב-BSA בתוך מבחנה מפוליפרופילן של שני מיליליטר. הוסף 1.4 מיליליטר של PBS וערבב במכשיר vortex למשך חמש דקות.

לאחר מכן, בצע סוניקציה של התגסוס באמצעות פרוב בעוצמה של 40% amplitude למשך שלושה מחזורים של עשר שניות. בסיום, סנן את התמיסה באמצעות מסנן polyethersulfone של 0.45 micron. לאחר ביצוע השלבים הקודמים עם ה-SECs של הפלצבו, מדוד את הבליעה של ה-SECs הטעונים ב-BSA באורך גל של 280 nanometers, תוך שימוש בפלצבו כדגימת blank.

לבסוף, יש לכמת את כמות ה-BSA שהוכנסה לקפסולציה באמצעות עקומת סטנדרט של BSA ב-PBS. תמונות SEM מצביעות על נבגים שלמים בעלי מיקרו-מבנה ייחודי, ולפני העיבוד נצפו אורגנלות ספורופלזמיות בקנה מידה של מיקרון בתמונת החתך הרוחבי. לאחר הסרת השומן מהנבגים וטיפול בבסיס, לא נצפו שינויים מורפולוגיים או מבניים.

תמונות SEM לאחר אסידוליזה (acidolysis) מראות SECs שלמים נטולי חומרים ספורופלזמיים. בניתוח CHN לא נצפתה הסרה משמעותית של חומרים חלבוניים ב-SECs שעברו ניקוי משומן וטיפול בבסיס. רוב החומרים החלבוניים מוסרים באמצעות אסידוליזה.

ניתוח DIPA מראה התפלגות גודל אחידה של SECs לאחר אסידוליזה למשך עד 30 שעות. השלמות המבנית של ה-SECs פוחתת עם הארכת משך האסידוליזה. נתוני SEM ו-DIPA מראים כי לאחר שלב הסרת השומן, האסידוליזה הניבה SECs שלמים בעלי התפלגות גודל אחידה.

נתוני CLSM מעידים כי SECs שאינם מטופלים מראים פלואורסצנציה עצמית עקב מרכיבי ספורופלזמה בתוך חלל הנבג. לאחר עיבוד של acidolysis בלבד, כל תכני הספורופלזמה מוסרים. לאחר כמיסה של FITC-BSA, נצפית פלואורסצנציה ירוקה בתוך ה-SECs.

תמונות ה-SEM מראות חריצים מיקרוסקופיים (micro-ridges) שלמים לאחר טעינת BSA. לא נצפו שינויים משמעותיים בקוטר, בעגוליות ובמכפלה היחסית (aspect ratio) לאחר טעינת BSA לתוך SECs. כימות BSA מתוך SECs המעטפים מאשר את עקביות תהליך המיקרו-כמיסה (microencapsulation), עם טעינה של 0.170 פלוס או מינוס 0.01 גרם של BSA לגרם של SECs.

לאחר השליטה בטכניקה, תהליך מיצוי ה-SEC המהיר הזה יכול להסתיים בתוך 48 שעות אם הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון לבצע הליך זה עבור נבגי צמחים ופולן שונים, חשוב לזכור לבצע הערכה שלבית של ניתוחים מורפולוגיים מבניים ואלמנטריים כדי להשיג קפסולות נקיות ושלמות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע תהליכי מיצוי אחרים הכוללים אנזימים בסיסיים כדי לבדוק את היתכנות התהליך המיועל עבור קפסולות מגוונות ממקור צמחי.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי המיקרו-כמוסה (microencapsulation), הובלת תרופות והנדסת רקמות לבחון SECs מגוונים ממקור צמחי כביומטריאלים מהדור הבא. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן המיצוי והאפיון של SECs מנבגי צמחים וגרגירי פולן, וכן לגבי ביצוע כמיסה של תרופות וביומקרו-מולקולות לתוך SECs.