הפקת קפסולות צמחית עבור יישומי מיקרואנקפסולציה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס תהליך יעיל למיצוי כמוסות אקסין ספורופולנין, או SECs ליישומי מיקרו-אנקפסולציה. שיטה זו יכולה לספק במהירות מיקרו-לכידת מיקרו נקייה ליישומי מזון ובריאות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להפחית משמעותית את זמן תהליך החילוץ של SEC כדי לייצר SECs נקיים ושלמים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תהליך המיצוי היעיל של ה-SEC, ואפיון נרחב בשלבים, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור הערכות מיקרו-מבניות ומורפולוגיות בסיסיות של ביו-חומרים שונים מבוססי צמחים. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל תהליך המיצוי הקונבנציונלי של 8 עד 10 ימים, הכולל חומצות קורוזיביות מאוד בטמפרטורות גבוהות. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו מערך ריפלוקס במכסה אדים עם מעבה זכוכית, מערכת זרימת מים ואמבט מים.

מכיוון שתהליך מיצוי ה-SEC כולל שימוש בחומצות קורוזיביות מאוד וממס אורגני, יש לבצע את התהליך עם ציוד מגן אישי מתאים כגון משקפי מגן, מעיל מעבדה, מסכת פנים וכפפות עם התראה על סכנה. שקלו בזהירות 100 גרם של נבגי L clavatum מבלי ליצור אבק והרחק מכל מקור הצתה. לאחר מכן, העבירו לאט את הנבגים לבקבוק תחתון PTFE עגול בנפח ליטר אחד עם מוט ערבוב מגנטי.

הוסף 500 מיליליטר אצטון לנבגים ונער את הבקבוק בעדינות ליצירת מתלה הומוגני. כעת הניחו את הבקבוק באמבט מים המוגדר על 50 מעלות צלזיוס ומחובר למעבה הריפלוקס. מחממים את המתלה לריפלוקס למשך שש שעות תוך ערבוב בחום של 200 סל"ד.

לאחר שאפשרו לתרחיף להתקרר בטמפרטורת החדר, סננו אותו באמצעות נייר סינון תחת ואקום ואספו את הנבגים נטולי השומן בצלחות פטרי זכוכית גדולות. יבש את הנבגים בטמפרטורת החדר על ידי כיסוי צלחות הפטרי בנייר אלומיניום עם חורים לאידוי ממס. לאחר העברת הנבגים היבשים המיובשים ונטולי השומן לבקבוק PTFE של ליטר אחד, הוסף 500 מיליליטר של תמיסת חומצה זרחתית 85%.

הניחו את הבקבוק באמבט מים בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס וחברו אותו למעבה הריפלוקס. מחממים את ההשעיה לריפלוקס למשך 30 שעות תוך ערבוב. לאחר שהמתלה התקרר לטמפרטורת החדר, יש לדלל אותו ב-500 מיליליטר מים חמים נטולי יונים, ולאסוף את ה-SECs על ידי סינון ואקום באמצעות נייר סינון.

לאחר מכן, העבירו את ה-SECs לכוס זכוכית של שלושה ליטר לביצוע סדרה של כביסות. במכסה האדים מוסיפים 800 מילימטרים של מים חמים נטולי יונים ל-SECs ומערבבים בעדינות במשך 10 דקות. לאחר מכן, סנן את המתלה באמצעות נייר סינון תחת ואקום.

העבירו את ה-SECs לכוס זכוכית נקייה של שלושה ליטר. לאחר חזרה על השלבים הקודמים חמש פעמים, הוסיפו 600 מיליליטר אצטון חם ל- SEC, וערבבו בעדינות במשך 10 דקות. אוספים את ה-SECs על ידי סינון בוואקום ומעבירים אותם לכוס זכוכית נקייה של שלושה ליטר.

לאחר חזרה על השלבים הקודמים עם הממיסים המתאימים, העבירו את ה-SECs הנקיים לשש צלחות פטרי זכוכית גדולות, וייבשו במנדף אדים בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי להסיר את כל המים. לאחר מכן, יבשו את ה-SECs בתנור ואקום בחום של 60 מעלות צלזיוס ומיליבר אחד של ואקום למשך 10 שעות, או עד למשקל קבוע. לאחר מכן, העבירו את ה-SECs המיובשים לבקבוק פוליפרופילן לאחסון בארון יבש.

הכינו 1.2 מיליליטר של אלבומין סרום בקר, או תמיסת BSA במים נטולי יונים, והעבירו אותו לצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר. הוסף 150 מיליגרם של SECs לתמיסת ה-BSA. מערבלים את התערובת למשך 10 דקות ליצירת תמיסה הומוגנית.

לאחר כיסוי הצינור בנייר פילטר, העבירו אותו לבקבוק מייבש הקפאה וייבשו במשך ארבע שעות עם ואקום במיליבר אחד. לאחר שה-SECs העמוסים ב-BSA יבשים, הסר את הצברים בעזרת מכתש ועלי. כעת העבירו את ה-SECs העמוסים ב-BSA לצינור של 50 מיליליטר והוסיפו שני מיליליטר של מים נטולי יונים כדי להסיר את שאריות ה-BSA.

אסוף את ה-SECs על ידי צנטריפוגה ב-4, 704 למשך חמש דקות. בסיום, השליכו את הסופרנטנט. חזור על הכביסה במים נטולי יונים.

לאחר מכן, כסה את הצינור המכיל את ה-SECs הטעונים ב-BSA בנייר סינון. לאחר מכן, העבירו את ה-SECs למקפיא למשך שעה. מקפיאים לייבש את ה-SECs למשך 24 שעות.

אחסן את ה-SECs במקפיא עד לאפיון נוסף. השתמש בחמישה מיליגרם של SECs טעוני BSA בצינור פוליפרופילן של שני מיליליטר. הוסף 1.4 מיליליטר PBS ומערבולת למשך חמש דקות.

לאחר מכן, בדוק את המתלה ב-40% משרעת למשך שלושה מחזורים של עשר שניות. בסיום, סנן את התמיסה באמצעות מסנן פוליאתרסולפון 0.45 מיקרון. לאחר ביצוע השלבים הקודמים עם SECs פלצבו, מדוד את הסופגים של SECs טעוני BSA ב-280 ננומטר באמצעות פלצבו כריק.

לבסוף, כמת את כמות ה-BSA העטופה באמצעות עקומה סטנדרטית של BSA ב-PBS. תמונות SEM מצביעות על נבגים שלמים עם מיקרו-מבנה ייחודי ולפני העיבוד נצפו אברונים ספורופלזמיים בקנה מידה מיקרוני בתמונת החתך. עם הסרת שומן נבגים וטיפול באלקלי, לא נצפו שינויים מורפולוגיים ומבניים.

תמונות SEM לאחר חמצת מראות SECs שלמים נטולי חומרים ספורופלזמיים. לא נצפתה הסרת חומר חלבוני משמעותית ב-SECs נטולי שומן ומטופלים באלקלי על ידי ניתוח CHN. רוב החומרים החלבונים מוסרים באמצעות חמצת.

ניתוח DIPA מראה את התפלגות הגודל האחידה של SECs לאחר חמצת עד 30 שעות. השלמות המבנית של SEC פוחתת עם חמצת ממושכת. נתוני SEM ו-DIPA מראים כי לאחר שלב הסרת השומן, חמצת ייצרה SECs שלמים עם התפלגות בגודל אחיד.

נתוני CLSM מצביעים על כך ש-SECs לא מטופלים מציגים פלואורסצנטיות אוטומטית עקב מרכיבי ספורופלזמה בתוך חלל הנבגים. לאחר עיבוד חמצת בלבד, כל התוכן הספורופלזמי מוסרים. לאחר עטיפה של FITC-BSA נצפית תפרחת ירוקה בתוך ה-SEC.

תמונות ה-SEM מציגות מיקרו-רכסים שלמים לאחר טעינת BSA. לא נצפו שינויים מהותיים בקוטר, במעגליות וביחס הגובה-רוחב לאחר טעינת BSA ל-SEC. כימות BSA מ-SECs עטופים מאשר את העקביות של תהליך המיקרו-אנקפסולציה עם 0.170 פלוס או מינוס 0.01 גרם של טעינת BSA לגרם של SEC.

לאחר השליטה, תהליך מיצוי SEC יעיל זה יכול להיעשות תוך 48 שעות אם הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה עבור נבגי צמחים ואבקה שונים, חשוב לזכור הערכה צעדית של ניתוח מורפולוגי ויסודי מבני כדי להשיג כמוסות שלמות ונקיות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע תהליכי מיצוי נוספים הכוללים אנזימים אלקליים על מנת לבדוק את היתכנות התהליך האופטימלי עבור כמוסות צמחיות מגוונות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרו-אנקפסולציה, אספקת תרופות והנדסת רקמות לחקור SECs מגוונים מבוססי צמחים כביו-חומרים מהדור הבא. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ ולאפיין SECs מנבגי צמחים וגרגרי אבקה, כמו גם לבצע אנקפסולציה של תרופות וביו-מקרומולקולות לתוך SECs.