שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוסקופיה כדי לנתח את היווצרותם של ביופילמים חיידקיים על קורים חוטיים. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כמו למשל כיצד ביופילם חיידקי נוצר על קורים, עד כמה הם ספציפיים וממה הם עשויים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור היווצרות ביופילם חיידקי על קורים פטרייתיים בקנה מידה מרובה, מטווחי ננומטר ועד סנטימטר.

הדגמת ההליך תיעשה על ידי קורה מיקל גואנוק מהמעבדה שלי, וכריסטוף רוז, מהנדס מיקרוסקופ אלקטרונים מפלטפורמת INRA PTEF. כדי להתחיל, הכינו ממברנות צלופן בקוטר זהה לכלי הפטרי, ואז הניחו אותן ב-EDTA רותח למשך 30 דקות. לאחר מכן השתמש במים נטולי יונים כדי לשטוף את הסדינים ולבצע חיטוי פעמיים.

להכנת תרביות טרום פטרייתיות, יש לחסן את הפטרייה על מדיום אגר, מכוסה בקרום צלופן שטופל מראש על ידי EDTA. דגרו על התרביות בטמפרטורה אופטימלית כדי להשיג מושבות בקוטר של סנטימטר אחד בערך. מהתרבית המוקדמת, יש לחסן צלחת פטרי של מדיום אגר מתאים, מכוסה בקרום הצלופן EDTA באמצעות אזמל כדי לגרד בעדינות את האזור החיצוני של מושבה לפני תרבית, ולאחר מכן להעביר את הקורות לצלחת האגר

דגרו על הצלחות בטמפרטורה אופטימלית עד שהמושבות בקוטר של כסנטימטר אחד. כדי להכין תרביות חיידקים כגון P.fluorescens BBc6, השתמש בלולאה סטרילית כדי לאסוף שתיים עד שלוש מושבות חיידקים בודדות ממדיום אגר, ולחסן 25 מיליליטר של LB. דגרו את התרבות בטמפרטורה אופטימלית למשך הלילה. לאחר גידול החיידקים בן לילה, צנטריפוגה את התרבית ב -5, 000 פעמים גרם למשך שלוש דקות.

ואז השעו את הגלולה ב -25 מיליליטר של מאגר אשלגן פוספט סטרילי 0.1 מולרי. לאחר חזרה על הצנטריפוגה, השתמש באותו מאגר כדי להתאים את ריכוז החיידקים הסופי ל-10 עד התאים התשיעי למיליליטר. מלאו מיקרופלייט בן שש בארות בחמישה מיליליטר של תרחיף החיידקים.

השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לחתוך את קרום הצלופן של תרבית הפטרייה לריבועים, עם מושבה אחת על כל קרום. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות ריבועי צלופן המכילים קורים מהמדיום המוצק, והעביר אותם לבארות בודדות של תרחיף החיידקים. נער בעדינות את המיקרופלטה עד שמושבות הפטריות מנותקות מהצלופן.

לאחר מכן הסר את יריעות הצלופן והשאיר את מושבות הפטריות בצלחת. דגרו את המיקרופלייט בתסיסה עדינה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך זמן מה בהתאם לזנים המשמשים ולשלב שיש לנתח. עבור P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor, דגרו על התרביות למשך 30 דקות כדי לקבל ביופילמים בשלב מוקדם, ועד 16 שעות עבור ביופילמים בוגרים.

כדי להסיר חיידקים פלנקטוניים וחיידקים המחוברים אלקטרוסטטית לקורים, שטפו את הפטרייה על ידי העברתה למיקרופלטה חדשה בת שש בארות מלאה בתמיסת מלח חזקה. יש לנער בעדינות את הצלחת למשך דקה. העבירו את הפטרייה למיקרופלטה חדשה בת שש בארות המכילה חמישה מיליליטר של מאגר אשלגן פוספט סטרילי של 0.1 מולארי.

נערו בעדינות את הצלחת במשך שתי דקות, ולאחר מכן העבירו את הפטרייה למאגר טרי. תוך שמירה על מושבת הפטריות במאגר, השתמש באזמל כדי לחתוך את המושבה בערך לשניים. העבירו מחצית מהמושבה לצביעה לצלחת פטרי המכילה מיליליטר אחד של מים סטריליים, בתוספת צבע פלואורסצנטי מתאים כדי להמחיש את רשת הפטרייה, כגון נבט חיטה אגלוטינין מצומד ל-Alexa Fluor 633.

ואז דגרו את הדגימה בחושך. לאחר הצביעה, שטפו את הדגימה על ידי העברתה למכסה צלחת פטרי המכיל 10 מיליליטר של מאגר אשלגן פוספט סטרילי 0.1 מולארי, ונערו בעדינות למשך דקה. טבלו למחצה שקופית במכסה צלחת הפטרי, ומקמו בעדינות את החלק החתוך כך שיצוף מעל המגלשה.

לאחר מכן הרם לאט את השקופית מתמיסת החיץ, ואפשר לדגימה להתיישב בעדינות על המגלשה. ההיבט העדין ביותר הוא מיקום המדגם בשקופית. כדי להימנע מתיאור ביופילם, יש לטבול את הדגימה ואת השקופית בזמן מיקום הדגימה, ואסור להזיז את הדגימה יותר לפני ההדמיה.

לבסוף, הוסף לדגימה 10 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה, וכסה אותו בתלוש כיסוי זכוכית. בחן את השקופיות תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי עם מטרה של פי 10 או פי 40. השתמש בשילוב של סריקת אריחים ופונקציות Z-stack כדי לקבל תצוגות גלובליות תלת-ממדיות של מושבת הפטריות והביופילמים.

לביצוע מיקרוסקופ אלקטרונים, לאחר שטיפת הפטרייה בתמיסת מלח חזקה כמו קודם, העבירו את הפטרייה למים סטריליים ולא לחצץ כדי למנוע היווצרות גבישי מלח בשלב ההתייבשות. העבירו את הביופילמים למחזיק דגימה, והסירו עודפי מים. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לתא של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלחץ משתנה.

בשלב קירור פלטייר, הקפיאו את הדגימה ל-50 מעלות צלזיוס שליליות, מה שאפשר לה להתייבש לאט ישירות בתא ה-SEM, עם 100 פסקל של לחץ משתנה מוגדר למשך 15 שעות. אחזר את הדגימה והעביר אותה למערכת תצהיר סרט ואקום גבוה. לאחר מכן מצפים את הדגימה בשני ננומטר פלטינה מתחת לפלזמת ארגון.

התבונן בדגימה המצופה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק, עם אקדח פליטת שדה באמצעות גלאי בתוך העדשה ברזולוציה גבוהה, ומתח גבוה אלקטרוני של קילו-וולט אחד. ניתוח מזו-קנה מידה זה של ביופילמים מדגים את ההתפלגות ההטרוגנית של הביופילם של P.fluorescens BBc6 בירוק על קורי L.bicolor S238N, המוצג באדום. הניתוח גם איפשר מעקב אחר היווצרות הביופילם לאורך זמן, מהשלבים המוקדמים שבהם רק חלק מהחיידקים המתויגים ב-GFP הוצמדו לקורים, המוצגים באדום, ועד להיווצרות ביופילם עבה ובוגר.

כפי שמוצג כאן, התמונות ברזולוציה גבוהה בקנה מידה בינוני שימשו גם לביצוע ניתוח בקנה מידה מיקרו, כדי להשיג ארכיטקטורות מושבה. בנוסף, ברזולוציה גבוהה זו, הקרנה בעוצמה מקסימלית דו-ממדית של תמונה קונפוקלית תלת מימדית, תיוג ספציפי עם SYPRO Ruby, המוצג באדום, מצביע על נוכחות חלבונים במטריצה, עם חיידקי BBc6 המסומנים על ידי GFP ופטרייה FUN-1 המסומנת בירוק כהה. לאחר התייבשות וקידוד של אותה דגימה, פרטים נוספים על מבנה הביופילם התקבלו על ידי הדמיית SEM.

ראשי החצים הירוקים מצביעים על תאי חיידקים בביופילם, וראשי החץ הצהובים מצביעים על קורים פטרייתיים. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים וחצי עבור דגימה אחת, מבלי לספור את זמן הדגירה של היווצרות הביופילם ותרבית המיקרואורגניזמים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי הצלחת השיטה תלויה מאוד ביכולת להשיג מושבות פטרייתיות דקות מאוד, העשויות מכמה שכבות של קורים בלבד.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מוטגנזה או הכלאה באתר, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו אפיון פונקציונלי או כימי של הביופילם, או לחקור ביופילמים מרובי מינים. לאחר פיתוחה, השיטה הזו סללה את הדרך לחוקרים מתחומים רבים כמו רפואה, מדעי הסביבה, תעשיית המזון וכן הלאה, לחקור היווצרות ביופילם במהלך אינטראקציות חיידקיות פטרייתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגדל ולנתח היווצרות ביופילם חיידקי על קורים פטרייתיים.