הכנה במבחנה אפיון חומרי ניגוד מבוססי dendrimer עבור דימות תהודה מגנטית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להראות את ההכנה והאפיון של כלאט פרמגנטי דנדרימרי שיכול לשמש כחומר ניגוד להדמיית תהודה מגנטית ולהדגים את ביצועיו בניסוי הדמיה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חומרי הניגוד MRI כגון התכונות והיעילות של חומרי ניגוד דנדרימריים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הכנה נוחה של חומר הניגוד היעיל MRI עם חלבון גבוה, ובכך מבטיח את אפיונו הקל.

שיטה זו יכולה להתרחב לקראת שינויים מבניים נוספים ואופטימיזציות פונקציונליות של חומרי ניגוד MRI דנדרימריים אשר רלוונטיים מאוד ליישומי פוטנציאל in vivo. ההשלכות משתרעות על מחקר ביו-רפואי והדמיה אבחנתית שכן הקצב המולקולרי הגבוה של חומרי ניגוד דנדרימריים גורם לזמני שימור רקמות ארוכים יותר ומשפר משמעותית את אות ה-MRI. ראשית, יש להמיס גרם אחד של המבשר המקרוציקלי DO3A tributyl ester בחמישה מיליליטר של DMF.

מוסיפים 0.67 גרם אשלגן פחמתי ומערבבים בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. מוסיפים 0.87 גרם של tert-butyl-2-bromo-4 4-nitrophenyl butatnoate במנות במשך שעה וממשיכים לערבב את תערובת התגובה למשך 18 שעות. לאחר מכן, הסר את ה-DMF עם זיקוק ואקום מנורה לנורה בטמפרטורה של 40 עד 60 מעלות צלזיוס.

טהר את השאריות בעזרת כרומטוגרפיה של עמוד סיליקה ג'ל לקבלת מוצק עגול. ממיסים גרם אחד של המוצק בתערובת של 10 מיליליטר אתנול ו -150 מיקרוליטר של תמיסת אמוניה רגילה שבעה במתנול. הוסף 150 מיליגרם פלדיום על פחם פעיל והגדר את כור הבקבוקים בהידרוגנטור.

מנערים את התערובת למשך 16 שעות באווירת מימן של 2.5 בר. יוצקים תרחיף של אדמה דיאטומית באתנול למשפך זכוכית מסונטר מסננים את תערובת התגובה דרך האדמה הדיאטומית כדי להסיר את זרז הפחמן של הפלדיום. הסר ממס מהפילטר על מאייד סיבובי.

ממיסים את המוצק המתקבל ב -15 מיליליטר דיכלורומתאן וארבע מקבילות טריאתילאמין. לכך מוסיפים 1.3 מקבילות של תיופוסגן ומערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. הסר את הממס מתערובת התגובה על מאייד סיבובי וטהר את השאריות בעזרת כרומטוגרפיה של עמוד סיליקה ג'ל כדי לקבל את המונומר מסוג DOTA כמוצק חום בהיר.

הכן 66.7 מיליגרם של דנדרימר G4 PAMAM מתמיסה של 10% במתנול על ידי אידוי הממס על מאייד סיבובי ב-40 מעלות צלזיוס. ממיסים את הדנדרימר בארבעה מיליליטר DMF. מוסיפים 0.105 מיליליטר טריאתילמין לתמיסת הדנדרימר ומערבבים 45 דקות בחום של 60 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מוסיפים 354 מיליגרם של המונומר במנות במשך שעה. ממשיכים לערבב בחום של 45 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. הסר את הממס עם זיקוק ואקום מנורה לנורה.

ארוז עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל על ידי סיבוב מדיום סינון ג'ל ליפופילי במתנול למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. אסוף שברים של מיליליטר אחד באמצעות מתנול כחומר הניקוי. נתח את השברים לפי TLC.

הסר ממס מהשברים המכילים את הכלאטור הדנדרמרי המוגן על מאייד סיבובי. לרכוש ספקטרום תמ"ג פרוטוני של התרכובת ולשלב את האזורים הארומטיים והאליפטיים. באמצעות ערכים אלה, קבע את מספר המקרו-מחזורים המוגנים מסוג DOTA המחוברים לדנדרמר G4 PAMAM.

כדי לבטל את ההגנה על המוצר, ממיסים את המוצק בחומצה פורמית של חמישה מיליליטר ומערבבים את התערובת בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות. הסר את החומצה הפורמית בעזרת מאייד סיבובי. יש לייבש בהקפאה את השאריות שהוצאו מהמאייד הסיבובי כדי להשיג את הקלאטור הדנדרימרי.

באמצעות תמ"ג פרוטון, קבע את מספר היחידות המקרוציקליות המחוברות לדנדריימר. ממיסים את הכלאטור המיובש בהקפאה במים. השתמש ב-0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי כדי להתאים את ה-pH של התמיסה ל-7.0.

הוסף תמיסה של 113 מיליגרם גדוליניום III כלוריד במיליליטר מים טיפה לתמיסת הקלטור במשך תקופה של ארבע שעות. התאם מעת לעת את ה-pH ל-7.0 עם 0.05 נתרן הידרוקסיד מולארי. מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.

לאחר מכן, הוסף 158 מיליגרם של EDTA במנות במשך תקופה של ארבע שעות ותקן את ה-pH בחזרה ל-7.0 לפי הצורך. מערבבים עוד 24 שעות בטמפרטורת החדר. ארזו עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם מדיום סינון ג'ל הידרופילי נפוח במים.

רכזו את תערובת התגובה, העמיסו את התערובת על העמוד ושטפו במים נטולי יונים. צנטריפוגה את הדגימה המטוהרת ביחידת מסנן צנטריפוגה של שלושה קילודלטון למשך 30 דקות בטמפרטורה של 1,800 פעמים גרם. חזור על הסינון כחמש פעמים כדי להסיר עודפי גדוליניום ו-EDTA.

אשר את היעדר יוני גדוליניום חופשיים בסינון באמצעות בדיקת תפוז קסילנול. הסר חומרים נדיפים מהדגימה המסוננת והקפיא את השאריות כדי להשיג את חומר הניגוד הדנדרימרי. הכן תמיסת מלאי של DCA במים בריכוז שבין חמש ל -10 מילימולר.

כדי לקבוע את ריכוז ה-DCA המדויק, שלבו תחילה 360 מיקרוליטר מתמיסת המלאי עם 60 מיקרוליטר בתקן D2O ו-tert-butanol. הנח 400 מיקרוליטר מהדגימה בצינור NMR חיצוני. הנח צינור הכנסת NMR קואקסיאלי המכיל טרט-בוטנול ותמיסת ייחוס מים לתוך צינור הדגימה.

רכוש ספקטרום NMR של פרוטון ומדוד את שינוי התדר בין אותות הטרט-בוטנול של פתרונות הייחוס והדגימה. חשב את ריכוז ה-DCA באמצעות הנוסחה המוצגת, ותקן את הטרט-בוטנול שנוסף בדגימה. קבע את הריכוז של תמיסת GdDOTA זמינה מסחרית באותו אופן.

הנח תמיסות DCA ו-GdDOTA בבקרות חיץ ומים של HEPES בשתי קבוצות של בקבוקוני פלסטיק. סגור בקבוקונים עם מכסים כדי לוודא שאין בועות אוויר. לתוך מזרק של 60 מיליליטר, טען אופקית את דגימות ה-DCA של 0.01 ו-0.02 מילי-מולאר, אחת מדגימות ה-GdDOTA של 0.5 ו-1.0 מילי-מולרית ושתיים מבקרות המים.

חזור על הליך זה על ידי טעינת סט הדגימות השני למזרק שני של 60 מיליליטר. מלאו כל מזרק בתמיסת GdDOTA מילימולרית אחת וכסו את קצות המזרק. הנח את אחד המזרקים בצורה אופקית בסורק MRI כך שהדגימות יהיו אנכיות ביחס לסורק.

החלק את המזרקים למרכז הסורק. בחר את הסריקה האנטומית כדי למקם את המזרק במרכז המגנט. לאחר מכן לחץ על לחצן הרמזור כדי לבצע התאמות של פרמטרי הסריקה הראשוניים ולהתחיל את הסריקה.

בחר בשיטת הצילום בזווית מהירה/איטית לביצוע הדמיה משוקללת T1 או בשיטת הרכישה המהירה עם שיפור הרפיה לביצוע הדמיה משוקללת T2. השתמש בסריקת הלוקלייזטור כדי לבחור פרוסת עטרה עבור הדגימות המיושרות אנכית. בצע אופטימיזציה של הניגודיות לפרמטרים של רכישת רעש ורכוש את התמונה.

השתמש בהחזר ROI מעגלי כדי לקבוע את משרעת האות הממוצעת וסטיית התקן עבור הרקע ועבור כל דגימה. חשב את יחס האות לרעש. NMR, MALDI-TOF MS וניתוח יסודות הצביעו על כך שממוצע של 49 יחידות מקרוציקליות צומדו לדנדרמר G4 PAMAM.

הריכוזים וזמני ההרפיה האורכיים והרוחביים של תמיסות DCA נקבעו גם הם באמצעות NMR. ערכי ההרפיה שהתקבלו הושוו למונומר GdDOTA זמין מסחרית ונמצא בשימוש קליני. ביצועי ה-DCA הושוו גם למונומר GdDOTA.

לשתי קבוצות של תמיסות היו ריכוזי גדוליניום דומים כפי שנקבעו על ידי מספר היחידות המקרוציקליות המצומדות ולשתי הקבוצות האחרות היו ריכוזים מולקולריים דומים. בניסוי הדמיה משוקלל T1 עם ריכוזי גדוליניום דומים, יחס האות לרעש היה מעט גבוה יותר עבור DCA מאשר עבור GdDOTA. כאשר לתמיסות היו ריכוזים דומים לפי מולקולה, יחס האות לרעש של DCA היה גדול פי שלושה מזה של GdDOTA.

בניסוי הדמיה משוקלל T2, יחס האות לרעש של ה-DCA היה נמוך משמעותית מזה של ה-GdDOTA בשני זוגות הריכוזים, במיוחד בריכוזי DCA גבוהים יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין חומר ניגוד MRI מבוסס דנדרימר מטוהר ומאופיין. בעקבות הליך זה, ניתן להכין סוגים שונים של חומרי ניגוד MRI דנדרימריים וננומטריים על ידי שינוי יחידות המולקולה ולנתח אותם בנוחות.

לאחר שליטה בטכניקה זו, החוקרים בתחום פיתוח חומרי ניגוד MRI אמורים להיות מסוגלים להכין מגוון בדיקות ספציפיות לביצוע מחקרים פונקציונליים שונים בעלי חשיבות קריטית להדמיה מולקולרית עכשווית.