ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש
17 במרץ 2017
עבודה זו מתארת זרימת עבודה מתקדמת לקביעה מדויקת ומהירה של ספירת תאי NK (רוצח טבעי) וציטוטוקסיות של תאי NK בדגימות דם אנושיות.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את ספירת תאי NK ורמות ההפעלה הציטוטוקסית בדגימת דם מלאה אנושית בצורה מהירה, אמינה ויציבה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחומים אימונולוגיים, כגון, מהן ההשפעות של התערבויות חיצוניות על הפעילות הביולוגית של תאי NK? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ומדויקת, תוך שהיא מספקת תוצאות הניתנות לשחזור על פני ניסויים.
כדי לבודד תאי NK מדם מלא אנושי, הנח תחילה צינורות של 15 מיליליטר המסומנים דגימת דם מלאה, שבר שלילי ושבר חיובי במיקומים המתאימים במדף הצינור המפריד בין התאים. כאשר כל הצינורות נטענים, הכנס את מתלה המפריד למיני-דגימה לתיוג אוטומטי, ובחר Reagent בתפריט, כדי להדגיש את המיקום שבו הבקבוקון יונח על המתלה. בחר קרא מגיב כדי להפעיל את קורא הקוד הדו-ממדי והחזק את בקבוקון המגיב המתאים מול קורא הקוד הדו-ממדי בזווית של 0.5 עד 2.5 סנטימטרים ממכסה קורא הקוד.
הנח את בקבוקון הקריאה למצב מתלה המפריד המתאים. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה הפרדה, סמן את המיקומים הרצויים. לאחר מכן פתח את תפריט המשנה תיוג ובחר תוכנית תיוג אוטומטית.
הקצה את מיקרו-חרוזי המגיב להפרדת התאים למיקומי מתלה 1, 2, 3 ו-4. ובחר בתוכנית ההפרדה של Posselwb. בחר את תוכנית Rinse Wash.
הזן 1500 מיקרוליטר עבור נפח לדוגמה תחת תפריט המשנה נפח והקש Enter. לאחר מכן לחץ על הפעל כדי להתחיל בהפרדת התאים. לחיצה על אישור כדי לאשר שיש מספיק מאגר זמין לעיבוד כל הדגימות.
כדי להכין דגימת בדיקת ציטוטוקסיות, ראשית, סמן צינורות של 1.5 מיליליטר עבור כל דגימה ו/או משתתף לפי הצורך, וצנר את היחס הרצוי של תאי NK ותאי K562 המסומנים ב-DIO לכל צינור. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. לאחר מכן, השעו מחדש את תערובת התאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום תאי NK לא שלם, ותייגו את התאים בכל צינור ב-5 מיקרוליטר של פרופידיום יודיד.
אוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה נוספת, ומדגרים את תרבית החיסול ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. בתום הדגירה, צנטריפוגה את התאים באותם תנאי צנטריפוגה, והשעיה מחדש של הגלולה ב-25 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי NK טרי ולא שלם. כדי לנתח את התאים על ידי Flow Cytometry, ראשית, לחץ על כפתור ההפעלה בתוכנת ציטומטר זרימת ההדמיה כדי לשטוף את המערכת.
לאחר מכן, לחץ על כפתור Scatterplot כדי ליצור ארבע עלילות פיזור, וטען את צינור הבקרה החיובי הכפול. באמצעות דגימת הבקרה החיובית הכפולה, קבע את העוצמה הרצויה עבור לייזר 405 מילי-וואט, כך שהגלאי לא יהיה עמוס יתר על המידה, והגדר את המצלמת לרכוש את המספר המתאים של ספירת תאים. הגדרת לייזר 405 מיליוואט בעוצמה המתאימה לזיהוי של DIO ו-PI כאחד תדרוש ניסיון הן בצבעים והן בטווח הזיהוי של ציטומטר הזרימה.
לאחר רכישת דגימת הבקרה החיובית הכפולה, טען את דגימת הבקרה של DIO בלבד, בחר את המטרה 40X וכבה את הלייזר של 642 מילי-וואט ואת ערוץ Brightfield. גדל את מספר התאים המתאים וחזור על הרכישה עבור דגימת הפרופידיום יודיד בלבד. לאחר הפעלת כל דגימות הבקרה, הפעל שוב את הלייזר של 405 מילי-וואט ואת ערוץ Brightfield, ולחץ על הגדר עוצמה.
לאחר מכן, תחת הכרטיסייה File Acquisition, הזן שם קובץ מותאם אישית ובחר תיקייה לשמירת קובצי הנתונים. לאחר מכן, הזן את מספר התאים שיש לרכוש. טען את צינור הדגימה הניסיוני הראשון ולחץ על כפתור הרכישה.
לאחר הפעלת כל הדגימות פתח את יישום התוכנה לניתוח ציטומטר זרימת הדמיה, ופתח קובץ RIF ניסיוני יחיד. תחת לשונית הפיצוי, בחר צור מטריצה חדשה. התוכנה תבקש לבחור את קבצי הצבע הבודד, ותמזג אותם ליצירת קובץ מטריצה שייבחר להחלת פיצוי הערוץ.
השתמש בפונקציה אבני בניין כדי להגדיר את תרשימי הנקודות המתאימים. לאחר מכן לחץ על פונקציית הסטטיסטיקה כדי לגשת למספרי התאים בכל שער. בניסוי מייצג זה, נלקחו דגימות דם כפי שצוין ונמדד ריכוז תאי NK למיליליטר דם מלא עבור כל רץ, ובממוצע עבור כל נקודת זמן.
שלושה מתוך ארבעה רצים הציגו עלייה קלה דומה בספירת תאי NK לאחר פעילות גופנית. מיד לאחר מכן ירידה חדה, לפני שחזרה לאט לאט לשגרה, 24 עד 48 שעות לאחר סיום האירוע. בממוצע, ספירת תאי ה-NK ירדה 1.5 שעות לאחר האימון, אך חזרה לרמות כמעט נורמליות לאחר 24 שעות.
לאחר חישוב ספירת התאים, הפעילות הציטוטוקסית של תאי ה-NK נותחה מיד כפי שהודגם זה עתה, עם ירידה ממוצעת בציטוטוקסיות של תאי NK באופן מיידי, ו-1.5 שעות לאחר סיום אירוע האימון, שגדלה באופן משמעותי ב-24 שעות לאחר האימון. הציטוטוקסיות של NK נותרה גבוהה בהשוואה לרמות שלפני האימון, אם כי באופן לא משמעותי. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כארבע שעות כאשר היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג ולאפיין את ספירת תאי NK ופעילות ציטוטוקסית מדגימות דם אנושיות בצורה הידרופית הניתנת לשחזור.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
עבודה זו מתארת זרימת עבודה מתקדמת לקביעה מדויקת ומהירה של מספר תאי NK (Natural Killer) ושל ציטוטוקסיות של תאי NK בדגימות דם אנושיות. השיטה שואפת לספק תוצאות מהימנות שיכולות להעמיק את ההבנה במחקר אימונולוגי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מחקר קליני
רקע
- תאי NK ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- הבנת פעילות תאי NK יכולה להכווין התערבויות טיפוליות.
- ייתכן ששיטות נוכחיות חסרות מהירות ודיוק.
- מחקר זה מציג גישה חדשנית לטיפול במגבלות אלו.
מטרת המחקר
- לקביעת מספר תאי NK בדגימות דם אנושיות.
- להערכת רמות האקטיבציה הציטוטוקסית של תאי NK.
- פיתוח שיטה מהירה ואמינה למחקר אימונולוגי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של תאי NK מדגימות דם מלא.
- שימוש במפריד תאים לעיבוד הדגימות.
- סימון אוטומטי של הדגימות לצורך דיוק.
- הפעלה של קורא קוד דו-ממדי לזיהוי ריאגנטים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מספקת תוצאות הניתנות לשחזור בין ניסויים שונים.
- קביעה מהירה של מספר תאי NK והציטוטוקסיות שלהם.
- נתונים מהימנים שיכולים לתמוך במחקרים אימונולוגיים נוספים.
- פוטנציאל למענה על שאלות הנוגעות לפעילות ביולוגית של תאי NK.
מסקנות
- תהליך עבודה זה משפר את חקר תאי NK בדגימות אנושיות.
- הוא מציע איזון בין מהירות, דיוק והדירות.
- השיטה יכולה לסייע במחקר על התערבויות בתאי NK.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה מדויקת וניתנת לשחזור של ציטוטוקסיות תאי NK (natural killer) היא קריטית להערכת התערבויות אימונומודולטוריות בפיתוח פרה-קליני וקליני. תהליך עבודה זה מאפשר כימות מהיר ויציב של מספר תאי NK ושל פעילות ליטית מנפחים מינימליים של דם שלם אנושי, ובכך תומך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בקווי פיתוח של אימונותרפיה. על ידי הפחתת השונות במבחן והטעויות התלויות במשתמש, השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בסביבות של גילוי מוקדם ומחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בנוגע לפעילות הביולוגית של תאי NK בעקבות התערבות פרמקולוגית או ביולוגית.
- ערך תפעולי: מספק כימות הדיר ותוצאות ציטוטוקסיות של תאי NK הניתנות לשחזור מכמות קטנה של עד 1 mL של דם אנושי מלא, ובכך מפחית את דרישות הדגימה.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי קישור פעילות תאי אפקטור לתוצאות ציטוטוקסיות מדידות במערכת רלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות המבוססות על ציטומטריית זרימה עם דימוי (imaging flow-cytometry), המבדילות בין אירועי ציטוטוקסיות אמיתיים לבין תוצאות חיוביות שגויות, כגון דובלטים (doublets) או ששאירי תאים (debris).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של יחס התא המבצע לתא המטרה (E:T) ב-1:5 תוך שימוש בתאי מטרה K562 המסומנים ב-DiO, מה שמאפשר הדירות של הבדיקה לאורך נקודות זמן ותנאי ניסוי שונים.
- ערך הפלטפורמה: תואם לפלטפורמות של ציטומטריית זרימה עם דימוי, מה שמאפשר ויזואליזציה של כל אירוע ומניעת תוצאות שליליות שגויות, ובכך תומך בתהליכי סריקה הניתנים להרחבה (scalable screening workflows).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר ניטור ארוך טווח של פעילות תאי NK בבני אדם, ובכך מאפשר מתאם בין שינויים ציטוטוקסיים לבין נקודות סיום פרימקו-דינמיות או קליניות.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקה של התערבויות ניסיוניות מרובות לאורך נקודות זמן שונות מבלי לפגוע בשלמות הנתונים, ובכך תומך בתכנוני מחקר אדפטיביים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מנגנוניות משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת נתונים פונקציונליים של תאי NK הרלוונטיים לבני אדם.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור סוכנים אימונו-מודולטוריים שבהם מעורבות של תאי NK היא מנגנון הפעולה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מדידת הפעלה ציטוטוקסית של תאי NK כמדד תפקודי של מודיולציה חיסונית.
- סריקה: מספק תאי NK מופרדים ומוכנים לבדיקה, עם סימון סטנדרטי ובקרי פיצוי, המבטיחים הדירות בסריקה של תרכובות או חומרים ביולוגיים.
- אנליטיקה: מאפשר מדידות כמותיות של משתנים תלויים (מספר תאי NK ל-mL, % הפעלה ציטוטוקסית) המשמשות לניתוח סטטיסטי ולהשוואות בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין בדיקות ציטוטוקסיות in vitro לתגובות של דם אנושי ex vivo, ובכך משפר את הערך הניבוי למעבר לקליניקה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להערכה תפקודית של תאי NK לאורך פרויקטים שונים, ובכך מפחית את הצורך בפיתוח מחדש של השיטה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי במנגנונים המתווכים על ידי תאי NK, ובכך מפחית הובלה למסלולים שגויים בפיתוח אימונותרפיה.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות מהירות ויציבות (~4 שעות) עם מינימום זמן עבודה ידנית, ובכך משפר את תפוקת המעבדה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים אימונו-דינמיים מהימנים בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מועמדים מותאם סיכון, בהתבסס על מודולציה הדירה של פעילות תאי NK.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהפרדת תאים, קיזוז (compensation) בציטומטריה של זרימה ואנליזה מבוססת דימות.
- תלוי בגישה למפריד תאים עם סימון אוטומטי ולציטומטר זרימה עם יכולות דימות, זיהוי בלייזר ופלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה של נפחי ריאגנטים, זמני אינקובציה ואסטרטגיות gating בין משתמשים ואתרים שונים.
- התאמה למערכות מודל חלופיות עשויה לדרוש תיקוף של סממני תאי NK ותאימות של תאי המטרה.
- מגבלות מעשיות כוללות את רגישותם של תאי NK לעיכובים בטיפול ואת הצורך בדגימות דם טריות לשמירה על חיוניות ותפקוד.
