ניצול טכנולוגיית הדפסה 3D כדי מיזוג MRI עם היסטולוגיה: פרוטוקול המוח חתך

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבצע התאמה מדויקת בין נפחי דמויי MRI לבין חתכי היסטולוגיה, באמצעות יצירה של מחזיקי מוח ותיבות חיתוך מותאמות אישית בהדפסת תלת-ממד. למרות שסרטון זה מתמקד ברקמת מוח שהוצאה מקוף מרמוזט, ניתן להחיל פרוטוקול זה על כל מוח, בין אם הוא מקורו במכרסם, בפרימט שאינו אדם או בבן אדם. הכינו עמדת עבודה כפי שמתואר בפרוטוקול.

מלאו את המבחנה ב-Fomblin ובגזה עד לסימון של 20 milliliter. דחסו את הגזה כדי להסיר בועות אוויר במהלך המילוי. ייבשו בעדינות את המוח מפורמלין.

לאחר מכן, הכניסו את המוח כאשר החלק הקדמי פונה לתחתית המבחנה. קבעו בזהירות את המוח בתוך המבחנה באמצעות גזה מסביב לדפנות המוח כדי לקבע את מיקומו. מלאו את שאר המבחנה בגזה וב-Fomblin.

הסר בזהירות בועות אוויר לאורך התהליך. לאחר מכן, הדק את הפקק ואטום את המבחנה בפרפין. סמן את הפקק ואת הקו בסימון של החריץ הבין-המισפרה (inter hemisphere fissure).

לאחר מכן, עטפו את המבחנה בנייר סופג והכניסו אותה לסליל כאשר הסימון נמצא במיקום המרכזי העליון. הכניסו את הסליל לסורק ה-MRI. לאחר הרכישה ועיבוד הנתונים, נקבל תמונת T2-weighted שבה נוכל להשתמש כדי ליצור מודל דיגיטלי של המוח.

פתחו את ה-MRI במישור הקורונלי. לאחר מכן, השתמשו בכלי הטרנספורמציה כדי לבצע דגימה מחדש (resample) של התמונה לווקסלים איזוטרופיים של 1 millimeter. לבסוף, החילו מסנן להפחתת רעשים לא ליניארי.

בחר ב-displays look up table. לאחר מכן לחץ על כפתור ה-dual Threshold. גרור את הסמן על הגרף כך שיכסה את המוח כולו.

צרו מסכת מוח בינארית באמצעות אלגוריתם הסגמנטציה Threshold using min/max. הזינו בתיבת ה-Lower limit את הערך המופיע בפינה השמאלית התחתונה של גרף העוצמה, ממש מתחת לסקאלה. לאחר מכן, בחרו ב-Binary ובטלו את הסימון של Inverse threshold.

בחר באלגוריתם המורפולוגי, Fill holes. סמן את Process in 2.5D. כדי למלא את הרווח שבין המוח האחורי לקורטקס, בחר ב-line VOI.

סמנו קו חיבור בין המוח האחורי לקורטקס בשני צדי המוח בנקודה הלטרלית ביותר. המשיכו לסמן חיבורי VOI לאורך המוח. המירו את ה-VOIs למסכת בינארית.

השתמש במחשבון התמונות (Image calculator) כדי לשלב את המסכות הבינאריות של ה-VOI והמוח על ידי בחירה בפעולת OR. בחר באפשרות Promote destination image type. כעת בחר באלגוריתם המורפולוגי Fill holes.

סמנו את Process ב-2.5D. בחרו באלגוריתם Extract surface, בחרו ב-Mask image, הזינו שם ולאחר מכן בחרו בסוג הקובץ ply. ניתן למקם את המרווחים בתיבת החיתוך התואמים למיקום מישור הפרוסה החל מקדמת המוח, מאחורי המוח או ביחס לאזור עניין, כגון הנגעים בחומר הלבן הנראים כאן.

באמצעות VOI של תיבה, שרטטו תיבה סביב המוח. העתיקו והדביקו את התיבה על מספר פרוסות ה-MRI התואם לעובי מרווחי הפלטה המתוכננים. לאחר מכן, דלגו קדימה לפי מספר פרוסות ה-MRI לכל מקטע והניחו את התיבה כפי שנעשה קודם לכן כדי ליצור מרווח להב נוסף.

חזור על תהליך זה לאורך המוח. הפוך את ה-VOIs של התיבה למסכה בינארית (Binary mask). לאחר מכן, הוצא את המשטח באמצעות Extract surface כפי שבוצע קודם לכן עבור המוח.

בחר את המסכה הבינארית (Binary mask) של מרווח הלהב. השתמש ב-Image math כדי להכפיל אותה ב-10,000. לאחר מכן, השתמש ב-Image calculator כדי להוסיף את המסכה הבינארית המוכפלת ל-MRI האיזוטרופי שעבר דגימה מחדש (resampled isotropic MRI).

כעת, על ידי בחירה בתצוגה הטרי-פלנרית (triplanar view), ניתן לראות מפת להבים של ה-MRI המראה את המיקום שבו המוח ייחתך בשלוש תצוגות אורתוגונליות. ב-Netfabb Professional, בחרו ב-Add part. לאחר מכן בחרו בדגמי ה-Blade Gap וה-Brain Model plys.

בחר את מודל המוח ולחץ על מצב תיקון (repair mode). השתמש בכפתור בחירת המעטפת (shell selection) כדי לבחור את המוח. לאחר מכן, העבר את הבחירה למעטפות האחרות ומחק אותן.

לאחר מכן החילו את התיקון והסירו את החלק הישן. כאשר המוח נבחר, בחרו ב-Move. לחצו על to origin ורשמו את הפרמטרים בתיבות X, Y ו-Z.

אלו נחוצים כדי לשמור על מיקום מרווח הלהבים. לחץ על תרגום. וסגור את החלון.

בחרו את מודל Blade Gap ובצעו לו טרנסלציה באמצעות הפרמטרים שנרשמו בשלב הקודם. בחרו את מודל המוח ולחצו על מצב תיקון (repair mode). השתמשו בכפתור בחירת המעטפת (shell selection) כדי לבחור את המוח.

לאחר מכן בחרו ב-Smooth triangles. הזינו ארבעה במספר ה-Iterations. וסמנו את Prevent volume shrinking.

בחר ב-Reduce Triangles והזן 200000 בתיבת ה-Target Triangle Count. לאחר מכן בחר ב-Automatic repair ובצע תיקון ברירת מחדל. החל את התיקון.

לאחר מכן, ייצאו את מודל המוח המוחלק כקובץ STL. ייבאו את מודל המוח המוחלק ל-Meshmixer. השתמשו בכלי הפיסול (sculpting tools) כדי להחליק את האזורים שסומנו באמצעות ה-VOIs של הקווים.

תקנו פגמים מינוריים אחרים במודל. ייבאו את מודל המוח הערוך והמחליק ל-Netfabb Professional. לאחר מכן הוסיפו את החלק, brain slicer parts marmoset.

בחר ב-Shells להפיכה לחלקים (parts). לאחר מכן, שנה את השם של כל חלק כפי שמתואר בפרוטוקול. באמצעות הגדרות הבחירה המתוארות בפרוטוקול, לחץ וגרור את החלקים כדי למקם את המוח במרכז התיבה.

לחצו וגררו את החלקים כדי להתאים את עומק המוח בתיבה. בחרו את מודל המוח המוחלק והערוך, את מודל החיתוך בתיבה ובחרו בפעולת boolean. לחצו על מודל המוח כדי להפוך אותו לאדום.

בחרו בהפחתה בוליאנית (boolean subtraction). בצעו את החישובים. סמנו את הבליטות שעלולות למנוע את מיקומו התקין של המוח.

עיינו בסעיף הנלווה של הפרוטוקול לקבלת שיטה להסרתם. בחרו את דגם מרווח הלהב ולחצו על move. רשמו את התוצאה במיקום Z.

זה יהיה המיקום של מרווח הלהב האחורי ביותר. לאחר מכן סגור את החלון. בחר את חלק הלהב מרשימת חלקי פורס המוח ולחץ על Move.

הזינו את ערך ה-Z מהשלב הקודם. והזינו את ערכי המיקום הנוכחיים X ו-Y. בחרו ב-Translation מוחלט (absolute) ובצעו את ההזזה.

לחצו על Duplicate. אם עובי הנתח עקבי, כפי שמוצג כאן, הזינו את מספר הלהב הכולל, את הספירה הכוללת ואת ה-Z count, והזינו את עובי הנתח בתיבת ה-Z gap. לאחר מכן בחרו ב-duplicate.

בחרו את חלק להב המיקרוטום מתוך חלקי פורס המוח. חזרו על אותם שלבי הזזה ושכפול שבוצעו עם חלק הלהב. בחרו את כל להבי המיקרוטום ואת מחזיק הלהב הראשי ולחצו על פעולת בוליאנית (boolean operation).

בחר את כל להבי המיקרוטום (Microtome Blades) כדי לצבוע אותם באדום ולחץ על חיסור בוליאני (boolean subtraction). לאחר מכן, החל את החישובים. היכנס למצב תיקון ובחר בתיקון אוטומטי.

בצע תיקון מורחב (Extended Repair) והחל את התיקון. ייצא את מחזיק הלהבים כקובץ STL. בחר את כל הלהבים, את התיבות הראשית והמשנית, ואת מודל המוח הערוך והמחליק, ולחץ על פעולת בוליאנית (boolean operation).

השתמשו בחלון בחירת החלקים (Parts selection) כדי לצבוע את כל החלקים, למעט התיבה הראשית, באדום. לאחר מכן בחרו בהפחתה בוליאנית (boolean subtraction). החילו את החישובים.

היכנסו למצב תיקון (repair mode) וסמנו את התיבה עבור קצוות חדים שעלולים לפגוע במוח. ניתן לתקן אותם במצב התיקון של Netfabb, או באמצעות כלי הפיסול ב-Meshmixer.

לאחר מכן בחרו בתיקון אוטומטי (Automatic repair). בצעו תיקון מורחב (Extended Repair). לאחר מכן החילו את התיקון.

ייצאו את תיבת המוח כקובץ STL. בתוכנת Cura, בחרו ב-Load וייבאו את תיבת המוח. לחצו על כפתור ה-Rotate.

לאחר מכן, לחצו וגררו כדי להניח את התיבה בצורה שטוחה. עריכו את הגדרות ההדפסה כפי שמופיע בפרוטוקול, ולאחר מכן שמרו את נתיב הכלי (toolpath).

בצע את אותו התהליך עבור מחזיק הלהב ושכפל גם את האובייקט הזה. לאחר מכן, שמור את נתיב הכלי (toolpath). לאחר מריחת שכבה דקה של דבק על משטח ההדפסה, הדפס את קופסת המוח ואת מחזיקי הלהבים במדפסת התלת-ממד בהתאם להגדרות המתוארות בפרוטוקול.

לאחר השלמת ההדפסות, ניתן להכין את המוח לחיתוך. הגדירו תחנת עבודה כפי שמתואר בפרוטוקול. מקמו את המוח בזהירות בתוך הקופסה וודאו שהוא מקובע היטב במקומו.

מקמו את להבי המיקרוטום בתוסי הלהבים בחריצים המתאימים בקופסה. בעזרת כפפות מגן, לחצו בחוזקה על תוסי הלהבים. הפעילו לחץ איטי ומאוזן כדי לחתוך את המוח.

הסר את הפרוסות אחת אחת, החל מחלקו הקדמי של המוח. למרות שגישה זו היא פשוטה, השיטה דורשת שלבים רבים וכן שימוש במספר סוגי תוכנות, ולכן על החוקרים להכיר את ממשקי המשתמש לפני תחילת הפרוצדורה. תזרים עבודה זה מסכם את הפרוטוקול להכנת קופסת חיתוך עבור מוח של Marmoset.

המוח מקובע בפורמלין ונרכשת תמונת MRI בשקלול T2 ברזולוציה של 150 micron. התמונות מעובדות ועוברות סף (thresholding) כדי ליצור מסכה בינארית. לאחר מכן, פני השטח מרונדרים בתוכנה למידול בתלת-ממד.

חיסור בוליאני בין תבנית פריסה למודל המוח יוצר את המודל הדיגיטלי של פורס המוח. לאחר מכן, קופסת פורס המוח מודפסת במדפסת תלת-ממד. לבסוף, המוח מונח בחוזקה בתוך קופסת הפורס לצורך החיתוך.

לאחר חיתוך המוח, השוואה ויזואלית בין תמונות ה-MRI שבוצעו In Vivo לבין אלה שבוצעו לאחר המוות (post-mortem), יחד עם תמונות של המשטחים השטחיים של הפרוסות, חושפת התאמה טובה במיקום ובאוריינטציה לאורך מספר פרוסות. השוואה מעמיקה יותר בין ה-MRI ברזולוציה גבוהה לאחר המוות לבין נתחים היסטולוגיים שנצבעו ב-LFB CV ממספר פרוסות מוח, מדגימה התאמה מדויקת ועקבית בכל מבני המוח של המרמוזט. במודל חיה זה של טרשת נפוצה, החיות מפתחות נגעי חומר לבן הפרוסים ברחבי המוח.

באמצעות טכניקה זו, ניתן לעקוב אחר נגעים קטנים שהתגלו ב-MRI In Vivo הן ב-MRI לאחר המוות (post-mortem) והן בחתכים היסטולוגיים. ההיסטולוגיה וה-MRI לאחר המוות עשויים לחשוף נגעים שפיספסו ב-MRI In Vivo. במקרה זה, ה-MRI In Vivo לא הראה ראיות משכנעות לאות היפר-אינטנסיבי נורמלי שיצביע על נגעים באחד ממסלולי הראייה (optic tracts).

עם זאת, ב-MRI לאחר המוות, נצפו היפר-אינטנסיביות של אות במסלול הראייה. אזורים אלו תאמו באופן ישיר את הנגעים המיליניים שנראו בחתך ההיסטולוגי של LFB CV. לסיכום, המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת לחוקרים להעריך במדויק את הפתולוגיה העומדת בבסיס ממצאי ה-MRI.

אנו סבורים כי זוהי גישה מבטיחה לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים למחלות המערבות את המוח ולתהליכים פתולוגיים ספציפיים כגון דלקת ודמילינציה.