איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

המטרה הכוללת של מתודולוגיית בדיקת PCR בזמן אמת היא לזהות פתוגנים מבוססי DNA ו-RNA יחד בצורה בעלת תפוקה גבוהה. חומצת גרעין מדגימות קליניות תוגבר מראש עם מאגר פריימר משותף שנטען על צלחת OpenArray וינותח לנוכחות פתוגנים. שיטה זו יכולה לעזור לקדם את מאמצי המעקב של OneHealth למחלות זיהומיות.

בהשוואה לטכניקות מסורתיות, שיטה זו מאפשרת לבדוק יותר דגימות עבור יותר מטרות מבלי להתחרות זו בזו, ובכך לשפר את יעילות הבדיקה. השיטה משתמשת בצלחת PCR בקנה מידה ננומטרי מותאם אישית. הפריימרים והבדיקות מודפסים בשולי החורים והדגימות נטענות באמצעות מטפל בנוזלים.

נדגים את השיטה על דגימות קליניות הנבדקות עבור פאנל של פתוגנים נשימתיים של סוסים וכלבים. כדי להתחיל בהליך זה, עצב את הלוח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הלוח המשמש כאן מוגדר עם 18 מטרות בשלוש עותקים.

הוסף מדיה לספוגיות ולשטיפות קנה הנשימה כך שיהיה לפחות מיליליטר אחד עד שניים של נוזלים. מערבול את הספוגית ו-DMEM במרץ בצינור. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להעביר כ-1 מיליליטר של מדיה לצינור חדש.

הוסף 235 מיקרו ליטר של מאגר ליזה ו-175 מיקרו ליטר דגימה לכל צינור חרוזים. המשך עם פרוטוקול היצרן כדי לחלץ את חומצת הגרעין הכוללת. התכוננו לשעתוק הפוך והגברה מוקדמת של חומצת גרעין או קדם מגבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט על ידי אימות תחילה של מפת הדגימה.

הוסף 8.5 מיקרו ליטר של תערובת מאסטר preamp ו-5.5 מיקרו ליטר של דגימת DNA/RNA לכל באר של צלחת סטנדרטית של 96 בארות באמצעות הצד השמאלי של הצלחת בלבד. לאחר שילוב הדגימות, בקרות חיוביות ובקרות שליליות עם תערובת קדם מגבר, אטום היטב את צלחת 96 הבארות הסטנדרטית עם אטם דבק שקוף. הסר את כל האטמים העודפים באמצעות סכין גילוח כדי למנוע היווצרות רווחי איטום במהלך הרכיבה.

צנטריפוגה את הצלחת האטומה למשך 20 שניות באמצעות ספינר צלחת PCR. בדוק כדי לוודא שכל הריאגנטים משולבים בתחתית בארות הצלחת. לאחר הפעלת תרמו-סייקלר קונבנציונאלי, בחר את קדם amp תוכנית רכיבה והתחל את התוכנית.

הנח את צלחת 96 הבארות בתרמו-סייקלר רק כאשר החלק התחתון של התרמו-סייקלר מגיע לטמפרטורה הנדרשת לייצור cDNA על ידי ניטור קריאת הטמפרטורה על המסך. לאחר השלמת הקדם-amp ריצה, ודא שהצלחת נותרה אטומה. לאחר לבישת כפפות כפולות וכיסויי שרוולים, הסר את החותם מהקדם ampצלחת.

לאחר מכן, הסר בזהירות והשליך את הכפפות החיצוניות. לדלל את מוצרי הקדם-מגבר אחד עד חמש על ידי הוספת 56 מיקרו ליטר של מאגר TE לכל באר עמודות אחת עד שש של צלחת הקדם-מגבר של 96 בארות וערבוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לשם כך, גשו רק לתחנה הראשונה של הפיפטה, שאפו מלמטה והוציאו גבוה יותר אך אל תיצרו בועות.

הוסף מאגר TE לכל שש העמודות ללא קשר לבארות שאינן בשימוש. התכוננו להעברת 384 בארות ללוחית ההגברה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עם השלמת שלבי ההכנה, לבשו כפפות כפולות וכיסויי שרוולים חדשים ומותאמים היטב.

בשל שיעורי אידוי גבוהים תוך כדי פיפטינג בנפחים נמוכים, קריטי לחלק תערובת מאסטר ולדגום ביעילות ולאטום את הצלחת באופן מיידי. הוסף 2.5 מיקרו ליטר של תערובת מאסטר הגברה לצלחת של 384 בארות. צלחות לבנות משמשות כאן למטרות הדגמה אך יש להשתמש בלוחות שחורים כדי להפחית את עומס העיניים.

העבירו 2.5 מיקרו ליטר של מוצר הקדם מגבר המדולל לצלחת 384 הבארות בהתאם למפה בפרוטוקול הטקסט. הקוביות הצבעוניות המוצגות כאן, ממחישות את רצף ההעברה של פיפטת תעלה קבועה. מכסים מיד את הצלחת בחוזקה עם חותם נייר כסף.

השלך את הכפפות החיצוניות וכיסויי השרוולים. צנטריפוגה את צלחת 384 הבארות למשך 20 שניות בספינר צלחת ה-PCR. אל תסיר את אטם נייר הכסף, אלא הנח את צלחת 384 הבארות במטפל בנוזלים.

פתח את האריזה המכילה לוחית הגברה עטופה והנח אותה בזהירות במטפל בנוזלים בחריץ הראשון עם המספר הסידורי בצד ימין, החזק את המארז בקצוות מבלי לגעת במשטח הצלחת. הסר את אטם נייר הכסף מצלחת 384 הבארות בתוך המטפל בנוזלים ברגע שהכל במקומו. לחץ על הבא ולאחר מכן סמן את כל התיבות עם השלמת כל שלב.

סגור את הדלת למטפל בנוזלים והתחל מיד בתהליך המילוי. הישאר ליד המטפל בנוזלים והמשך מיד לשלב הבא לאחר מילוי הצלחת. בזמן שהמטפל בנוזלים פועל, הסר את סרט המגן מתחתית מכסה המארז.

השאר את הסרט העליון במקומו. יש להניח את הבירוקרטיה על ידי משיכה קלה כדי לשחרר אותה מהדבק. הסר את ה-ampלוחית הטעינה מהמטפל בנוזלים והנח אותה בעדינות במכבש הצלחת עם המספר הסידורי בצד ימין.

הניחו את המכסה על גבי הצלחת עם הקצה המחורץ בצד ימין והדבק בתחתית. משוך כלפי מטה את ידית לחיצת הצלחת וסגור אותה בזהירות, הנורית תהבהב למשך 20 שניות. אל תיגע במכבש הצלחת במהלך תקופה זו.

לאחר שהאור הופך לירוק קבוע, הרם את הידית והסר בזהירות את הצלחת האטומה על ידי החזקתה בקצוות. תוך כדי החזקת האטום ampלוחית אנכית בשולי המארז, הכנס מיד את קצה המזרק ליציאת הטעינה בקצה המארז, ולאחר מכן הוציא את נוזל הטבילה לאט בתנועה רציפה עדינה אחת כדי למלא את החלל בין הצלחת למכסה. השאירו בועת אוויר קטנה אחת בפינה לאחר שהצלחת טובלת.

תוך כדי המשך להחזיק את הצלחת אנכית בקצוות, אטום את יציאת הטעינה על ידי הכנסת התקע ליציאה וסיבוב התקע בכיוון השעון, הפעל לחץ מספיק עד שהידית מתנתקת. נקה את המארז עם מגבון נטול מוך שרוסס היטב באתנול. כדי לייבש את התיק, נגב את המארז כלפי מטה בעזרת מגבון נקי.

הביאו את הצלחת האטומה למכונת ההגברה. תחת לשונית המכשיר, בחר קונסולת מכשירים. בחר את מכונת ההגברה ולאחר מכן לחץ על כפתור הדלת הפתוחה.

הנח את ה-ampלוחית בחריץ הראשון של מתאם הצלחת, ובדוק שהמתאם מיושר כהלכה עם אחד בפינה השמאלית העליונה. כוון את הצלחת כשהברקוד פונה כלפי מעלה ולכיוון קדמת המכשיר. לאחר לחיצה על כפתור סגירת הדלת, נווט ללשונית הבית בתחתית המסך.

בתפריט ההפעלה, בחר OpenArray. לחץ על קבל מזהי לוחיות. כדי להתחיל בהפעלה, לחץ על התחל הפעלה.

פתח גיליון אלקטרוני המכיל את המאקרו של התוצאות. בקובץ הנתונים המיוצא, לחץ לחיצה ימנית על הכרטיסייה בתחתית המסך ובחר העבר או העתק. בשדה להזמין, בחר מאקרו תוצאות.

לאחר מכן לחץ על העבר לסוף וסמן את התיבה שכותרתה צור עותק. לבסוף, לחץ על אישור. מחק את כרטיסיית הייצוא הישנה ולאחר מכן שנה את שם הכרטיסיה החדשה שנוספה לייצוא.

לחץ על תצוגה ולאחר מכן על פקודות מאקרו, בחר מאקרו ולאחר מכן לחץ על הפעל. לאחר מכן, חזור על פעולה זו עבור מאקרו2 על-ידי לחיצה על תצוגה ולאחר מכן פקודות מאקרו, בחירה במאקרו2 ולחיצה על הפעל. בתוכנת מכונת ההגברה, בדוק את העקומות עבור כל דגימה ושלוט מול טבלת המאקרו על ידי בחירת עלילת ניתוח/הגברה בצד שמאל של המסך.

לאחר מכן, בחר בכרטיסיית הדגימה ולחץ על כל דגימה כדי לאשר שיש שתיים או שלוש עקומות הגברה חיוביות עבור כל אחת מהתוצאות החיוביות בטבלה. קריאות הקרינה משורטטות כנגד מחזורי הגברה כדי להמחיש ש-PCR בזמן אמת בוצע בהצלחה. רוב הדגימות הגיעו לרמות סף יחסיות בין המחזורים השני ל-25 של תגובת ה-PCR בזמן אמת.

עקומות סטנדרטיות הפועלות בשלושה ימים שונים משורטטות כדי להדגים את הליניאריות וטווח ההגברה באמצעות בקרות חיוביות. ערכי סף המחזור משורטטים כנגד בסיס יומן 10 של מספר העותקים של תקן חומצת גרעין. שתי פקודות המאקרו ימלאו את שמות המדגם בעמודה הראשונה ואת הממוצע של שלושת ערכי ה-Ct עבור כל יעד עבור אלה עם תוצאות חיוביות.

יעדים שלא הוגברו מופיעים ריקים בטבלה זו. מוצגות תוצאות כמותיות עבור 10 דגימות קליניות וארבע בקרות שגרתיות, כפי שקורה כאן, בקרת ההגברה השלילית צריכה להיות שלילית עבור כל המטרות ובקרת המיצוי השלילית צריכה להכיל רק את הבקרה הפנימית. דגימה אחת בקבוצה זו מציגה בקרה פנימית כושלת, מה שמעיד על נוכחות של מעכבים בדגימה.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסוי PCR בקנה מידה ננומטרי. הליך זה יקל על הפעלת פאנלים מבוססי תסמונת באבחון וטרינרי. ניתן להתאים שיטה זו כך שתכלול מאמרים לגורמים סיבתיים למחלות זיהומיות רבות ושונות.