Name: איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למד שיטת PCR בננו-קנה מידה לזיהוי פתוגנים נשימתיים בכלבים וסוסים בבת אחת. שיטה זו משפרת את יעילות הבדיקה ותומכת במאמצי מעקב OneHealth למחלות זיהומיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה על מבחני הפתוגן הנשימה המתואר כאן נתמכה על ידי קרנות פיתוח פנימי מרכז אבחון לבריאות בעלי חיים קורנל. פיתוח הננומטרי עבודה PCR ומערכות אבטחת איכות הקשורים מומנה בחלקה (פואה PA-13-244) ו שנעשתה בשיתוף לחקירת מעבדה וטרינרית של מינהל המזון והתרופות ותגובה רשת (-LIRN Vet FDA) תחת גרנט מס &#39;1U18FD005144- 01. דמי הפרסום היו בחסות VWR ו Quanta Biosciences. אנו מודים גבריאל ניקרסון, רופא Venugopalan, Veldina Camo, XiuLin ג&#39;אנג, Jinzhi יו, Weihua וואנג, וקטרינה ווקר על עזרתם בכתיבת וסקירה בפרוטוקול. אנו מודים מייק קרול לקראת צילומי ראיונות המחבר. אנחנו סוף סוף להודות לעורך ושלוש ביקורות של עמיתים אנונימיים על הערותיהם המועילות.

<ol><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123(2006).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+%28RT-PCR%29%3A+trends+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).</li>
<li>McCall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138(2016).</li>
<li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li>
<li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+screening+for+blood-borne+viral%2C+bacterial%2C+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li>
<li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li>
<li>Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li>
<li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Equine+Pract%22%5BJournal%5D)">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li>
<li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+of+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li>
<li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li>
<li>Dunne, G., Gurfield, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Veterinary+Diagnostic+Laboratory%2C+a+Model+for+the+One+Health+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).</li>
<li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+of+Ticks%3A+The+Rule+Rather+Than+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539(2016).</li>
</ol>

מרסיה סלייטר Elen Ortenberg הם עובדי Inc. תרמו פישר סיינטיפיק המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

הליך זה נעשה שימוש עבור בדיקות שיגרתיות של פתוגנים נשימה במעבדה שלנו במשך שישה חודשים (2-3 פעמים בשבוע). גם יש לנו הצלחה באמצעות אותו התהליך עבור פרופיל הפתוגן מעיים בדגימות צואה ומבודדת חיידקים על צלחת אישית בנפרד. לאחר הצלחות יוצר, צוות מנוסה יכול לבצע את שלבי 2-7 בתוך יום עבודה אחד רגיל. השלבים הקריטיים ביותר הם האיטום התקין של הצלחת קדם המגבר, העברת דגימות preamplified בין לוחות (אשר חייב להיעשות במהירות כדי למנוע אידוי), ואת הכיסוי הסופי של צלחת ההגברה. שימוש בגיליון האלקטרוני מאקרו כמדריך לניתוח תוצאה (בדיקת עקומות עבור דגימות ובקרות) היה קריטי גם כפי שהוא הקטין באופן משמעותי את משך הזמן ואת הניירת דרושה בתהליך זה. הגיליון המאקרו סיפק דוגמה; זה היה צריך להיות שונה או נוצר מחדש עבור צלחות עם תצורות שונות. זה יכול בקלות להיות PErformed ידי מישהו עם ידע גיליון אלקטרוני בסיסי. בשל כמות קטנה מאוד של המדגם טעון לצלחת הגברה (33 NL), נדרשת הגברה מראש. בשנת אופטימיזציה של פרוטוקול זה (לא מוצג), השווינו מספר פרמטרים preamplification כולל מיקס מאסטר, תוספת של פריימרים אקראיים, מספר מחזורי, זמן חישול, ודילול לפני הגברה. היו כל יעד תנאים אופטימליים משלה, ואלה המתוארים כאן מייצגים אלה הניבו את הגבול הטוב ביותר של הכללית זיהוי לפנל שלנו. פנל זה מכסה מגוון רחב של מטרות פתוגניים וסוגים מדגם כי הם נתקלו בדיקות אבחון וטרינרים שיגרתיות, אבל שינויים לנהלי preamplification עשויים להיות נחוצים עבור פנלים שונים. תנאי הגברת אופטימיזציה היצרניות מבוססים על פרוטוקול ה- PCR בזמן אמת המבוססת על בדיקה סטנדרטית עם 10 דקות ב 95 מעלות הפעלת אנזים C ואחריו denaturation על 95 מעלות צלזיוס ו אןאילינג / רחבה על 60 מעלות צלזיוס. פריימרים וזונדים הם מודפס מראש על הצלחות גם באמצעות תנאי אופטימיזציה יצרן ולכן אינו דורש טיטרציה. שילוב היפך-שעתוק צעדי הגברה מראש עבור כל הדגימות (ללא תלות בסוג של יעד) היה הכרחי על מנת לשמור על יעילות בתהליך העבודה. לאחר כל הדגימות הפוכות עבדו הוא גם מועיל עבור למקסם את הרגישות. יתר על כן, שימוש תערובת אמן עבור קדם המגבר כי הוא מותאם במיוחד מעכבי מזעור מאפשר צדדי שילוב סוגי מדגם שונים על אותה הצלחת. המרכז לבקרת מחלות (CDC) assay מטריקס שפעת מתואר על ידי שו et al. 7 והמותאמים כאן לתגובות בקנה מידת nanoliter הוא שפעת אוניברסלית assay שמתאימה מדגמי בדיקות מבני אדם ובעלי חי לוויה. זה היה מתוכנן לגילוי אוניברסלי של הגן מטריצה ​​של כל וירוסים שפעת באמצעות מחשבה בקנה מידה מיקרוליטרctions. זה כבר נעשה שימוש ברחבי העולם כחלק לוח וירוס האדם שפעת CDC ולוח שפעת החזירים CDC. את assay EHV-1 8 מותאמים כאן מזהה פתוגן נשימה חשוב של סוסים שיכולים לגרום הפלות ומחלות נוירולוגיות (נבדק על ידי Pusterla ו Hussey 10). המשמעות של התאמת בדיקות אלה פלטפורמת תפוקה גבוהה עם בקרה פנימית-עצמאי מינים היא שהם יכולים להיות משולבים בתוך גישת מעקב OneHealth. בשניהם של מבחנים אלה על פלטפורמת בדיקות תפוקה גבוהה יקל כוננות חירום עבור מתקנים קליניים, מקלטים, ואירועי ביצועים. התוצאות שתוארו לעיל היו נציג של כל המטרות על הצלחת למעט Mycoplasma cynos, אשר הראה הרבה יותר וריאציה בביצועים אנליטית. זה היה כנראה עקב טמפרטורת ההתכה תת אופטימלית (מ T) של פריימרים, אשר אידיאלי צריך להיות 58-60 &amp;# 176; C (החללית האידיאלית TM היא 68-70 מעלות צלזיוס). הגבלה של פלטפורמה זו היא כי זה לוקח יותר זמן כדי לתכנן ולייצר הצלחות מאשר להזמנת בדיקות בודדות, אשר מגבילה את היכולת לשנות רצפים במהירות. מגבלה נוספת של real-time PCR בכלל היא חוסר היכולת לזהות רומן או פתוגנים לא צפויים. זו ניתן להתגבר במידה מסוימת על ידי עיצוב מבחני תואמי רצפי מינים רבים, אבל רצף הגנום משוחד כולו מתודולוגיות מבוסס מתאימות יותר עבור חשיפת סוכני רומן. 11,12 PCR בזמן אמת ננו מאפשר פרדיגמה חדשה מבוסס תסמונת ולא בדיקות מינים מבוססים, אשר הן שימושי עבור הפחתת עלויות מגיבים ועבודת אבחון מולקולרי תפוקה גבוהה. בדיקות לוח בקנה מידה גדול על ידי גישה זו יכולה להקל המאמצים מעקב OneHealth כגון אלה המתוארים על ידי דאן Gurfield 13 ו Moutailler et al. 14. אוסף של דגימות ספוגיות מוקדם,בדרך כלל בתוך 3 ימים מהופעה קלינית, מספק את הסיכוי הטוב ביותר לזהות את נוכחותם של פתוגנים נשימה. הופעתה מחל זיהומיות היא לעתים קרובות בלתי צפויה, ובדיקות שניתן לבצע על מינים שונים ללא צורך שינוי של ריאגנטים הן אידיאליות עבור מוכנות. יישומים עתידיים של הטכנולוגיה הזו צפויים להיות ב pathotyping, פרופיל עמידות לאנטיביוטיקה, ולוחות אבחון קליניים מבוסס תסמונת נוספת. PCR בזמן אמת ננומטריים שימושי ביותר עבור לסינון מהיר, תפוקה גבוהה של סוגי מדגם הפתוגן מרובים, יהיה כהשלמת גישות המבוסס על רצף משוחדים או מוטות חלקית לזיהוי פתוגנים חדשים המתהווה.

עם ביקוש איתור מהיר ומקיף של סוכנים מרובים לדיאגנוסטיקה רפואית לבני אדם ולבעלי חיים, שיטות אבחון מולקולריות היחיד-אורגניזם לגילוי הפתוגן הם מכבידים אלא ממשמשים מספר רב של דגימות נבדקות עבור מחלה אחת. בהקשר הווטרינרים, מתודולוגיות אבחון תפוקה גבוהה חשובות במיוחד בשל צורך הנוסף לכיסוי פתוגנים ממגוון רחב של מינים. OneHealth גישות לניהול המחלה שמקורן במזון ומעקב הפתוגן המתעוררים הם דוגמאות של הצרכים בדיקות הכוללות מספר חיידקים, וירוסים (DNA או RNA מבוסס), טפילים ופטריות. האתגר שילוב בדיקות עבור analytes מרובים יחד (ריבוב) על מנת לשפר את יעילות הבדיקה היא הפסד אפשרי של רגישות נטל גדול עבור אופטימיזציה ואימות של מבחני. תגובת שרשרת בקנה מידה Nanoliter פולימראז בזמן אמת (PCR) הוא האלטריליד לפרקטיקה של ריבוב המאפשרת תגובות נפרדות רבות לרוץ בו זמנית על אותו המדגם 1. פלטפורמת OpenArray היא יישום של עיקרון זה 2; הוא משלב טכנולוגיה microarray עם PCR בזמן אמת. מבוסס על הרעיון של ריבוב מרחבים, כל מדגם הוא נבדק על מספר רב של מטרות נפרדות דרך חורים. פלטפורמה זו שמשה בתחילה עם כימית מחייב cyanine מבוסס פעמים התקועות DNA 2, והיא זמינה כעת עבור כימיה מבוססת בדיקה באמצעות 3 בדיקות מרווה כהות. פלטפורמה זו נעשה שימוש בעיקר עבור פרופיל גנטי בבני אדם ובעלי חיים 4 5. זה הותאם לאחרונה לזהות פתוגנים DNA ו- RNA-מובל בדם על ידי ואח Grigorenko. 6 באמצעות הליך שני שלבים הפוכה שעתוק / טרום הגברה (preamp). אנו מתארים כאן הליך מבוסס קדם מגבר אחד-צעד לגילוי שני סוגי פתוגנים שניות נשימהretions ומגוון של סוגי מדגם אחרים שיכול להתבצע אך ורק בתוך יום עבודה רגיל. עם ההשלמה קדם מגבר אחד-צעד, דגימות מועברות צלחת 384 גם, המהווה את הפורמט המקובל על ידי מערכת טיפול נוזל האוטומטית שמגיעה עם פלטפורמת ה- PCR ננו זה. המערכת שואבת את תערובת מאסטר ו המדגם על פני השטח של עד 4 צלחות (192 דגימות ובקרות) בכל פעם. בעקבות תהליך טעינה זה נתאר כיצד דגימות הם מוגברים ונותחו באמצעות גיליון אלקטרוני מאקרו המסכם את הממוצע של 3 משכפל טכני עבור כל שילוב מדגם / יעד בטבלה שמתאימה על דף מודפס אחד. שיטה אחידה לניתוח DNA חילוץ ו / או RNA מן הדגימות באמצעות פלטפורמה זו הוקמה. מגוון רחב של דוגמאות חולץ, הפוך עבד, וטרום-מוגבר בפורמט 96-היטב, מזעור האפשרות לטעויות. דגימות נשימה שנבחנו כללו בין היתר מטליות אף, מטליות בלוע עמוקות,שטיפות טרנס-קנה הנשימה, שטיפה ברונכואלוואולרית, ואת רקמת הריאה. מכיוון שהחלק מהסוכנים הנבדקים עשויים להיות גם בהווה בדם היקפי או צואה, שילבנו סוגים אלה של דגימות לתוך ההליך. זרמי עבודה זה עוזר לחסוך זמן ומשאבים לעומת הפעלת ניסויים ב צלחות מרובות, בכך שהיא מאפשרת בדיקה יעילה באמצעות זיהוי גן לוח מבוסס הפתוגן הרעלן במקום של בדיקות בודדות. פנל הנשימה הפגין כאן היה 18 מבחנים בכל מודפס בשלושה עותקים באמצעות חורים, להכיל עד 48 דגימות לכל צלחת. הפתוגנים סוסים זוהה כלולים אדנו סוסים 1 ו -2, וירוס arteritis סוסים, וירוס נזלת סוסים ו- B, הרפס סוסים (EHV) סוגים 1 ו -4, או סטרפטוקוקוס שוה. הפתוגנים הכלבי כלול קורונה נשימת כלבים (betacoronavirus), וירוס כלבלבת, אדנו כלבים, וירוס parainfluenza כלבים, pneumovirus כלבים, Bordetella bronchiseptica, ו cynos Mycoplasma. אAssay שפעת אוניברסלית שליטה פנימית (הפאג RNA MS2) נכללו גם.

<table><tbody><tr><td>מגיב ליטי Zap-OGlobin II</td><td>בקמן קולטר</td><td>7546138</td><td>מגיב אופציונלי להכנת דגימות דם.</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי (ערכת בידוד חומצות גרעין כוללת של MagMAX)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>ניתן להחליף ערכות מיצוי אחרות המתאימות לסוגי הדגימות הרצויות. ערכה זו מגיעה עם PBS, מאגר ליזה ומאגר כביסה.</td></tr><tr><td>2x תערובת RT-qPCR חד-שלבית (qScript XLT שלב אחד RT-qPCR ToughMix) Quanta</td> <td>Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פריימר ספציפי לגנים</td><td>IDT</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>ניתן ליצור על ידי המשתמש או לרכוש עם לוחות ההגברה.</td></tr><tr><td>תערובת פריימר אקראית</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>צלחת סטנדרטית 96 בארות</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td></td><td>N8010560 זו יכולה להיות כל צלחת שמתאימה למכונת ה-PCR הקונבנציונלית המשמשת.</td></tr><tr><td>תערובת מאסטר הגברה (תערובת מאסטר OpenArray)</td> <td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>אטם דבק שקוף</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>חותם נייר כסף</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 384 בארות</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>צלחת הגברה (צלחת QuantStudio 12K Flex OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>ניתנת להתאמה אישית עם כל בדיקה התואמת את תנאי TaqMan הסטנדרטיים.</td></tr><tr><td>ערכת אביזרים</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>מכילה את מכסי המארז, התקעים ונוזל הטבילה.</td></tr><tr><td>טיפים AccuFill</td> מכונת הגברה של <td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>(QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td> <td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>מטפל בנוזלים (OpenArray AccuFill System)</td> <td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>זה נרכש עם מכונת ההגברה.</td></tr><tr><td>תוכנת עיצוב פריימר (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>עיין בהוראות היצרן לקבלת מפרטי פריימר ובדיקה מפורטים.</td></tr><tr><td>תוכנית ניתוח תמונה (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>זמין בכתובת http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>תוכנית גיליון אלקטרוני (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>זמין בכתובת</td></tr><tr><td>https://products.office.com/en-us/excel DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>משבש רקמות (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>מחזורי תרמי קונבנציונאלי (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>ניתן להשתמש בכל מחזור תרמי קונבנציונאלי עם מכסה מחומם.</td></tr><tr><td>ספינר צלחת PCR</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>למכשיר זה יש מהירות אחת בלבד (2,500 סל"ד); הרוטור מתחיל כאשר המכסה סגור ונעצר כאשר הכפתור נלחץ.</td></tr><tr><td>חוצץ TE</td><td>Millipore</td><td>8890-100 מ"ל</td><td>10 מ"מ טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד, 1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, pH 8.0</td></tr></tbody></table>

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו pcr

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

סולם Nanoliter בזמן אמת PCR משתמשת ריבוב מרחבים לאפשר מבחני מרובים שיופעלו במקביל על צלחת אחת ללא חסרונות הטיפוסיים של שילוב תגובות ביחד. עיצבנו ומוערכת פאנל מבוסס על העיקרון הזה כדי לזהות את נוכחות במהירות של סוכני מחלה נפוצה אצל כלבים וסוסים עם מחלה נשימתית חריפה. כתב יד זה מתאר עבודה PCR ננו איבחוני הכנת המדגם, הגברה, וניתוח רצפי הפתוגן היעד, תוך התמקדות והליכים שונים מתגובות מידה מיקרוליטר. בחלונית הנשימה שהוצגה, 18 מבחנים היו כל להגדיר בשלושה עותקים, להכיל עד 48 דגימות לכל צלחת. חילוץ אוניוורסלי זרימת עבודה מראש הגברה הוטבה הכנת מדגם תפוקה גבוהה כדי להכיל מטריצה ​​מרובה פתוגנים מבוסס DNA ו- RNA. נציג נתונים מוצגים עבור היעד RNA אחד (שפעת A מטריצה) ויעד DNA אחד (הרפס סוסים1). היכולת מהירה ומדויק לבדוק עבור קבוצה מקיפה, מבוסס-תסמונת של פתוגנים היא כלי רב ערך לשיפור יעילות ארגונומיה של בדיקות אבחון לאבחון מחלה נשימתית חריפה וניהול.

תוצאות מוצגות איורי 1 ו -2 עבור assay RNA נציג (מטריקס שפעת) ו assay DNA (EHV-1) עם שילוב של בקרות חיוביות דגימות קליניות שהוגשו לבדיקת אבחון שיגרתית. אותות הקרינה הנפלטת ברחבי תגובה אופיינית זו מוצגים באיור 1, אשר מגרש ערכי קרינת גלם למחזור. כל סף מחזור יחסית (CT) הערכים שנוצרו באופן אוטומטי על ידי תוכנת מכשיר הגברה. רקע קרינה שמשה כמדד נפרד עבור הערכה של איכות טעינה ולא לשלב אותו לתוך קריאות הקרינה לפני חישוב ערכי ה- CT. מגבלת אנליטי של זיהוי (לוד) לכל יעד חושבה על בסיס ממוצע הכולל של ערכי ה- CT ברמת זיהוי 95% בתוספת 2 סטיות תקן בתוך שלולית של בקרות עבורכל המטרות. הדילול הגבוה ביותר שבו לפחות 95% של המשכפל היו חיוביים עבור מבחני הנציג היה 50 עותקים; זיהוי של 5 עותקים היה מוצלח ב -50% של משכפל. assay לא זוהה ב להלן עותק אחד. LODs עבור assay רנ&quot;א ודנ&quot;א חושבו ערכי ה- CT של 21.92 ו 20.05. ערכים אלה נחשבו להיות ההפסקות עבור ערכי דיווח כחיוביים לעומת חשוד (בפוטנציה לא דיר). היבטים אחרים של ביצועים האנליטי של המטרות הוערכו באמצעות דילולי סדרה של בקרות חיוביות ותקווינה לרוץ על שלושה ימים שונים (איור 2). הנצילות הממוצעת של מבחני רנ&quot;א ודנ&quot;א נציג היו 101.1% ו 106.6%; את היעילות הכוללת הממוצעת עבור כל המטרות היה 101.3%. המבחנים גם היו ליניאריות טובים (R 2&gt; 0.98). וריאציה בתוך לשכפל דרך חורים בדרך כלל הייתה בתוך סטיות תקן של 0.2 הם דגימות קליניותשולט ד. אין תגובה צולבת בין המיקודים נצפתה. גיליון התוצאות הסופיות בקובץ המשלים מראה תוצאות כמותיות נציג 10 דגימות אבחון קליניות ו -4 שולטת. הדגימות הקליניות הן קבוצת משנה של סוגי דגימות שנבדקו שגרתי כולל אף / מטליות לוע תחתונות, רקמת ריאה, דגימות צואה. אחת (סוסים) דגימת צואת קבוצה זו מציגה בקרה פנימית MS2 נכשלה, אשר מעידה על קיומו של מעכבים במדגם. זה בדרך כלל מנוהל על ידי דילול של המדגם eluted ו / או מחדש החילוץ. כמו במקרה כאן, שליטת ההגברה השלילית צריכה להיות שלילית עבור כל המטרות, ואת שליטת החילוץ השלילית צריכה להכיל רק את הבקרה הפנימית. במערכה הקלינית, דגימות פיק ערכי ה- CT עבור betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, וירוס כלבלבת, וירוס parainfluenza כלבים, pneumovirus כלבים, ושפעתא. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> איור 1. חלקות הגברה. קריאות הקרינה הם זממו נגד מחזורים הגברה עבור assay RNA (א) ו assay DNA (B). משולשים מוצגים המציין ערכי ה- CT. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> איור 2. עקומות סטנדרטיות. עקומות סטנדרטיות מן assay רנ&quot;א ודנ&quot;א נבדק על שלושה ימים שונים הם זממו כדי להדגים את הליניאריות ומגוון הגברה באמצעות בקרות חיוביות. סף מחזור (CT) ערכים הם זממו נגד יומן (10) של מספר העותקים של RNA (א) או DNA ( <strong&gt; B) סטנדרטי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> סכמטי לוח 1. ממיקומי צלחת יעד ההגברה. הצלחות המשמשות לבדיקות ננו בזמן אמת PCR על פלטפורמה זו הוא מיקרוסקופ שקופיות בגודל מסודרים 48 subarrays של 64 דרך נקבית, עם סך של 3,072 דרך חורים עבור שתגובות אישיות. subarray אחד מוצג כאן, עם 18 מטרות בשלושה עותקים. מדגם כל מתווסף subarray אחד על ידי המטפל הנוזלי. צלחות מצופות תרכובות הידרופילי הידרופובי לשמור ריאגנטים ב-חורים דרך באמצעות מתח הפנים. שבב הנירוסטה &quot;מתובנת photolithographically ורטוב-חרוט כדי ליצור מערך מרובע של 3,072-במכונת מייקרו, 320 מיקרומטר diamete. r חורים של 33 nl כל &quot;2 קיצורים עבור המטרות הן כדלקמן: BCOR, קורונה הנשימה כלבים (betacoronavirus); Bord, Bordetella bronchiseptica CAV, אדנו כלבים; CPIV, וירוס parainfluenza כלבים; CPNV, pneumovirus כלבים; DISTA / B, כלבים כלבלבת וירוס A ו- B; EADV1 / 2, אדנו סוסים 1/2; EAV, וירוס arteritis סוסים; EHV1 / 4, סוג ההרפס סוסים 1/4; ERVA / B, וירוס נזלת סוסים A / B; IVM, שפעת A מטריצה; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, הבקרה הפנימית (הפאג RNA MS2); SEQU, שוה סטרפטוקוקוס. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> מפת פלייט העברת טבלת 2.. מפת העברה בצבעי צלחת בעזרת פיפטה 8 ערוצים קבועים להעביר מהצלחת קדם מגבר 96-גם הצלחת 384 גם מוצגת. לחילופין, פיפטה מתכווננת ניתן להשתמש. ההליך אותו מבוצע בכל פעם ללא קשר h<html> ow דגימות רבות נמצאות הצלחת. <img alt="קובץ נוסף" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> קובץ משלימה. קובץ גיליון אלקטרוני מאופשר מאקרו המכיל שתי פקודות מאקרו עבור תוצאות עיצוב לתוך טבלת סיכום (כמתואר בפרוטוקול) מסופק. שולחן תוצאה אופייני שנוצר על ידי הפקודות מאקרו נכלל בקובץ (תחת תוצאות סופיות). שתי פקודות מאקרו ימלא את שמות מדגם בעמודה הראשונה (עד 48 דגימות) ואת הממוצע של שלושת ערכי ה- CT לכל יעד עבור אלה עם תוצאות חיוביות; מטרות לב שלא להגביר להופיע ריקות בטבלה זו. זה יכול בקלות להיות מודפס על פיסת נייר אחד והשתמש כהפניה לבדיקת הנתונים הגולמיים ביעילות. בלשונית התוצאות הסופיות, תוצאות נציג 10 דגימות קליניות ו -4 שולטת מוצגות. קיצורים לשמות assay הם שבאגדה של טבלה 1.&quot;Target =&quot; www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

בדיקות תפוקה גבוהה של פתוגנים מבוססים DNA ו- RNA על ידי ננו PCR מתוארות באמצעות כלבים syndromic ולוח PCR נשימת סוסים.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

המטרה הכללית של מתודולוגיית בדיקת ה-PCR בזמן אמת זו היא לזהות פתוגנים המבוססים הן על DNA והן על RNA יחד, באופן בעל תפוקה גבוהה. חומצות גרעיניות מדגימות קליניות יועברו הגברה ראשונית באמצעות מאגר פריימרים משותף שנטען על פלטת OpenArray, ולאחר מכן ינותחו כדי לבדוק נוכחות של פתוגנים. שיטה זו עשויה לסייע בקידום מאמצי מעקב של OneHealth עבור מחלות זיהומיות.בהשוואה לטכניקות מסורתיות, שיטה זו מאפשרת לבחון מספר רב יותר של דגימות עבור יעדים רבים יותר ללא תחרות ביניהם, ובכך משפרת את יעילות הבדיקה. השיטה משתמשת בלוח PCR ננו-סקאלי מותאם אישית. הפריימרים והפרובים מודפסים על דפנות החורים, והדגימות נטענות באמצעות מערכת לטיפול בנוזלים (liquid handler).אנו נדגים את השיטה על דגימות קליניות הנבדקות עבור פאנל של פתוגנים נשימתיים של סוסים וכלבים. כדי להתחיל בהליך זה, תכננו את הפלטה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפלטה המשמשת כאן מוגדרת עם 18 מטרות בשלוש חזרות.הוסיפו מצע לסמרגולים ולשטיפות הקשקש כך שיהיה לפחות 1 עד 2 מיליליטר של נוזל. ערבלו ב-Vortex את הסמרגול ואת ה-DMEM בעוצמה בתוך המבחנה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להעביר כ-1 מיליליטר מהמצע למבחנה חדשה.הוסיפו 235 µL של תמיסת ליזיס ו-175 µL של דגימה לכל מבחנה עם חרוזים. המשיכו לפי פרוטוקול היצרן כדי להפיק את כלל החומצות הגרעיניות. הכינו את הדגימה לתסגירה הפוכה ולהגברה מקדימה של החומצה הגרעינית (preamp) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, לאחר אימות מפת הדגימות.הוסיפו 8.5 µL של תערובת מאסטר ל-preamp ו-5.5 µL של דגימת DNA/RNA לכל באער של פלטה סטנדרטית בעלת 96 באערים, תוך שימוש בצד השמאלי של הפלטה בלבד. לאחר שילוב הדגימות, הביקורות החיוביות והביקורות השליליות עם תערובת ה-preamp, אטמו היטב את הפלטה הסטנדרטית בעלת 96 הבאערים באמצעות מדבקת איטום שקופה. הסירו שאריות של מדבקת האיטום בעזרת להב תער כדי למנוע היווצרות של חרירי איטום במהלך המחזורים.סובב את הפלטה האטומה במשך 20 שניות באמצעות סובב פלטות PCR. ודא שכל הריאגנטים התאחדו בתחתית בארי הפלטה. לאחר הפעלת תרמוציקלר קונבנציונלי, בחר את תוכנית מחזורי הקדם-הגברה (preamp) והפעל את התוכנית.הניחו את פלטת 96 הבא ebenfalls במכשיר הטרמוסייקלר רק כאשר החלק התחתון של המכשיר מגיע לטמפרטורה הנדרשת להפקת cDNA, וזאת באמצעות ניטור קריאת הטמפרטורה על גבי המסך. עם סיום הרצת ה-preamp, ודאו שהפלטה נותרה אטומה. לאחר חבישת כפכופים כפולים וכיסויי שרוולים, הסירו את האטם מפלטת ה-preamp.לאחר מכן, הסירו בזהירות והשליכו את הכפפות החיצוניות. דללו את תוצרי ה-preamp ביחס של אחת לחמש על ידי הוספת 56 µL של TE buffer לכל באער בעמודות אחת עד שש של לוח ה-preamp בעל 96 באערים, וערבבו באמצעות פיפטינג למעלה ולמטה. לצורך כך, הגיעו רק לעצירה הראשונה של הפיפטה, שאבו מהתחתית והשליכו גבוה יותר, אך הימנעו מיצירת בועות.הוסיפו תמיסת TE לכל שש העמודות, ללא קשר לבארים שאינן בשימוש. הכינו את ההעברה של 384 הבארים לצלחת ההגברה (amplification plate) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. עם סיום שלבי ההכנה, לבשו כפפות כפולות חדשות המותאמות למידה ומגני שרוולים.בשל שיעורי אידוי גבוהים בעת פיפוט של נפחים נמוכים, קריטי להעביר את תערובת המאסטר (master mix) ואת הדגימה ביעילות ולאטום את הפלטה באופן מיידי. הוסיפו 2.5 µL של תערובת מאסטר להגברה לפלטה בעלת 384 בארות. פלטות לבנות משמשות כאן למטרות הדגמה, אך יש להשתמש בפלטות שחורות כדי להפחית את מאמץ העיניים.העבר 2.5 µL של מוצר ה-preamp המדולל לפלטת 384 הבארים בהתאם למפה בפרוטוקול הטקסט. קוביות הצבעים המוצגות כאן ממחישות את רצף ההעברה עבור פיפט בעל ערוץ קבוע. כסה מיד את הפלטה בצורה הרמטית באמצעות סגירת רבד (foil seal).הסיר את הכפפות החיצוניות ואת כיסויי השרוול. סבב את פלטת 384 הבארים במשך 20 שניות בצנטריפוגה המיועדת לפלטות PCR. אל תסיר את כיסוי הרדיד, והנח את פלטת 384 הבארים במערכת לטיפול בנוזלים.פתחו את המארז המכיל פלטת הגברה עטופה והניחו אותה בזהירות במערכת לטיפול בנוזלים (liquid handler) בחריץ הראשון כאשר המספר הסידורי נמצא מצד ימין; החזיקו את המארז בקצוות מבלי לגעת בנקודן הפלטה. הסירו את חסם הרדיד מפלטת ה-384 בארות בתוך מערכת הטיפול בנוזלים לאחר שהכל הונח במקומו. לחצו על "הבא" ולאחר מכן סמנו את כל התיבות עם השלמת כל שלב.סגרו את הדלת של מערכת העברת הנוזלים (liquid handler) והתחילו מיד בתהליך המילוי. הישארו לצד מערכת העברת הנוזלים ועברו מיד לשלב הבא ברגע שהפלטה תהיה מלאה. בזמן שמעברת הנוזלים פועלת, הסירו את שכבת המגן מחלקו התחתון של מכסה המארז.השאירו את הסרט העליון במקומו. הכינו את הסרט האדום על ידי משיכה קלה כדי לשחררו מהדבק. הוציאו את לוח ההגברה הטעון ממטפל הנוזלים והניחו אותו בעדינות במכבש הלוחות כאשר המספר הסידורי פונה ימינה.הנח את המכסה על גבי הפלטה כאשר הקצה השרוי נמצא מימין והדבק נמצא למטה. משוך למטה את ידית הלחיצה של הפלטה כדי לסגור אותה בזהירות; הנורה תהבהב למשך 20 שניות. אין לגעת במכבש הפלטה במהלך זמן זה.ברגע שהנורה הופכת לירוקה קבועה, הרימו את המנוף והוציאו בזהירות את הפלטה האטומה תוך כדי החזקה בקצוותיה. בעודכם מחזיקים את פלטת ההגברה האטומה במצב אנכי מקצוות המארז, הכניסו מיד את קצה המזרק לפתח הטעינה שבקצה המארז, ולאחר מכן מזגו את נוזל השקיעה לאט בתנועה רציפה ועדינה אחת כדי למלא את החלל שבין הפלטה למכסה. השאירו בועית אוויר קטנה אחת בפינה לאחר שקיעת הפלטה.בעודכם מחזיקים את הפלטה במצב אנכי מקצותיה, אטמו את פתח הטעינה על ידי הכנסת הפקק לפתח וסיבובו עם כיוון השעון; הפילו לחץ מספיק עד שהידית נשברת. נקו את המארז באמצעות מטלית נטולת סיבים שהורססה היטב באתנול. כדי לייבש את המארז, נגבו אותו בתנועה כלפי מטה עם מטלית נקייה.העבירו את הפלטה האטومة למכונת ההגברה. תחת לשונית המכשיר, בחרו בלוח הבקרה של המכשיר. בחרו במכונת ההגברה ולאחר מכן לחצו על כפתור פתיחת הדלת.הניחו את פלטת ההגברה בחריץ הראשון של מתאם הפלטות, תוך בדיקה שהמתאם מיושר כראוי עם המספר 1 בפינה השמאלית העליונה. כווןו את הפלטה כך שברקוד פונה כלפי מעלה ואל חזית המכשיר. לאחר לחיצה על כפתור סגירת הדלת, נווטו ללשונית הבית בתחתית המסך.בתפריט ההרצה (run), בחרו ב-OpenArray. לחצו על קבלת מזהי לוחות (get plate IDs). כדי להתחיל את ההרצה, לחצו על התחל הרצה (start run).פתח גיליון אלקטרוני המכיל את מאקרו התוצאות. בקובץ הנתונים המיוצא, לחץ לחיצה ימנית על הלשונית בתחתית המסך ובחר ב"העברה או העתקה" (move or copy). בשדה "אל ספר" (to book), בחר במאקרו התוצאות.לאחר מכן לחצו על move to end וסמנו את תיבת הסימון create copy. לבסוף, לחצו על okay. מחקו את לשונית ה-export הישנה ושנו את שם הלשונית החדשה שהתווספה ל-export.לחצו על תצוגה (view) ולאחר מכן על מאקרו (macros), ובחרו את המאקרו, ואז לחצו על הרץ (run). לאחר מכן, חזרו על הפעולה עבור Macro2 על ידי לחיצה על תצוגה (view), לאחר מכן על מאקרו (macros), בחירת Macro2 ולחיצה על הרץ (run). בתוכנת מכשיר ההגברה, בדקו את העקומות עבור כל דגימה ובקרת איכות אל מול טבלת המאקרו על ידי בחירה באופציית ניתוח/תרשים הגברה (analysis/amplification plot) בצד שמאל של המסך.לאחר מכן, בחרו בלשונית הדגימות והקליקו על כל דגימה כדי לוודא שקיימות שתי או שלוש עקומות הגברה חיוביות עבור כל אחת מהתוצאות החיוביות בטבלה. קריאות הפלואורסצנציה מופיעות מול מחזורי ההגברה כדי להדגים כי ה-real-time PCR בוצע בהצלחה. מרבית הדגימות הגיעו לרמות סף יחסיות בין מחזורים 2 ל-25 של תגובת ה-real-time PCR.עקומות סטנדרט שהורצו בשלושה ימים שונים מוצגות כדי להדגים את הלינאריות ואת טווח ההגברה באמצעות בקרים חיוביים. ערכי סף המחזור (Ct) מוצגים מול לוגריתם בבסיס 10 של מספר עותקי הסטנדרט של החומצה הגרעינית. שני המאקרויים ימלאו את שמות הדגימות בעמודה הראשונה ואת הממוצע של שלושת ערכי ה-Ct עבור כל מטרה עבור אלו עם תוצאות חיוביות.מטרות שלא עברו הגברה מופיעות כריקות בטבלה זו. מוצגות תוצאות כמותיות עבור 10 דגימות קליניות וארבע בקרות שגרתיות; כפי שניתן לראות כאן, בקרת ההגברה השלילית צריכה להיות שלילית עבור כל המטרות, ובקרת המיצוי השלילית צריכה להכיל רק את הבקרה הפנימית. דגימה אחת בסדרה זו מראה כישלון של הבקרה הפנימית, דבר המעיד על נוכחות של מעכבים בדגימה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע ניסוי PCR בקנה מידה ננומטרי. פרוצדורה זו תקל על הרצת פאנלים מבוססי תסמונים באבחון וטרינרי. ניתן להתאים שיטה זו כך שתכלול בדיקות לגורמים מחוללי מחלות של מחלות זיהומיות שונות רבות.

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

רצף Nanopore הוא טכנולוגיה חדשנית המאפשרת רצפי בעלות חסכונית במיקומים מרוחקים והגדרות משאב-עני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור רצף של mRNAs מתוך דם שלם התואם לתנאים כאלה.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

במאמר זה פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור קביעה מהירה ואמינה של רמות ביטוי גנים בדגימות C. elegans יחיד או בתפזורת מתואר. פרוטוקול זה אינו דורש בידוד RNA ומייצר cDNA ישירות מדגימות. ניתן להשתמש בו יחד עם פלטפורמות qPCR ננופלואידיות מרובות תפוקה גבוהה בזמן אמת.

RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות סי.

אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

פרוטוקול זה נועד לכמת RNA של SARS-CoV-2 בדגימות שפכים ואוויר שישמשו למחקרים אפידמיולוגיים מבוססי שפכים ולהעריך את סיכון החשיפה ל- SARS-CoV-2 באירוסולים פנימיים וחיצוניים. פרוטוקול זה מתאר גם גישת ריצוף ארוך של אמפליקון פרוש עבור אפיון גנום שלם של SARS-CoV-2.

כימות ואפיון גנום שלם של RNA SARS-CoV-2 בדגימות שפכים ואוויר

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה וחסכונית לאפיון גנומים של נגיף הכלבת (RABV) באמצעות טכנולוגיית ננו-נקבוביות. זרימת העבודה נועדה לתמוך במעקב מבוסס גנומיקה ברמה המקומית, לספק מידע על שושלות RABV מסתובבות ומיקומם בתוך פילוגניות אזוריות כדי להנחות אמצעים להדברת כלבת.

ריצוף גנום שלם לאפיון מהיר של נגיף הכלבת בטכנולוגיית ננופור

אנו מציגים שתי ערכות RT-qPCR חד-שלביות מבוססות בדיקה עבור וירוסים נשימתיים נפוצים. הבדיקה הראשונה היא עבור SARS-CoV-2 (N), שפעת A (H1N1 ו- H3N2) ושפעת B. השני הוא עבור SARS-Cov-2 (N) ו- MERS (UpE ו- ORF1a). בדיקות אלה ניתן ליישם בהצלחה בכל מעבדה מיוחדת.

פיתוח מבחני RT-qPCR בזמן אמת לזיהוי SARS-CoV-2, שפעת A/B ו-MERS-CoV

פתוגנים חיידקיים שונים עלולים לגרום לזיהומים בדרכי הנשימה ולהוביל לבעיות בריאותיות חמורות אם לא מזהים אותם במדויק ומטפלים בהם מיד. זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים אלה באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה מספק ניהול ובקרה יעילים של זיהומים בדרכי הנשימה בסביבות קליניות.

זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי

כאן, אנו מתארים הליך פשוט ומהיר לזיהוי DNA מפתוגנים של דבורים, כגון Lotmaria passim ו-Nosema ceranae, באמצעות ליזיס תאים מוכן להגברה, הגברת פולימראז רקומבינאז ומבחני CRISPR/Cas12a.

זיהוי DNA באתר של טפילים טריפנוזומטיים ו-nosema ceranae באמצעות ליזה אלקליין בשילוב עם מערכת RPA/CRISPR/Cas12a

למד שיטת PCR בננו-קנה מידה לזיהוי פתוגנים נשימתיים בכלבים וסוסים בבת אחת. שיטה זו משפרת את יעילות הבדיקה ותומכת במאמצי מעקב OneHealth למחלות זיהומיות.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

גלה סרטונים נוספים