מידע מבני מ-מולקולה בודדת סריג ניסויים באמצעות מערכת ננו-המיצוב המהירה
February 9th, 2017
אנו מציגים את הליך ההתקנה והניסוי להשגת נתוני smFRET מרשתות תורמים-מקבלות גדולות עם מיקרוסקופ TIRF. הניתוח שלב אחר שלב של מדידות אלו עם תוכנת ההסקה הבייסיאנית Fast-NPS מניב מידע מבני ברזולוציה גבוהה באמצעות יישום מודלים מותאמים של צבע.
המטרה הכוללת של מערכת המיקום המהיר של ננו היא לספק מידע מבני בזמן אמת של ביומולקולות על ידי שילוב ניסויי FRET של מולקולה בודדת עם ניתוח סטטיסטי קפדני. שיטה זו עונה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית כגון לוקליזציה של תחומים גמישים במקרומולקולות בהן לא ניתן ליישם כלים סטנדרטיים של ביולוגיה מבנית. השיפור העיקרי של NPS מהיר בהשוואה לכלים מבניים אחרים מבוססי FRET הוא שניתן להשוות מודלים שונים של צבע לא רק באמצעות המיקומים הסבירים ביותר, אלא גם התפלגות הסתברות תלת מימדית.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת נתונים מבניים ממסד הנתונים של החלבונים עם מדידות פלואורסצנטיות כמותיות של מולקולה אחת. כדי להתחיל בהליך, הרכיבו תא זרימה ומחזיק מדגם. כדי להכין את ברגי הכניסה והיציאה, השחילו צינורות סיליקון לתוך ברגי לשונית חלולים וחתכו את הצינור ישר משני קצותיו בעזרת סכין גילוח.
הברג את ברגי הלשונית למחזיק המדגם. יישר את חורי ההחלקה של קוורץ של תא הזרימה עם חוטי מחזיק הדגימה. הדק בעדינות את ברגי מחזיק הזכוכית כדי לקבע את תא הזרימה במקומו.
השחילו חתיכות צינורות סיליקון באורך 20 ס"מ לתוך ברגי הכניסה והיציאה. שטפו את תא הזרימה עם 500 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן שטפו את תא הזרימה עם 100 מיקרוליטר של תמיסת נויטרווידין ב-PBS, וודא שנוצרת טיפה בקצה צינור הכניסה כדי למנוע כניסת אוויר לתא הדגימה.
מהדק את צינורות הכניסה והיציאה לאחר כל מניפולציה כדי לא לכלול אוויר מתא הזרימה. דגרו את החדר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את תמיסת הנויטרווידין עם 500 מיקרוליטר PBS.
הוסף טיפת שמן טבילה על הפריזמה, והברג את המנסרה על תא הדגימה. נתוני ה-FRET של מולקולה אחת נרכשים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הפעל את תוכנת המצלמה ואת תוכנת ה-piezo-motor stage.
התקן את החדר לשלב המיקרומטר של מיקרוסקופ ה- TIRF בצורה אופקית, ישרה ככל האפשר, ובצורה כזו שהוא חוצה את כל שלושת הלייזרים. הוסף נוזל טבילה, ומקד את מטרת המיקרוסקופ על ידי בדיקת השתקפויות ה-IR. הגדר את פרמטרי המצלמה, נתיב הקובץ ופרמטרי ההגדלה האוטומטית.
התחל את הזנת המצלמה בשידור חי ואת הקרינה ברקע באמצעות כל שלושת הלייזרים בעוצמות מלאות. לאחר מכן, הנמיך את עוצמות הלייזר. לאחר מכן, טען 100 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים פלואורסצנטית לתוך החדר.
המתן 10 דקות עד שהחרוזים ייקשרו למשטח החדר. הקלט סרט עם שדה ראייה של 50 עד 100 חרוזים, ובצע ניתוח אצווה עם סף מציאת שיא גבוה. טען את קובץ הסרט ובחר שני חרוזים עם מרכזים ברורים בפינות מנוגדות של שדה הראייה.
בחר את הפיקסלים בעלי העוצמה המרבית בחרוזים אלה. הסר ונקה את הפריזמה. הכן תא דגימה שני, והברג את מחזיק המנסרה על החדר.
הרכיב את החדר לשלב המיקרומטר. לאחר מכן, טען 100 מיקרוליטר של תמיסה פיקומולרית של 50 עד 100 של דגימה ביוטינילית עם תווית פלואורסצנטית לתוך החדר. המתן עד שהמולקולות ייקשרו למשטח החדר.
לחץ בו-זמנית על Take Signal כדי להתחיל להקליט ולהפעיל את לייזר עירור התורם. כוונן את עוצמת הלייזר כדי להבטיח שלפחות 80% מהמולקולות בשדה הראייה מולבנות, לאחר מכן, הזז את החדר כדי להציג אזור לא מולבן, והקלט את הסרט הבא. הלבינו את שאר תא הדגימה בדרך זו.
לאחר המדידות במיקרוסקופ TIRF, יש לנתח את נתוני ה-FRET של מולקולה אחת שנרכשו כדי להניב את יעילות ה-FRET הממוצעת. בצע ניתוח אצווה של סרטי התורם והמקבל של הדגימה. לאחר מכן, טען את קבצי הסרטים באצווה בתוכנת ניתוח הנתונים.
לחץ על הכפתור לא נבחר כדי לציין את שלבי ה- FRET הבודדים. לחץ על תחילת תקופת ה-FRET, לאחר מכן על נקודת הזמן שבה עוצמת המקבל פוחתת עקב הלבנה, ולבסוף על נקודת הזמן שבה עוצמת התורם יורדת עקב הלבנה. בחלון הבא, בחר כן כדי לשמור על מעקב היעילות של FRET שנבחר.
לאחר ניתוח כל מולקולה, שמור את העקבות ונתח את הסרט הבא. לאחר השלמת הניתוח, הפעל קובץ Script כדי לשלב את תוצאות ה-FRET. ייבא את קובץ ה-FRET המשולב מבחינת מסגרת לתוכנת ניתוח נתונים באמצעות אפשרות הקלט המוגדרת כברירת מחדל.
התווה את הנתונים כהיסטוגרמה והשתמש בכלי התאמת העקומה הלא ליניארית כדי להתאים לגאוס. ערך החריגה הוא יעילות ה-FRET העיקרית. השתמש ב-UV VIS ובספקטרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לקבוע את הרדיוס האיזוטרופי של פורסטר, ואת ערכי האניזוטרופיה במצב יציב עבור כל צבע.
מערכת הננו-מיקום נוצרה בהשראת ה-GPS הידוע, כאשר אנו ממקמים מיקום לא ידוע, האנטנה, עם מספר מיקומים ידועים, הלוויינים. כדי להתחיל בניתוח NPS, הפעל את תוכנת FastNPS וצור קובץ עבודה חדש. כדי להגדיר את המיקום הקודם של האנטנות והלוויינים המסומנים בתווית, בחלון ModelDyePre, הזן את הרזולוציה המרחבית של המיקום המוגדר.
אל תכלול את פנים המקרומולקולה על ידי טעינת קובץ ה-PDB הממורכז המתאים. הזן את קוטר הצבע ואת מרחק השלד. מלא את קואורדינטות המיקום המינימלי והמקסימלי של מיקום הצבע האפשרי.
אם המיקום המוגדר הוא לוויין, בחר חיבור צבע באמצעות קישור גמיש, והזן את קואורדינטות האטום מקובץ ה-PDB הממורכז. מלא את האורך והקוטר של המקשר. לחץ על חשב נפח נגיש, שמור את המיקום לפני וייצא אותו לתצוגה חזותית.
חזור על תהליך זה עבור כל הלוויינים והאנטנות. לאחר הגדרת המיקומים, פתח את חלון הגדרת המדידה וצור מולקולת צבע חדשה. טען את המיקום הקודם המשויך לצבע זה.
מלאו את האניזוטרופיה הקרינה, בחרו מודל צבע מתאים והפעילו את הצבע. חזור על תהליך זה עד להגדרת כל הצבעים. לאחר מכן, צרו מדידה חדשה.
בחר זוג FRET מהצבעים שהוגדרו. הזן את יעילות ה-FRET של מולקולה אחת עם שגיאה, ואת רדיוס פורסטר האיזוטרופי של זוג צבעים זה, והפעל את המדידה. חזור על פעולה זו עבור כל זוגות הצבעים.
לאחר מכן, פתח את חלון החישוב. אם הוקצו צבעים לדגמים שונים, בחרו 'מוגדר על-ידי המשתמש'. אחרת, בחר את הדגם לשימוש עבור כל הצבעים.
בצע את החישוב ופתח את חלון התוצאות. בעת שימוש ב-FastNPS, חשוב לזכור להתאים את הדגמים לכל הצבעים על מנת למזער את הנפחים האמינים, תוך שמירה כמובן על עקביות. אם הסמיכות נמוכה מ- 90%, לחצו על עקביות מפורטת, וזהו את הצבעים המשותפים לפריטים בעלי עקביות נמוכה מ- 90%.
פתח את החלון הגדרת מדידה ושנה את דגם הצבע המדובר. הפעל מחדש את החישוב במצב מוגדר על-ידי המשתמש. ייצא את הכמויות האמינות של הצבעים בנפרד, או כאצווה.
פתח את קבצי הצפיפות בתוכנת ההדמיה, והתאם את האמינות לרמה הרצויה. יעילות FRET של מולקולה בודדת נמדדה בין מולקולות אנטנה לא ידועות ומספר מולקולות לוויין ידועות בתוך קומפלקס מקדם פתוח של RNA פולימראז ארכאי. ניתוח NPS של נתונים אלה קבע את הנפחים האמינים של מולקולות צבע אלה ביחס לקומפלקס המקדם הפתוח של RNA פולימראז הארכאי.
חמישה מודלים שונים שבהם נעשה שימוש במולקולות הצבע, והתוצאות הושוו. הנפחים האמינים היו עקביים עם הנתונים שנמדדו כאשר חושבו עם מודלים שהניחו שהצבע יכול להסתובב בחופשיות רק בתוך חרוט בעל כיוון לא ידוע. הדגם הקלאסי בפרט הוא השמרני ביותר, מכיוון שהוא מניח עוד יותר שהצבע נמצא במקום קבוע.
זה יוצר נפח אמין גדול יחסית, אך הנפח בדרך כלל סוגר את המיקום הנכון. מודלים בעלי דיוק גבוה יותר משתמשים בהנחה שהצבע חופשי לחלוטין להסתובב במהלך חיי הקרינה שלו. מודל ה-iso, כמו המודל הקלאסי, מניח שהצבע נמצא במיקום קבוע בתוך הנפח הנגיש.
מודל ה-meanpos-iso מניח ממוצע דינמי על פני כל המיקומים האפשריים. בעוד שהנפחים האמינים של מודלי ה-iso קטנים בהרבה מאלה המחושבים על ידי המודלים שאינם iso, הם אינם עולים בקנה אחד עם הנתונים הנמדדים. רצינו לפתח טכניקה המאפשרת לנו ללכוד מידע מבני דינמי של קומפלקסים חולפים, בעיה שלא ניתן לטפל בה באמצעות כלים מבניים קיימים.
לאחר רישום נתוני ה-FRET של מולקולה אחת, ניתוח FastNPS נעשה תוך מספר שעות, ומאפשר השוואה מהירה של דגמי צבע שונים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו סימולציות MD לאחר מכן על מנת להשיג מודלים מובנים התואמים לנתוני FRET ניסיוניים של מולקולה אחת.
סקירה
מאמר זה מציג נוהל מפורט לקבלת נתוני FRET של מולקולה יחידה (smFRET) באמצעות מיקרוסקופ פלואורוסצנטי של השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF). השיטה משלבת תוכנת הסקה בייסיאנית לניתוח משופר של מבנים של ביו-מולקולות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית
- טכניקות מולקולה יחידה
רקע
- מערכת מיקום ננו מהירה מספקת מידע מבני בזמן אמת.
- משלבת smFRET עם ניתוח סטטיסטי לאיתור תחומים גמישים.
- משפרת את שיטות FRET המסורתיות על ידי שימוש בתפריטי הסתברות תלת-ממדיים.
- משלבת נתונים מבניים ממאגרי חלבונים עם מדידות פלואורוסצנציה.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לניתוח מבנים ביו-מולקולריים שקשה לחקור אותם בטכניקות קונבנציונליות.
- לשפר את הרזולוציה של המידע המבני המתקבל מניסויי FRET.
- לספק פרוטוקול מקיף לחוקרים בתחום.
שיטות ששימשו
- הרכבת תא זרימה ומחזיק דגימה לניסויי FRET.
- הכנה ושטיפה של תא הזרימה עם PBS ופתרון נויטראווידין.
- רכישת נתוני smFRET באמצעות מיקרוסקופ TIRF.
- ניתוח יעילות FRET באמצעות תוכנת הסקה בייסיאנית.
תוצאות עיקריות
- רכישה מוצלחת של נתוני smFRET ברזולוציה גבוהה.
- הוכחת יכולת השיטה לאתר תחומים גמישים בביו-מולקולות.
- אימות תוכנת FastNPS לניתוח נתוני FRET.
- ביסוס פרוטוקול שניתן לשכפלו על ידי חוקרים אחרים.
מסקנות
- מערכת המיקום הננו המהירה משפרת משמעותית את ניתוח המבנים הביו-מולקולריים.
- שיטה זו מספקת מסגרת חזקה למחקרים עתידיים בביולוגיה מבנית.
- שילוב של FRET עם ניתוח סטטיסטי מתקדם פותח דרכים חדשות למחקר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to resolve dynamic structural information of transient biomolecular complexes that are inaccessible to conventional structural biology tools. By integrating single-molecule FRET data with Bayesian inference, it provides quantitative three-dimensional probability distributions that capture experimental uncertainty and support mechanistic de-risking in target validation. The approach enhances predictive confidence in early discovery by localizing flexible domains and informing structure-based design where standard techniques fail.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by localizing unknown dye positions within protein complexes through trilateration of smFRET measurements.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by providing posterior distributions that quantify structural uncertainty in flexible domains.
- Operational Value: Allows comparison of five dye models to assess orientational and spatial behavior, improving target confidence in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by defining position priors from smFRET data and structural priors from X-ray crystallography.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through probabilistic data analysis that combines fluorescence measurements with structural databases.
- Operational Value: Enables scalable platform reuse by calculating complete three-dimensional posterior distributions for smFRET networks with numerous dye molecules.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through application to archaeal RNA polymerase open promoter complex, establishing continuity from discovery to preclinical validation.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by capturing dynamic structural information of transient complexes not addressable by existing tools.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by allowing quick comparison of dye models and subsequent MD simulation refinement.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, enabling iterative refinement of structural models consistent with experimental smFRET data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by localizing flexible domains in macromolecules where standard structure biology tools cannot be applied.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative single-molecule fluorescence measurements combined with structural data from protein databases.
- Analytics: Provides statistical outputs including credible volumes and posterior distributions that enable teams to compare conditions and assess model consistency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating structural models against experimental data in biologically relevant systems like open promoter complexes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for analyzing smFRET networks, allowing rapid comparison of dye models and adaptation across target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through three-dimensional probability distributions that indicate experimental uncertainty.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via Bayesian parameter estimation with Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling comparison of dye models to minimize credible volumes while maintaining consistency above 90%.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing structural insights that inform advancement decisions in lead optimization pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy, Bayesian inference, and structural biology data integration.
- Needs instrumentation including TIRF microscope, laser systems, piezo-motor stage, and UV-VIS/fluorescence spectroscopy for dye characterization.
- Demands cross-team standardization in defining position priors, dye models, and FRET pair measurements across multiple laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the five dye models to different biomolecular environments and linker chemistries.
- Includes practical limitations such as the need for high-quality smFRET data, accurate quantum yield and anisotropy measurements, and sufficient sampling for convergence in MCMC analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Single-molecule FRET (smFRET) Measurements with Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy
5:19
Determination of Mean FRET Efficiency
6:45
Determination of Credible Volumes with the Fast Nano-positioning System (Fast-NPS)
10:09
Results: smFRET Fast Nano-positioning System Modeling of Archaeal RNA Polymerase Open Promotor Complex
11:42
Conclusion
