סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לסנתז ננו-חלקיק מגנטי בתוך כלוב חלבון ולאחר מכן לבצע פונקציונליזציה לחלבון כך שיאפשר הצמדה מהירה של הננו-חלקיק המגנטי לתאים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לייצר ננו-חלקיקים מגנטיים המאפשרים סימון מגנטי מהיר ויעיל של תאים, דבר החשוב עבור יישומים כגון MRI או הפרדה מגנטית של תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג מגנטיזציה של תאים תוך שימוש בריכוזים נמוכים של ננו-חלקיקים ובזמני דגירה קצרים, מה שמונע השפעות לוואי פוטנציאליות עקב חשיפה לננו-חלקיקים.

ראשית, יש להסיר חמצן מ-500 milliliters של מים דה-יוניים על ידי הנחת צינור המחובר לגליל גז חנקן לתוך המים ואיטום הכלי בנייר נצמד. לאחר מכן, יש להזרים בועות של גז חנקן למשך כ-60 דקות. יש לחמם אמבט מים המחובר לכלי התגובה בעל המעטפת הכפולה ל-65 degrees Celsius.

לאחר מכן, הוסף 75 milliliters של 50 millimolar HEPES buffer, pH 8.6 לכלי התגובה. אטום את הכלי ובצע דה-אוكسגנציה על ידי הבעבוע של גז חנקן דרך תמיסת הבאפר למשך כ-20 דקות. במקביל, ערבב את תמיסת הבאפר באמצעות מערבל מגנטי.

לאחר הסרת החמצן מתמיסת בופר HEPES, הוצא את צינור החנקן מהבופר, תוך השארתו תלוי מעל התמיסה כדי לשמור על אטמוספירת חנקן. הוסף apoferritin עד להשגת ריכוז סופי של 3 milligrams per milliliter. המשך בערבוב המגנטי, אך הפחת את מהירות הערבוב אם נוצר קצף.

עבור סינתזת מגנטו-פריטין, השתמשו בשתי משאבות מזרקים כדי להזריק בו-זמנית 10.1 milliliters של חומר המוצא של ברזל-קובלט, ו-10.1 milliliters של מימן פחמני (hydrogen peroxide) לתוך תמיסת האפו-פריטין בקצב זרימה של 0.15 milliliters לדקה. המשיכו בשלבי הסינתזה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, העמיסו את הדגימה על עמודה המכילה מטריצה קטיונית באמצעות משאבה פריסטלטית בקצב זרימה של 10 milliliters לדקה.

שטפו את העמודה עם כ-100 מיליליטר של באפר הרצה באמצעות משאבת גרדיאנט בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה. כדי לאלות את החלבון, שטפו את העמודה עם 150 מיליליטר של ריכוזים עולים של נתרן כלורי ובאפר tris בקצב של 10 מיליליטר לדקה. כאשר החלבון נאלוט בריכוז נתרן כלורי של 500 מילימולרי, אספו אותו בפרקציות של 50 מיליליטר באמצעות אסוף פרקציות אוטומטי.

רכז את 150 המיליליטר של magnetoferritin לנפח של כמעט שני מיליליטר באמצעות יחידת סינון צנטריפוגית של 15 מיליליטר, ולאחריה יחידה לנפח של ארבעה מיליליטר. עיין בהוראות היצרן של יחידות הסינון הצנטריפוגיות לקבלת פרוטוקול מפורט של הליך זה. לאחר מכן, העמס את הדגימה המרוכזת על עמודת סינון ג'ל באמצעות לולאת הזרקה.

שטפו את העמודה בעזרת בופר זרימה בקצב של 1.3 milliliters per minute. אספו פרקציות של שש מיליליטר באמצעות אספן פרקציות אוטומטי. מונומרים של חלבון יצאו (elute) אחרונים.

בשלב זה, ניתן לאחסן מגנטו-פריטין מופרך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לשלב הקטיוניזציה. עבור 10 milligrams של מגנטו-פריטין, שקלו 374 milligrams של DMPA והמיסו ב-2.5 milliliters של MES buffer בריכוז 200 millimolar. התאימו את pH של התמיסה לכ-7 באמצעות חומצה כלורית רכזית.

גזים רעילים משתחררים כאשר מתאימים את ה-pH של תמיסת ה-DMPA באמצעות חומצה הידרוכלורית. יש לוודא שטיפול בחומרים אלו נעשה בתוך מ SAMPST. הוסיפו 2.5 milliliters של תמיסת magnetoferritin בריכוז של ארבעה milligrams per milliliter.

הוסיפו מערבל מגנטי וערבבו למשך שעתיים להגעה לשיווי משקל. לאחר התאמת pH של התמיסה ל-5.0, הוסיפו 141 milligrams של אבקת EDC לתמיסת ה-DMPA magnetoferritin. המשיכו לערבב למשך שלוש שעות וחצי.

סננו את התמיסה דרך מסנן מזרקה של 0.22 מיקרון כדי להסיר משקעים ובצעו דיאליזה לחלבון כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. גדלו hMSCs כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. שטפו את התאים שהוצמדו ללוח באמצעות שני מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסות magnetoferritin קטיוןית שעברה עיקור לתאים המפוזרים בצלחת, לפני דגירה למשך פרק הזמן הרצוי. שטוף את התאים ב-PBS, ולאחר מכן קצור אותם על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של Trypsin-EDTA ודגירה ב-37 °C למשך חמש דקות. לאחר הוספת מיליליטר אחד של מצע גידול כדי לנטרל את ה-trypsin EDTA, העבר את התמיסה לפרועת צנטריפוגה של 15 מיליליטר וסבב בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-524 ×g. השלך את הסופרנאט ושחזר את משקע התאים ב-0.5 מיליליטר של בופר הפרדה מגנטית.

בשלב הבא, חברו את המגנט למעמד הרב-קוביה והוסיפו למגנט עמודת הפרדה מגנטית. הניחו מסנן קדם-הפרדה על העמודה. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters של בופר הפרדה מגנטית למסנן קדם-הפרדה, והניחו לו לחלוף דרך המסנן והעמודה כדי לשטוף אותם.

בשלב הבא, מקמו מבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר תחת העמודה והוסיפו 0.5 מיליליטר של תרחיף התאים למאגר הסינון של עמודת ההפרדה המגנטית. כאשר המאגר יתרוקן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של בופר להפרדה מגנטית. כאשר המאגר יתרוקן שוב, הוסיפו 0.5 מיליליטר נוספים של בופר להפרדה מגנטית.

חזרו על השטיפה פעם אחת נוספת, עד לנפח כולל של 1.5 milliliters של magnetic separation buffer. שלב שטיפה זה שוטף החוצה את כל התאים שאינם מגנטיים מהעמודה. הסירו את העמודה מהמגנט והניחו אותה בתוך מבחנה צנטריפוגית נקייה בנפח של 15 milliliters.

לאחר מכן, הסירו את המסנן ממאגר העמודה. הוסיפו 1 milliliter של תמיסת הפרדה מגנטית למאגר, ודחפו אותה באופן מיידי דרך העמודה באמצעות הבוכנה שסופקה על ידי היצרן. פעולה זו סוחבת את התאים הממוגנטים מהעמודה אל מבחנת הצנטריפוגה.

המשיכו בביצוע כימות הברזל כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (Transmission electron microscopy) של דגימות מגנטו-פריטין שנצבעו בצביעה שלילית הראו כי ננו-חלקיקים נוצרו בתוך כלוב החלבון. מדידות פוטנציאל זטא (Zeta potential) מאשרות כי המגנטו-פריטין רכש מטען פני השטח חיובי לאחר הקטיוןזציה.

חשיפה של תאי גזע מזנכימליים אנושיים למגנטופריטין קטיוני למשך דקה אחת הובילה למגניטיזציה של 92% מאוכלוסיית התאים ולהחדרה של 3.6 פיקוגרם של ברזל לתא. הארכת זמן האינקובציה ל-15 דקות הובילה למגניטיזציה של כל אוכלוסיית התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה כיצד לסנתז ננו-חלקיק מגנטי בתוך חלל ה-apoferritin באמצעות הוספה רצופית של חומרי מוצא של מלחים מתכתיים לתמיסת החלבון.

ולבסוף, כיצד לבצע קטיוניזציה כימית של החלבון באמצעות צימוד TMPA. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע סינתזה, טיהור וקטיוניזציה של מגנטו-פריטין תוך שלושה ימים, במידה והתהליך מבוצע כהלכה. במהלך ביצוע פרוטוקול זה, חשוב למנוע זיהום בחמצן ולהקפיד על שמירת הטמפרטורה וה-pH הנכונים לאורך כל סינתזת המגנטו-פריטין.

בהמשך להליך זה, ניתן להכניס למסגרת האפופריטין הקטיונית מטענים אחרים, כגון נקודות קוונטיות או סוכנים טיפוליים, כדי להשיג הובלה יעילה יותר של חומרים אלו לתאים. טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום המניפולציה המגנטית של תאים לחקור סימון מגנטי בתאים המראים ספיגה נמוכה של ננו-חלקיקים, או בתאים הרגישים מאוד לחשיפה ממושכת לננו-חלקיקים או לריכוזים גבוהים של ננו-חלקיקים.