סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לסנתז ננו-חלקיק מגנטי בתוך כלוב חלבון ולאחר מכן לתפקד את החלבון כך שיאפשר חיבור מהיר של הננו-חלקיק המגנטי לתאים. ניתן להשתמש בשיטה זו ליצירת ננו-חלקיקים מגנטיים המאפשרים תיוג מגנטי מהיר ויעיל של תאים, דבר החשוב ליישומים כגון MRI או הפרדת תאים מגנטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג מגנטיזציה של תאים באמצעות ריכוזי ננו-חלקיקים נמוכים וזמני דגירה קצרים, מה שמונע תופעות לוואי אפשריות עקב חשיפה לננו-חלקיקים.

כדי להתחיל, יש לחמצן 500 מיליליטר של מים נטולי יונים על ידי הכנסת צינור המחובר לגליל גז חנקן למים ואיטום הכלי בניילון נצמד. לאחר מכן, בועות גז חנקן למשך כ-60 דקות. מחממים אמבט מים המחובר לכלי התגובה הכפול ל -65 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הוסף 75 מיליליטר של מאגר HEPES של 50 מילי-מולרי, pH 8.6 לתוך כלי התגובה. אטמו את הכלי והדחו את החמצן על ידי בעבוע גז חנקן דרך תמיסת החיץ למשך כ-20 דקות. במקביל, מערבבים את תמיסת החיץ בעזרת מערבל מגנטי.

לאחר ביטול החמצן של תמיסת המאגר HEPES, הסר את צינור החנקן מהמאגר, והשאיר אותו תלוי מעל התמיסה כדי לשמור על אווירת חנקן. הוסף אפופריטין כדי להשיג ריכוז סופי של 3 מיליגרם למיליליטר. המשיכו בערבוב המגנטי, אך הפחיתו את מהירות הערבוב אם מתרחש קצף.

לצורך סינתזת מגנטופריטין, השתמש בשתי משאבות מזרק כדי להזריק בו זמנית 10.1 מיליליטר של מבשר הברזל-קובלט, ו -10.1 מיליליטר של מי החמצן לתמיסת האפופריטין בקצב זרימה של 0.15 מיליליטר לדקה. המשך בשלבי הסינתזה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, טען את הדגימה על עמודה המכילה מטריצה קטיונית באמצעות משאבה פריסטלטית בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה.

שוטפים את העמוד בכ -100 מיליליטר חיץ רץ באמצעות משאבת שיפוע בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה. כדי לנטרל את החלבון, שטפו את העמודה עם 150 מיליליטר של ריכוזים הולכים וגדלים של נתרן כלורי וחצץ טריס ב-10 מיליליטר לדקה. כאשר החלבון נפלט בריכוז נתרן כלורי של 500 מילימולר, אסוף אותו בשברים של 50 מיליליטר באמצעות אספן שברים אוטומטי.

רכז את 150 מיליליטר המגנטופריטין לנפח של כשני מיליליטר באמצעות יחידת פילטר צנטריפוגלית של 15 מיליליטר ואחריה יחידת נפח של ארבעה מיליליטר. עיין בהוראות היצרן של יחידות המסנן הצנטריפוגליות לפרוטוקול מפורט של הליך זה. לאחר מכן, טען את הדגימה המרוכזת על עמוד סינון ג'ל באמצעות לולאת הזרקה.

שוטפים את העמוד עם מאגר רץ בקצב זרימה של 1.3 מיליליטר לדקה. אסוף שישה שברים של מיליליטר באמצעות אספן שברים אוטומטי. מונומרים חלבונים מסיימים אחרונים.

בשלב זה, ניתן לאחסן מגנטופריטין מטוהר בארבע מעלות צלזיוס עד לקטיונים. עבור 10 מיליגרם של מגנטופריטין, שקלו 374 מיליגרם של DMPA והתמוססו ב-2.5 מיליליטר של מאגר MES של 200 מילי-מולרי. התאם את ה-pH של התמיסה לכ-7 באמצעות חומצה הידרוכלורית מרוכזת.

אדים רעילים משתחררים כאשר אתה מכוון את ה-pH של תמיסת DMPA עם חומצה הידרוכלורית. הקפד לטפל בחומרים אלה במכסה אדים. הוסף 2.5 מיליליטר תמיסת מגנטופריטין בארבעה מיליגרם למיליליטר.

מוסיפים מערבל מגנטי ומערבבים שעתיים לאיזון. לאחר התאמת התמיסה ל-pH 5.0, הוסף 141 מיליגרם של אבקת EDC לתמיסת המגנטופריטין DMPA. ממשיכים לערבב שלוש שעות וחצי.

סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון כדי להסיר משקעים ודיאליזה של החלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. hMSCs של תרבות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שוטפים את התאים המצופים בשני מיליליטר PBS בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת המגנטופריטין המעוקר לתאים המצופים לפני הדגירה לפרק הזמן הרצוי. שטפו את התאים עם PBS, ולאחר מכן קצרו אותם על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של טריפסין-EDTA ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הוספת מיליליטר אחד של מדיום תרבית כדי לנטרל את הטריפסין EDTA, העבירו את התמיסה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-524 פעמים G.השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-0.5 מיליליטר של מאגר הפרדה מגנטי.

לאחר מכן, חבר את המגנט למעמד הרב-מעמד והוסף עמוד הפרדה מגנטי למגנט. הניחו פילטר לפני הפרדה על העמוד. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של חוצץ הפרדה מגנטי למסנן טרום-ההפרדה, ותן לו לעבור גם דרך המסנן וגם דרך העמודה כדי לשטוף אותם.

לאחר מכן, הניחו צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר מתחת לעמוד והוסיפו 0.5 מיליליטר ממתלה התא למאגר המסנן של עמוד ההפרדה המגנטי. כאשר המאגר ריק, הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר הפרדה מגנטי. כאשר המאגר מתרוקן שוב, הוסף עוד 0.5 מיליליטר של מאגר הפרדה מגנטי.

חזור על הכביסה פעם נוספת, לקבלת נפח כולל של מאגר הפרדה מגנטי של 1.5 מיליליטר. שלב כביסה זה מוציא את כל התאים הלא ממוגנטים מהעמודה. הסר את העמוד מהמגנט והנח אותו בצינור צנטריפוגה טרי של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, הסר את המסנן ממאגר העמודים. הוסף 1 מיליליטר ממאגר ההפרדה המגנטי למאגר, ודחף מיד דרך העמודה באמצעות הבוכנה שסופקה על ידי היצרן. זה מוציא את התאים הממוגנטים מהעמוד לתוך צינור הצנטריפוגה.

המשך לבצע כימות ברזל כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של דגימות מגנטופריטין מוכתמות שליליות הראו כי ננו-חלקיקים נוצרו בתוך כלוב החלבון. מדידות פוטנציאל זטה מאשרות כי מגנטופריטין השיג מטען משטח חיובי לאחר הקטיונים.

חשיפת תאי גזע מזנכימליים אנושיים למגנטופריטין קטיוני למשך דקה אחת הביאה למגנטיזציה של 92% מאוכלוסיית התאים ולאספקת 3.6 פיקוגרם ברזל לתא. הגדלת זמן הדגירה ל-15 דקות הביאה למגנטיזציה של כל אוכלוסיית התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין כיצד לסנתז ננו-חלקיק מגנטי בתוך חלל האפופריטין על ידי הוספה רציפה של מבשרי מלח מתכת לתמיסת החלבון.

ואז, כיצד לבצע קטיון כימי של החלבון באמצעות צימוד TMPA. לאחר השליטה, ניתן לבצע סינתזה, טיהור וקטיונים של מגנטופריטין תוך שלושה ימים אם זה מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להימנע מזיהום חמצן ולשמור על הטמפרטורה וה-pH הנכונים לאורך סינתזת המגנטופריטין.

בהמשך להליך זה, ניתן לעטוף מטענים אחרים כמו נקודות קוונטיות, או חומרים טיפוליים בכלוב האפופריטין הקטיוני כדי להשיג אספקה יעילה יותר של חומרים אלה לתאים. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום המניפולציה של תאים מגנטיים לחקור תיוג מגנטי בתאים המציגים קליטה נמוכה של ננו-חלקיקים או רגישים מאוד לחשיפה ממושכת של ננו-חלקיקים או ריכוזי ננו-חלקיקים מוגברים.