Name: בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: למדו לפתח אימונו-אסיי מבוסס ננו-חלקיקי זהב עם אנליזה ספקטרוסקופית UV-Vis וראמאן. השיטה משלבת שיטות אופטיות משלימות לאימות תוצאות ומחקר מולקולרי מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס קטליזטור מחקר מאוניברסיטת יוטה סטייט. המחברים רוצים להודות לאנליז דייקס, קמרון זבריסקי ודונלד וולי על תרומתם.

1. הכנת Buffers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט שנאגר מלוח (PBS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 מ&quot;ל של 10x PBS עם 450 מ&quot;ל מים כיתה HPLC לבצע ריכוז 1x PBS. סינון סטרילי הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון חנות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת טריס בופר + Tween 20 (TBST) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 מ&quot;ל של 10x טריס בופר (TBS) עם 450 מ&quot;ל מים כיתה HPLC לבצע ריכוז 1x. הוסף 250 μl של Tween-20 עבור 0.05% (v / v) של Tween-20. סינון סטרילי הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת האדם סרום אלבומין (HSA) פתרון חסימת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 0.45 גרם של HSA לתוך 15 מ&quot;ל של PBS 1x מסונן סטרילי לבצע 3% w / v פתרון HSA. הפתרון וורטקס עד HSA נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות פתרון HSA על 4 מעלות צלזיוס. הערה: שור סרום אלבומין(BSA) יכול לשמש גם כפתרון חסימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת נוגדן PEGylated (PEG-Ab) פתרון הערה: פתרון הנוגדן חייב להיות חופשי מחלבונים מובילים או ייצוב כגון BSA, אשר יפריעו עם תגובות נטייה ידי מתחרה על n-hydroxysulfosuccinimide (NHS) אתרי קישור. אם הנוגדן מגיע פתרון טריס או חיץ גליצין, הוא חייב לעבור חילופי חיץ כדי למנוע אמינים או מלחי אמוניום מלהפריע תגובת נטיית NHS. אם הנוגדן הוא בצורה lyophilized, זה יכול להיות resuspended פי המלצת היצרן בריכוז של 1-10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור נוגדנים חיץ טריס או גליצין, לבצע חילופי חיץ סודיום ביקרבונט 100 מ&quot;מ באמצעות טור desalting. השתמש חיץ 100 מ&quot;מ להעלות את ה- pH ל 8.5 כ לזרז את התגובה נטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סודה אורתו-pyridyl דיסולפיד-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) עם 100 מ&quot;מ שלביקרבונט הגנות לנפח של 1 מ&quot;ל בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​או יותר. הערה: OPSS-PEG-NHS צריכה להיעשות טרי בשימוש בתוך כ -20 דקות. קבוצת NHS על יש OPSS-PEG-NHS זמן מחצית חיים של כ 20 דקות בתמיסה מימית ב- pH 8.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף OPSS-PEG-NHS לפתרון נוגדן בבית 2: 1 יחס (PEG: נוגדן) יחס נטיה לשמש דגימות הבדיקה. בתוך צינור microcentrifuge נפרד, להוסיף OPSS-PEG-NHS לפתרון אנטיגן בבית 2: יחס נטיה 1 לשמש עבור שליטה. ההערה: 2: יחס 1 בהנחה יעילה נטיית 50%. המטרה היא לתייג כל נוגדן עם שרשרת PEG אחד. בשלב זה, על-תיוג עדיף תחת התיוג. השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את הכמויות המתאימות של פתרון OPSS-PEG-NHS נוגדנים: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> כאשר V הוא נפח, C הוא ריכוז לידי ביטוי מולקולות אוtibodies לכל מיליליטר. תחתי PEG וא.ב. הם OPSS-PEG-NHS נוגדנים, בהתאמה. ההיקף הסופי צריך להיות כ 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת פתרון PEG-Ab ב 4 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות או למשך הלילה. פתרון חנות בעבודת aliquots של כ 25 μl ב -20 ° C כדי להגביל את מחזורי הפשרת ההקפאה הקפד להשתמש צינורות מחייב נמוכים. </li></ol></li></ol> 2. כן UV-Vis / ראמאן בדיקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון AuNP חשוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון 2 מיליליטר של AuNPs עם בריכוז של כ 1 x 10 11 חלקיקים לכל מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם AuNPs צריך להיות מרוכז, למלא צינורות צנטריפוגות מחייב נמוכים עם 2,000 μl של מניית AuNP צנטריפוגות ב 5000 XG במשך 20 דקות או עד supernatant ברור. הסר את supernatant ידי pipetting, נזהר שלא להפריע גלולת AuNP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את פתרונות AuNP הנותרים לתוך צינור אחד ולהעריך את Concentration על ידי קבלת מדידת UV-Vis והשוואת ערכים לריכוזים המכונים זה הוא קשר ליניארי. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את יחס תיוג כתב ראמאן המתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון עבודה של כתב ראמאן מומס מתנול. ריכוז זה יהיה תלוי הכתב בשימוש. בעבודה זו, להכין יודיד 3,3&#39;-diethylthiatricarbocyanine (DTTC) בשעה פתרון עבודה של 200 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהנחת נפח סופי של 100 μl לכל היטב, להוסיף מספיק של פתרון כתב עבודה היטב כל בשורה הראשונה של צלחת 96-היטב כך כתב ראמאן ינוע בריכוזים מ -0.2 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר. להוסיף מספיק מים HPLC כיתה היטב כל כך שהעוצמה היא 80 μl. הוסף 20 μl של AuNP היטב כל מה שהופך נפח סופי של 100 μl עבור כל טוב. דוגמא מסופקת בלוח 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את UV-Vis הספקטרום מ -400 ל700 ננומטר באמצעות UV-Vis קריאת-צלחת ספקטרופוטומטר. הריכוז המתאים הוא הריכוז הגבוה ביותר עם פסגות שהוגדרו עבור ספקטרום UV-Vis. חזור על שלב 2.2.2 להגדיל ריכוזים עד יחס הריכוז הגבוה ביותר של כתבי ראמאן כדי AuNPs נמצא. הערה: הצבע ואת הצורה AuNP, גודל, והיצרן להשפיע על הריכוז המתאים. לכן, על פי הצעדים הרשומים חייבים להיות מוערכים שינו תלוי הרכיבים המשמשים. פרוטוקול זה מעורב השימוש לצבוע בעלי מטען חשמלי חיובי. ככזה, מחייב בין AuNP והכתב היה לשפר את המצב באמצעות AuNPs טעונים שלילית. הדבר נעשה באמצעות AuNPs כתרים ציטראט. עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כריכת כתב רמן PEG-Ab כדי AuNP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שני 1.5 מיליליטר אצוות של AuNP וכתב ראמאן בריכוז נקבע בעבר, המאפשר כתב ראמאן להיקשר AuNPs למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הנוגדן PEGylated (PEG-Ab) אצווה אחת של הפתרון הכתב AuNP ראמאן ליצור 200: 1 יחס של נוגדנים לחלקיקים. פתרון זה יהיה עבור דגימות הבדיקה. בתוך צינור microcentrifuge נפרד, מוסיפים את אנטיגן PEGylated אל אצווה השני של פתרון הכתב AuNP ראמאן בבית 200: 1 של נוגדן לחלקיקים כדי לשמש מלאה. דגירה הפתרונות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: היחס בין נוגדנים לחלקיקים יהיה ספציפי AuNPs לצבוע משומשים צריך להיות מותאם עבור כל מקרה ומקרה. המטרה פה היא לקבל את היחס הגבוה ביותר של נוגדנים עבור בדיקות AuNP להיקשר תוך מניעת אגרגציה של החלקיקים. השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את הכמויות המתאימות להוסיף יחד: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> כאשר V הוא נפח, C הוא ריכוז לידי ביטוי חלקיקים או נוגדנים לכל מיליליטר. הסנפירנפח אל צריך להיות כ 1.5 מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הנותרים אתרים על פני השטח AuNP עם MPEG-SH. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן MPEG-SH ידי המסת תיאול פוליאתילן גליקול methoxy המוצקה לריכוז 200 מיקרומטר באמצעות מים. הפתרון וורטקס עד-SH MPEG נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף MPEG-SH בכל 40,000: 1 יחס לפתרון AuNP-PEG-Ab עשה צעד 2.3. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על מנת להבטיח את האתרים הנותרים על ננו-חלקיקים מזהב חסומות. השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את הכמויות המתאימות להוסיף יחד: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> כאשר V הוא נפח, C הוא ריכוז לידי ביטוי חלקיקים או נוגדנים לכל מיליליטר. ההיקף הסופי צריך להיות כ 1.5 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור בדיקות ראמאן פונקציונליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקיקים צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 20 דקות ב ג לאגד נמוךצינורות entrifuge או עד supernatant ברור. הסר את supernatant ידי pipetting נזהר שלא להפריע את AuNPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חלקיקים עם 1 מ&quot;ל של תמיסת 1x PBS שנעשה בעבר. להעריך את ריכוז AuNP ידי לקיחת מדידת UV-Vis של נפח קטן של הפתרון (3 μl) ולהשוות את התוצאות על מדידות של ריכוז AuNP ידוע. כוון את עוצמת הקול כך הפתרון הסופי הוא לפחות 1 x 10 11 חלקיקים לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהוא משמש functionalizing של הצלחת immunoassay. השתמש פתרונות בתוך שבוע. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> כרכים להוסיף של כל רכיב (מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> לריכוז סופי DTTC (מ&quot;מ) </td><td> הפתרון עובד DTTC (200 מ&quot;מ) </td><td> AuNP </td><td> מַיִם </td></tr><tr><td> 0.2 </tד&gt; <td> 0.1 </td><td> 20 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td> 0.6 </td><td> 0.3 </td><td> 20 </td><td> 79.7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 20 </td><td> 79.5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1.0 </td><td> 20 </td><td> 79 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2.5 </td><td> 20 </td><td> 77.5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 3.5 </td><td> 20 </td><td> 76.5 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 5.0 </td><td> 20 </td><td> 75 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. דוגמה דילול DTTC. דילולים שונים של DTTC והיקפי כלולות של המניה DTTC, פתרון ננו-חלקיקים מזהב, ומים. 3. פלייט Immunoassay כן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאגד אנטיגן הרצוי לצלחת immunoassay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מספיק אנטיגן מדולל (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כדי למלא את בארות קלקר. הפתרון וורטקס,ומייד להוסיף פתרון בארות הצלחת. אפשר האנטיגן להיקשר הצלחות במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אנטיגנים מאוגדים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון אנטיגן העודף ידי השלכת פתרון לתוך מיכל אטום לסילוק ולהכות על הצלחת כנגד שולחן נייר מגבת מכוסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף TBST אל הבארות לשטוף את המשטח ואז להסיר בכביסה באותו אופן כאמור. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק נותר אתרי קישור על הצלחת כדי למנוע הלא ספציפי מחייב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 70 μl של פתרון חסימת HSA היטב כל הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ולשטוף את הצלחת באמצעות אותו נוהל כמו שצוין בשלב 3.2. מכסה את הצלחת ויבשה ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Functionalize צלחת immunoassay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 70 μl של tהוא לחקור חלקיקים מוכנים בסעיף 2 לעמודה הראשונה של צלחת 96-היטב לדלל עמודות עוקבות באמצעות 1: דילול סדרה 2. אפשר הצלחת כדי לדגור במשך לפחות שעה 1. דוגמה כיצד להכין את צלחת immunoassay ניתנת באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת עם TBST חמש פעמים כמפורטות צעדים 3.2, מוודא להיפטר AuNPs כראוי. לאחר שטיפה של דבר, להוסיף 70 μl של 1x PBS היטב כל ומכסים חותם צלחת. הערה: דגימות הבקרה צריכות להיות ברורות. אם הלא ספציפי מחייב התרחש, דגימות השליטה תהיינה בצבע דומה כמו דגימות הבדיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגישות assay בדיקה על-ידי UV-Vis ו ספקטרוסקופיית ראמאן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל טוב, למדוד את UV-Vis הספקטרום החל 400 כדי 700 ננומטר באמצעות UV-Vis קריאת-צלחת ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ ראמאן הפוכה, למקד את המטרה על פני השטח של הבאר כי יש חלליות AuNP. אובטיין ספקטרום ראמאן של הבאר. אסוף ספקטרום החל 1,800 -1 ס&quot;מ עד 400 ס&quot;מ -1. חזור על שלב זה עבור כל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ספקטרלי מתאימה, לבצע תיקון בסיס פולינום -11 על מנת ספקטרום רמן פולינום כדי 3 rd עבור ספקטרום UV-Vis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ספקטרלי מתאימה, לנרמל את רמן UV-Vis ספקטרום. הגדר את הערך המקסימאלי ל 1 ו לדרג את כל הערכים האחרים בהתאם. כדי לנרמל את ספקטרום ראמאן, בחר לשיא קלקר ייחודי ולהגדיר אותו שווה ל 1 ו לדרג את כל הערכים האחרים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ספקטרלי מתאימה, לבצע אינטגרצית שיא עבור כל ספקטרום. עבור ספקטרום ראמאן, השיא המייצג את כתב ראמאן חייב להיות נעדר באזור של פסגות קלקר. כדי לבצע אינטגרצית שיא, לציין את הגבולות הנפרדים עבור השיא הרצוי ולהקליט את אזור השיא הרצוי עבור כל הדגימות כולל הבקרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Plהכבושים על אזור השיא הממוצע של ריבית כפונקציה של היומן של ריכוז AuNP עם סרגלי שגיאות עבור כל נקודה המציינת סטיית ההתקן הקשורה אליו. התאם נקודות כיול אלה עקומים לוגיסטיים 4-פרמטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הערך הממוצע של ריק על ידי ממוצעים באזור השיא של ריבית מדגם ריק. קבע את סטיית התקן של התחומים הללו, זה הוא סטיית התקן של ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאותה השיא ניתח בשלב הקודם, למצוא את סטיית התקן של אזור השיא של הריכוז הנמוך ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הגבול של הגבול ריק והתחתון של זיהוי כמפורט בסעיף נציג התוצאות. השתמש בערכים אלה עם עקומות כיול 4PL לקבוע את LLOD מבחינת ריכוז AuNP. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsraelsen%2C+ND+%22Sci.+World+J%22">Sci. World J</a>. , e124582(2015).</li>
<li>Wang, Y., Schlücker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+SERS+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of SERS labels.</a> Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Yan, B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+tags%3A+novel+optical+nanoprobes+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis.</a> Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Immunoassay+Handbook%3A+Theory+and+applications+of+ligand+binding%2C+ELISA+and+related+techniques%22">The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques</a>. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).</li>
<li>Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+KL+%22Assay+Guid.+Man%22">Assay Guid. Man</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	">
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ELISA+development+guide%22">ELISA development guide</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf">https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf</a> (2016).</li>
<li>Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+Raman-labeled+nanoparticles+for+a+dual-modality%2C+light+scattering+immunoassay+on+a+polystyrene+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate.</a> J. Biol. Eng. 10, (2016).</li>
<li>Menges, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenges%2C+F+%22Spekwin32+-+optical+spectroscopy+software.+Version+1.72.1%22">Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="http://www.effemm2.de/spekwin/">http://www.effemm2.de/spekwin/</a> (2016).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Antibody+Binding+on+Protein+Microarrays+using+Microarray+Nonlinear+Calibration%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration.</a> BioTechniques. 54, 257-264 (2013).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EP17-A2%3A+Evaluation+of+Detection+Capability+for+Clinical+Laboratory+Measurement+Procedures%3B+Approved+Guideline%22">EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline</a>. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. 
 <a target="_blank" href="http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html">http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html</a> (2012).</li>
<li>Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+assessing+the+reliability+of+molecular+diagnostics+based+on+multiplexed+SERS-coded+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles.</a> Plos One. 8 (4), e62084(2013).</li>
<li>Sinha, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+binding+potential+of+cell-surface+receptors+in+fresh+excised+specimens+via+dual-probe+modeling+of+SERS+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles.</a> Sci. Rep. 5, 8582(2015).</li>
<li>Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+using+targeted+surface-enhanced+Raman+scattering+nanoparticles+and+magnetic+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment.</a> J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).</li>
<li>Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated+dimers+of+silver+nanospheres+as+surface-enhanced+Raman+scattering+tags+for+imaging+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).</li>
<li>McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+surface-enhanced+Raman+tags%3A+individual+nanorods+for+measurements+from+the+visible+to+the+infrared+%28514-1064+nm%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm).</a> Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בפרוטוקול המפורט, ישנם מספר נקודות קריטיות לכתובת. נושא אחד הוא הבחירה של כתב רמן ננו-חלקיקים מזהב. אף על פי הפרוטוקול נכתב כדי להיות מותאם לשימוש אישי, כתב ראמאן DTTC שמש כדוגמא. DTTC הוא כתב מטען חשמלי חיובי ונקשר טיעונים שליליים משטחים כגון AuNPs כתרי ציטראט. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור כתבים טעונים שלילי באמצעות חלקיקי זהב עם מטען משטח חיובי. לדוגמה, polyethyleneimine (PEI) כתרים AuNPs לספק מטען משטח חיובי וטוב יותר מחייב עם כתבים-טעונים שלילית. <p class="jove_conten...

immunoassays כריך האופייני בעקיפין לזהות הנוכחות של אנטיגן באמצעות שני נוגדנים. הנוגדן ללכוד מאוגד משטח יציב ויוצר קומפלקס נוגדן-אנטיגן כשהוא קרוב אנטיגן המתאים. נוגדן זיהוי מכן הוא הציג נקשר אנטיגן. לאחר הכביסה, הנוגדן / אנטיגן / שרידי ההרכב נוגדן והוא זוהה על ידי נוגדן זיהוי שכותרתו כפי שמודגם באיור 1 א. זיהוי טיפוסי נעשה על ידי גלאי פלורסנט או colorimetric, הגבלת ריבוב עד 10 analytes בשל פסגות רפאים רחבות 2,3. לעומת זאת, מערכות מבוססות ראמאן יש הרבה פסגות פליטת צרה וכתוצאה מכך יכול ריבוב משופר עם מקורות בטענת זיהוי סימולטני של עד 100 analytes 2,3. מקורות ספרות רבים זמינים אשר מכסים היבטים חשובים הקשורים Immunoassays 4 - 6 כגון צעד-אחר-צעדפרטים ליצירת ערכות ELISA אישית. למרבה הצער, פרוטוקולים אלה הם לגילוי פלורסנט או colorimetric, הגבלת יכולת ריבוב של immunoassays אישית. כדי לתת מענה לצורך זה, אנו מציגים נוהל מפורט לפברק את immunoassay UV-Vis / ראמאן שפורסמו בעבר 7 עבור immunoassay ישירה כפי שמודגם באיור 1B. פרוטוקול זה כולל ייצור של בדיקות מבוססות ננו-חלקיק זהב פונקציונלי, באיור 2. ההליך לעשות בדיקות ראמאן / UV-Vis מתחיל באמצעות קשירה לכתבי ראמאן אל פני השטח של ננו-חלקיקי זהב (AuNPs). AuNPs הם פונקציונלי אז עם נוגדנים הקשורים פוליאתילן גליקול (PEG). אתרי קישור היא נשאר על AuNPs חסומים באמצעות קשירת תיאול פוליאתילן גליקול methoxy (MPEG-SH) כדי AuNPs למנוע עוקב חייב הלא ספציפי במהלך ניתוח. בדיקות AuNP המוכנות נבדקות באמצעות קשירה אנטיגניםמקובע בארות צלחת קלקר כפי שמודגם באיור 1B. לאחר שטיפת הצלחת, חלליות AuNP מזוהות באמצעות ספקטרוסקופיית UV-Vis בעוד כתבי ראמאן הקשורים מזוהים עם ספקטרוסקופיית ראמאן. שילוב נתונים ספקטרליים UV-Vis ראמאן מספק שתי שיטות של ניתוחים, שיפור היכולות של immunoassay זה.

<table><tbody><tr><td>ננו-חלקיק זהב 60 ננומטר</td><td>טד פלה, בע"</td>מ<td>15708-6</td><td>אלו הם ננו-חלקיקי זהב מצופים ציטראט. אנא ראה דיון על הקשר בין כתב ראמאן למטען פני השטח של AuNP וחשיבותו לבחירה נכונה של כתב AuNP ו/או ראמאן.</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Sa Salt (10x) pH 7.5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון עליונה לבקבוקים</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (פוליסורבט 20)</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>משמש כחומר מתחלב לשלבי כביסה.</td></tr><tr><td>תרכיז תמיסת מלח חומצה פוספט 10x, pH 7.4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>חלבון LoBind שפופרת 2.0&nbsp; </td><td>צינורות Eppendorf</td><td>מ</td>"ל 22431102 <td>צינורות LoBind מונעים קשירה של חלבונים ו-AuNPs למשטחי הצינורות.</td></tr><tr><td>שפופרת חלבון LoBind 0.5&nbsp; </td><td>צינורות Eppendorf</td><td>מ</td>"ל 22431064 <td>צינורות LoBind מונעים קשירה של חלבונים ו-AuNPs למשטחי הצינורות.</td></tr><tr><td>התקני Microplate UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>משמש לאיטום ואחסון צלחות פונקציונליות.</td></tr><tr><td>צלחת בדיקה, עם מכסה אידוי נמוך, 96 באר תחתית שטוחה</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>HPLC מים בדרגת</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>כתב Raman</td></tr><tr><td>mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 גרם</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1G</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1&nbsp; גרם</td><td>לייסן ביו, בע"מ</td><td>ל-OPSS-PEG-SVA-5000-1G</td><td>OPSS-PEG-SVA יש קצה NHS.</td></tr><tr><td>Mouse IgG, Whole Molecule Control</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>אנטיגן</td></tr><tr><td>עז אנטי-עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג חוצה Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31164</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>תמיסת חסימת אלבומין בסרום אנושי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1887-1G</td><td>ניתן להשתמש באלבומין בסרום בקר במקום.</td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td>פישר Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis ספקטרופוטומטר</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>עמודי התפלה</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>נבנה בבית 785&nbsp; יחידת מיקרוסקופ רמאן הפוכה ננומטר</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מיקרוסקופ רמאן הפוך הוא הטוב ביותר למיקוד נכון על פני לוחית הבאר. אחרת ייעשה שימוש בהגדלה נמוכה מאוד עקב גובה צלחת 96 הבארות. נעשה שימוש במערכת שנבנתה בתוך הבית מכיוון שהיא הייתה זולה יותר מקנייה מספק. עם זאת, ניתן להשתמש בכל מערכת מיקרוסקופ ראמאן הפוכה הזמינה מסחרית.</td></tr></tbody></table>

בודה uv-vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת immunoassay

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Immunoassays המשמשים לאיתור חלבונים המבוססת על נוכחות של נוגדנים הקשורים. בשל השימוש הנרחב שלהם במחקר במסגרות קליניות, תשתית גדולה של מכשירי immunoassay וחומרים ניתן למצוא. לדוגמא, 96 ו 384 גם צלחות קלקר זמינות מסחרית ויש תכנון סטנדרטי כדי להכיל מכונות ספקטרוסקופיה אולטרה סגולות-גלוי (UV-Vis) מיצרנים שונים. בנוסף, מגוון רחב של נוגדנים, תגי זיהוי, וסוכני חסימת עיצובי immunoassay אישית כגון מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA) זמין. למרות התשתית הקיימת, ערכות ELISA סטנדרטיים אינם לענות על כל הצרכים המחקר, המחייב פיתוח immunoassay אישית, אשר יכול להיות יקר זמן רב. לדוגמא, ערכות ELISA יש ריבוב נמוך (זיהוי של יותר אנליטי אחד בכל פעם) יכול כפי שהם תלויים בדרך כלל קרינה או colשיטות orimetric לגילוי. מדד-צבע וניתוחים פלורסנט מבוססת יש יכולות מוגבלות ריבוב בשל פסגות רפאים רחבות. לעומת זאת, ראמאן בשיטות מבוסס ספקטרוסקופיה יש יכולת הרבה יותר עבור ריבוב בשל פסגות פליטה צרות. יתרון נוסף של ספקטרוסקופיית ראמאן הוא שכתבי ראמאן לחוות photobleaching פחות משמעותי מאשר תגי פלורסנט 1. למרות היתרונות שכתבי ראמאן יש מעל תגי פלורסנט colorimetric, פרוטוקולים לפברק immunoassays המבוסס ראמאן מוגבל. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול להכין בדיקות פונקציונליות לשימוש בשילוב עם לוחות קלקר לגילוי ישיר של analytes ידי ניתוח UV-Vis ו ספקטרוסקופיית ראמאן. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לקחת עשה זאת בעצמך גישה לגילוי רב-אנליטי בעתיד תוך ניצול תשתית שנקבעה מראש.

במחקר זה, 60 חלקיקי זהב ננומטר שימשו ספקטרוסקופיה UV-Vis. UV-Vis ספקטרום קליטה מן 400 כדי 700 ננומטר נאספו אזורי השיא עבור כל ריכוז AuNP נקבע באמצעות תוכנת ניתוח ספקטרלי קוד פתוח 8. לפני לשיא אינטגרציה, ספקטרה שנאספה עברה תיקון בסיס באמצעות התאמה פולינום שלוש נקודות. באזורי שיא שמשו כדי ליצור עקומת כיול לוגריתמים כפי שמודגם באיור 4. יצוין כי איורים 4 ו -5 משולב עקומות כיול לוגריתמים. השימוש עקום כיול שאינו ליניארי יכול ...

בדיקות אופטיות מבוססות ננו-חלקיקים תוכננו ככלי לזיהוי אנטיגנים באמצעות ספקטרוסקופיה של Raman ו-UV-Vis. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת בדיקות כאלה לבדיקה אימונולוגית של ספקטרוסקופיה UV-Vis/Raman באופן שישלב יכולות ריבוב עתידיות.

בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים את הפיתוח של בדיקה אימונולוגית (immunoassay) מותאמת אישית המבוססת על ננו-חלקיקי זהב, המסוגלת לניתוח באמצעות ספקטרוסקופיה של UV-Visible וספקטרוסקופיית רמן (Raman Spectroscopy). השימוש בשתי שיטות אופטיות מספק תיקוף פנימי של הבדיקה ומגביר את הגמישות שלה. שיטה זו עונה על שאלות מפתח הנוגעות לפיתוח של בדיקה אימונולוגית המבוססת על ננו-חלקיקי זהב.ומסביר כיצד פונקציונליזציה של הננו-חלקיק המשמשת במסה זו תשפיע על בליעה אופטית ופיזור אור. פרוטוקול זה הוא ייחודי מכיוון שהוא משלב חומרים הנמצאים במעבדות מחקר טיפוסיות כדי לייצר פלטפורמה לבדיקה אימונולוגית שניתן להתאימה לצרכי מחקר אישיים. הבדיקה האימונולוגית מבוססת על ספקטרוסקופיית UV-Vis וספקטרוסקופיית Raman.שימוש בספקטרוסקופיית רמן עדיף על פני שיטות פלואורסצנטיות או קולורימטריות, כיוון שהיא בעלת פס רחב יותר המאפשר זיהוי של מספר סמנים ביולוגיים בו-זמנית. ראשית, יש להמיס את חומר הקישור הבי-פונקציונלי או את ה-pyridyl disulfide PEG-NHS ב-100 mL של נתרן ביקרבונט. קצה ה-ortho pyridyl נקשר לפני השטח של ננו-חלקיקי הזהב, וקצה ה-NHS יגיב עם האמין הראשוני על פני השטח של החלבון לאחר הפעלתו.יש להכין את תמיסת הקשר הצלבב (cross-linking) כ-20 דקות לפני השימוש. לאחר מכן, יש להוסיף את חומר הקשר הצלבב הבי-פונקציונלי לתמיסת הנוגדן ביחס קישור של 2 ל-1. ודאו שתמיסת הנוגדן נקייה מחלבוני נשא שעלולים להפריע לתגובה.במבחנה נפרדת של מיקרוצנטריפוגה, הוסיפו את המקשר (cross-linker) הבי-פונקציונלי לתמיסת האנטיגן באותו יחס שייעשה עבור הבקרה. יחס של 2 ל-1 מניח יעילות קשירה (conjugation efficiency) של 50%. המטרה היא לסמן כל נוגדן בשרשרת peg בודדת.בשלב זה, סימון יתר עדיף על פני סימון חסר. לבסוף, דגרו את תמיסת הנוגדן הפגילציה (pegylated antibody) בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות. אחסנו מנות של 25 µL מהתמיסה באגוברות בעלות קישור נמוך (low binding tubes) בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס כדי להגביל את מחזורי ההקפאה וההפשרה.השתמשו בכל מנה (aliquot) לפי הצורך. כדי להכין את גשש רמן (Raman probes), הכינו תחילה שתי מנות של 1.5 mL של ננו-חלקיקי זהב על גבי הדיווח רמן (Raman reporter) בריכוזים שנקבעו כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. פעולה זו מבוצעת על ידי שילוב של תמיסות הדיווח רמן וננו-חלקיקי הזהב, תוך מתן זמן קישור של שלושים דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת הנוגדנים הפגylated לאחת מתמיסות ננו-חלקיקי הזהב הקשורי למדווח כדי ליצור יחס של 200 ל-1 של נוגדנים לחלקיקים. תמיסה זו תשמש עבור דגימות הבדיקה. במבחנה נפרדת למיקרוצנטריפוגה, הוסיפו אנטיגן פגylated לתמיסת ננו-חלקיקי הזהב השנייה הקשורה למדווח ביחס של 200 ל-1 של אנטיגן לחלקיקים, לשימוש כבקרה.דגרו את שני התמיסות למשך שלושים דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חסמו את האתרים שנותרו על פני הננו-חלקיק. כדי לבצע זאת, המיסו תחילה methoxypolyethylene glycol thiol מוצק לריכוז של 200 µM באמצעות HPLC water.ערבבו את התמיסה במיקסר (Vortex) עד להמסה מלאה של הטיול. לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת הטיול ביחס של 40,000 ל-1 לתמיסות הנוגדנים מסוג peg הקשורים לננו-חלקיקים, והדרימו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות כדי להבטיח שכל האתרים הנותרים על ננו-חלקיק הזהב נחסמו. לאחר מכן, השגיחו את גשש ה-Raman הפונקציונליים על ידי סבוב של החלקיקים במבחנות צנטריפוגה בעלות קישור נמוך (low bind), עד שהשכבה העליונה תהיה שקופה.הסיר את העל-נוזל (supernatant) באמצעות פיפט, אך היזהר שלא להפריע לננו-חלקיקים. לאחר מכן, השהה מחדש את הננו-חלקיקים ב-1 mL של PBS. העריך את ריכוז הננו-חלקיקי הזהב על ידי ביצוע מדידת UV visible של כ-3 µL מהתמיסה, והשווה את התוצאות לאלו של ריכוז ידוע של ננו-חלקיקי זהב, שכן זהו קשר ליניארי.אם הננו-חלקיקים אינם חסומים מספיק, הם יצברו אגרגטים בשל כוחות היצמדות בין-חלקיקיים, דבר המצביע על כך שהריאגנטים הוספו בריכוזים שגויים. בדרך כלל, התמיסה היא בצבע אדום עמוק, אך אגרגציה יוצרת גוון אפור. התאימו את הנפחים כך שהתמיסות הסופיות יהיו בריכוז של לפחות 1 times 10 to the eleventh חלקיקים למילליטר, ואחסנו את התמיסות בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש בהן עבור פונקציונליזציה של פלטת בדיקת האמינו.יש להשתמש בתמיסות אלו בתוך שבוע. ראשית, הכין כמות מספיקה של האנטיגן המדולל כדי למלא את בארות הפוליסטירן. לאחר מכן, ערבב את התמיסה באמצעות וורטקס והוסף אותה באופן מיידי לבארות הפלטה.אפשרו לאנטיגן להיקשר ללוחיות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את תמיסת האנטיגן העודפת על ידי שפיכת התמיסה והקשתה של הלוחית על גבי משטח שולחן מכוסה בנייר סופג. הוסיפו TBST לבארים כדי לשטוף את השטח, ולאחר מכן הסירו את השטיפה שוב על ידי שפיכת התמיסה והקשתה של הלוחית על גבי משטח שולחן מכוסה בנייר סופג.בשלב הבא, חסמו את אתרי הקישור שנותרו על הפלטה כדי למנוע קישור לא ספציפי, על ידי הוספת 70 µL של תמיסת חסימה של HSA לכל באר בפלטה ודגירה של הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שלושים דקות. לאחר מכן, הסירו את תמיסת החסימה ושטפו את הפלטה שלוש פעמים עם TBST כפי שהודגם בעבר. לאחר הסרת השטיפה האחרונה, כסו את הפלטה ואחסנו אותה כשהיא יבשה בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש הבא.הוסיפו 140 µL של ננו-חלקיקי הגשוש (probe nano particles) שהוכנו קודם לכן לעמודה הראשונה של פלטת 96 בארות. מקמו את ננו-חלקיקי הבדיקה בחמש השורות הראשונות, ולאחר מכן את ננו-חלקיקי הביקורת בשלוש השורות האחרונות. הוסיפו 70 µL של PBS לכל שאר העמודות.דללו כל עמודה באמצעות דילול סדרתי ביחס של 1 ל-2. התחילו על ידי העברה של 70 µL מהעמודה הראשונה וערבבו אותם עם העמודה השנייה. לאחר מכן, העבירו 70 µL מהעמודה השנייה והוסיפו אותם לשלישית, וכן הלאה.הניחו לפלטה להתרגב במשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן, הסירו את גששי הננו-חלקיקים שאינם קשורים ושטפו את הפלטה עם TBST חמש פעמים כפי שהודגם קודם לכן. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 70 µL של PBS לכל באר, וכסו את הפלטה באמצעות אטם לפלטות.ודא שדגימות הביקורת שקופות. אם התרחשה קישוריות לא ספציפית, דגימות הביקורה יציגו צבע דומה לדגימות הבדיקה. עבור כל באר, השתמש בספקטרופוטומטר UV-Visible לקריאת לוחיות כדי למדוד את הספקטרום בטווח של 400 עד 700 ננומטרים.בעזרת מיקרוסקופ Raman הפוך, התמקדו עם העדשה על פני השטח של הבאר המכילה את גששיי ננו-חלקיקי הזהב. השגי השגו ספקטרום Raman של הבאר. אספו ספקטרום בטווח שבין 1800 cm⁻¹ ל-400 cm⁻¹ וחזרו על פעולה זו עבור כל באר.לבסוף, פעלו לפי השלבים בסעיף האחרון של פרוטוקול הטקסט הנלווה כדי לקבוע את הרגישות של המערך. חלקיקי זהב בגודל 60 nano meter הוכנו כפי שמתואר בסרטון זה. לאחר מכן הם נותחו באמצעות UV-Visible Spectroscopy ו-Raman Spectroscopy.שטחי השיאים עבור כל ריכוז של ננו-חלקיקי זהב נקבעו באמצעות תוכנה בקוד פתוח לניתוח ספקטרלי, ושימשו ליצירת עקומת כיול לוגריתמית כזו המוצגת כאן. על בסיס נתונים אלו, נמצא כי גבול הגילוי התחתון היה 3.5 picomolar עבור גילוי UV-Visible ו-1.7 picomolar בעת שימוש ב-Raman Spectroscopy. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להתאים אישית בדיקות אימונו-סמיג (immunoassays) מבוססות גששי ננו-חלקיקים באמצעות UV-Vis ו-Raman Spectroscopy.

fabricating-a-uv-vis-and-raman-spectroscopy-immunoassay-platform

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כמותי, תפוקה גבוהה, בזמן אמת, וכן ללא תווית זיהוי biomolecular (דנ"א, חלבונים, וכו ') על...

Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת הבדיקה החיסונית הישירה המבוססת על ספקטרוסקופיית ראמאן לאיתור אנטיגני מטרה ספציפיים. הנוגדנים, אשר נספגים על פני השטח של ננו-חלקיקי זהב המחוברים לגשושיות ראמאן, מתקשרים עם אנטיגני מטרה ומייצרים ספקטרום ראמאן ספציפי, אשר מזוהה לאחר מכן.

בדיקה חיסונית ישירה מבוססת ספקטרוסקופיית ראמאן לזיהוי אנטיגן ספציפי

אנו מתארים את הייצור והאפיון של מערכות ננו-ביולוגיות המממשקות מצעים ננו-מובנים עם חלבונים ואפטמרים משותקים. מדווחים על השלבים הניסויים הרלוונטיים הכוללים ייצור ליטוגרפי של מצעים ננו-מבניים, ביו-פונקציונליזציה ואפיון ספקטרוסקופיה רמאן משופרת פני השטח (SERS). זיהוי SERS של חלבונים משותקים על פני השטח, ובדיקה של קשירת חלבון-ליגנד ואפטאמר-ליגנד מודגמת.

משטח משופר ראמאן ספקטרוסקופיה איתור של מולקולות ביולוגיות באמצעות EBL מצעי Nanostructured המפוברק

הליך עבור ייצור וביצוע פני השטח מבוסס-מסנן משופרת ראמאן ספקטרוסקופיות (SERS) assay לצורך זיהוי של מזהמים כימיים (כלומר, הדברה ferbam ו אמפיצילין אנטיביוטי) מוצג.

משטח מסנן מבוססי משופר ראמאן Assay ספקטרוסקופיות עבור איתור מהיר של מזהמים כימיים

אנו בפירוט שיטה לפברק מכשירים microfluidic תלת מימדי המבוסס על נייר לשימוש בפיתוח immunoassays. הגישה שלנו הרכבת מכשיר היא סוג של multilayer, ייצור כתוסף. אנחנו מדגימים immunoassay כריך לספק תוצאות נציג עבור סוגים אלה של מכשירים מבוססי נייר.

ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של קלטת קטן, מוכן לשימוש, שניתן להחיל לצורך זיהוי חזותי של מספר חומצות גרעין בבדיקה אחת, קלה לתפעול. בגישה זו, מערך נימי שימש לצורך זיהוי מולטיפלקס ויעיל מאוד של GMO מטרות.

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

פרוטוקול זה מציג את פלטפורמת משולבת ראמאן ספקטרוסקופית (MS) של המסה המסוגלת להשיג רזולוציה של תא בודד. ספקטרוסקופית ראמאן ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובה תאית לסמים, בעוד MS יכול לשמש ניתוח ממוקד וכמותי של ספיגת התרופה ואת חילוף החומרים.

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

אלקטרונואידים מבוססי מיקרופלואידיג דיגיטלי היא טכניקה העושה שינוי מונחה מתח בזווית המגע לכאורה של droplet מיקרוליטר-נפח כדי להקל על המניפולציה שלה. שילוב זה עם חרוזים מגנטיים פונקציונליזציה מאפשר שילוב של מספר מבצעים ביחידת מעבדה עבור הכנה לדוגמה וזיהוי של פתוגנים באמצעות חיסוני מקושר אנזים (אליסה).

האלקטרו-מערכות מבוססות-פלטפורמת מיקרופלואידיקה דיגיטלית עבור מערכת חיסונית אוטומטית מקושרת אנזימים

מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.

פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוח וזיקולות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) באמצעות ספקטרוסקופיית רמאן משופרת על פני שטח ללא תוויות (SERS), המאפשר אבחון מחלות זעיר-פולשניות והערכת sEVs ככלי אספקה טיפולית.

חקר היישום של חישה ביולוגית מבוססת פיזור רמאן משופר על פני שטח של sEVs בודדים באבחון מחלות ובטיפולים

למדו לפתח אימונו-אסיי מבוסס ננו-חלקיקי זהב עם אנליזה ספקטרוסקופית UV-Vis וראמאן. השיטה משלבת שיטות אופטיות משלימות לאימות תוצאות ומחקר מולקולרי מדויק.

בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay

גלה סרטונים נוספים