אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין את הפרוטאום האקסוזומי מתאים נגועים ב-HIV-1. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת המפתח בתחום הביולוגיה של האקסוזום, כגון השפעת הלחצים החיצוניים על הרכב הפרוטאום האקסוזומי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ללמוד אותה גם עם רקע מוגבל בפרוטאומיקה וביולוגיה אקסוזומית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי זיהום HIV, ניתן ליישם אותה גם במחקרי מחלות אחרות כגון זיהומים חיידקיים. קו התאים H9 משמש בניסוי זה, אם כי ניתן להשתמש בקווי תאים שונים כל עוד הם נמצאים בשלב התפשטות פעיל ורגישים לתנאי הבדיקה הנבחרים. זרע פעמיים 10 עד שלב שישי תשעה תאים בכל אחת משתי צלוחיות תרבית תאים.

גדל אוכלוסייה אחת ב-10 מיליליטר של מדיום מסומן המכיל 10% FBS מסוגנן, 100 מיליגרם לליטר L-ליזין עם תווית C13 ו-100 מיליגרם לליטר L-ארגינין C13 ו-N15. גדל את האוכלוסייה האחרת ב-10 מיליליטר של מדיום ללא תווית עם 10% FBS מסוגנן, L-ליזין ו-L-ארגינין. גדל את התאים במשך שש הכפלות, ובשלב זה החלבונים של התאים בתווך המסומן מסומנים ביותר מ-99% בחומצות אמינו כבדות.

הוסף מדיה חדשה או החלף מדיה במרווחי זמן קבועים בהתאם לסוג התאים. בתום התיוג, הגדל את נפח התרבות ל -30 מיליליטר כדי להתאים לצמיחה של תאים נוספים. הדביקו את התאים המסומנים בזן NL4-3 של HIV-1 באמצעות פרוטוקול הדבקה סטנדרטי של HIV-1.

הוסף כמות מתאימה של וירוס לתאים ודגר במשך 48 שעות בזמן שהתאים הלא מסומנים ממשיכים לגדול בתווך ללא תווית ללא זיהום HIV-1. בסוף ההדבקה ב-HIV-1, הסופרנטנטים משתי אוכלוסיות התאים נקצרים לבידוד אקסוזום. אסוף את הסופרנטנטים של התרביות בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר תוך הימנעות מהתאים.

צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 300 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס להסרת התאים הנותרים. אסוף את הסופרנטנטים בצינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2,000 פעמים גרם כדי להסיר תאים מתים. העבירו את הסופרנטנטים המתקבלים לצינורות מסחריים תואמי רוטור המסוגלים לעמוד באולטרה-צנטריפוגה.

הקפד לאזן את צינורות האולטרה-צנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 10,000 פעמים גרם כדי להסיר פסולת תאים. אסוף את הסופרנטנטים בצינורות אולטרה-צנטריפוגות חדשים.

צנטריפוגה למשך 70 דקות ב 100, 000 פעמים גרם. השלך את הסופרנטנט. השעו מחדש כל גלולה עשירה באקסוזומים בחמישה מיליליטר PBS טרי והעבירו את התמיסה לצינור אולטרה-צנטריפוגה טרי.

שוב צנטריפוגה למשך 70 דקות ב 100, 000 פעמים גרם. לאחר הסיבוב האחרון, השליכו את הסופרנטנט. כדורי התא מוכנים כעת למיצוי חלבון.

כדי להתחיל בהליך זה, יש להמיס כל גלולה אקסוזומלית מבודדת ב-100 עד 200 מיקרוליטר של fer-pa-lai-ses ומאגר מיצוי בתוספת מעכבי פרוטאז שיכולים לעכב מגוון שלם של פרוטאזות. צנטריפוגה את התמיסות המומסות למשך 10 דקות בטמפרטורה של 13, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנטים המנוקים לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים של 1.5 מיליליטר.

לאחר כימות ריכוז החלבון של כל דגימה על ידי מבחנים סטנדרטיים, מערבבים כמויות שוות של חלבונים מהדגימות המסומנות והלא מסומנות. יש להריץ את התערובת השווה על ג'ל SDS-PAGE של 4 עד 20% למשך 30 דקות. מכתים את הג'ל בכחול Coomassie ואחריו נמנעים.

בעזרת סכין גילוח, חותכים את נתיב הדגימה מהג'ל, ואז חותכים את נתיב הג'ל ל-10 עד 15 חלקים שווים. הכניסו כל חתיכה לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר בסך הכל 10 עד 15 צינורות, והמשיכו בהליך מיצוי החלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ההליכים לניתוח נתונים פרוטאומיים לא יודגמו אך יסוכמו בתרשים זרימה זה.

החלבונים המופקים מנותחים תחילה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרוסקופיה מסה טנדם, ואיכות הנתונים מוערכת. לאחר מכן, הנתונים מטופלים מראש על ידי הסרת חלבונים שיש להם פחות משני פפטידים מכומתים. לאחר מכן מזוהים חלבונים מווסתים ומווסתים באופן משמעותי.

לבסוף, משווים את השכפולים של המועמדים המשמעותיים כדי להשיג עקביות, והנתונים מכל השכפולים ממוזגים. כדי להתחיל באפיון החלבונים שזוהו, השתמש במספרי הכניסה של GenBank או במזהי UniProt שלהם כדי לחפש מול מסדי נתונים אקסוזומיים עדכניים. ExoCarta ישמש בהדגמה זו.

לחץ על שאילתה והזן את שם הגן או החלבון או מספר ההרשמה. כל עדות באקסוזומים מאמתת שהחלבונים המועמדים נמצאו בעבר באקסוזומים וזה מוסיף שכבה של ביטחון שהמועמדים אכן נמצאים באקסוזומים. לאחר מכן, חפש את המועמדים מול מסד הנתונים של אינטראקציה בין HIV-1 וחלבון אנושי.

בערך שם הדומיין של החלבון, הזן את שמות המועמד או מספרי הכניסה ולחץ על חיפוש. תוצאות החיפוש יכולות לספק תובנות לגבי האינטראקציות בין HIV-1 לבין המועמדים לחלבון, ולהציע מי מהמועמדים עשוי באמת להיות קשור ל-HIV-1. הצעד השלישי הוא להשיג תובנה גלובלית על המועמדים באמצעות אונטולוגיה גנטית או תוכנת ניתוח GO כגון fun-brich.

תחת ניתוח העשרה, לחץ על הוסף מערך נתונים והעלה את מספרי הכניסה של GenBank או מזהי UniProt של המועמדים, ולאחר מכן בחר את סוג התרשים כדי להמחיש את ניתוח GO. תוצאות ניתוח GO מוצגות בצורה של תרשימי עוגה המספקים מידע על החלבונים המועמדים בתחומי התהליך הביולוגי, המרכיב התאי והתפקוד המולקולרי. השלב הבא הוא זיהוי מונחי GO המיוצגים יתר על המידה סטטיסטית באמצעות ניתוח DAVID.

לחץ על כלי הביאור הפונקציונלי, היכנס לרשימת המועמדים ובחר את מזהה הגן כגון רשימת הגנים UniProt ID.Select וחיפוש. לאחר השלמת החיפוש, לחץ על דף תוצאות סיכום הביאור תחת הקטגוריה אונטולוגיה של גנים כדי להציג את מונחי GO המועשרים, ערכי p ופרמטרים אחרים. לבסוף, חקור אינטראקציות חלבון-חלבון פוטנציאליות ומסלולים ביוכימיים אפשריים באמצעות מסד הנתונים הנגיש לציבור של STRING.

הזן את מזהה החלבון או הרצף בתיבת החיפוש המיועדת ובחר את המין הנכון לניתוח. לחץ על חיפוש. התוצאות יתנו מידע על אסוציאציות ישירות ועקיפות כאחד.

יש לקחת בחשבון את 10 ההתאמות הידועות הראשונות עבור המועמד האקסוזומי המוצג בתוצאות לבחירת מועמד משמעותית. מוצגות תוצאות מייצגות מניתוח DAVID של קבוצה של 14 חלבונים. העשרת התהליך הביולוגי הצביעה על כך שתהליכים הקשורים למוות תאי מועשרים באופן משמעותי.

העשרת הרכיב התאי מראה חלבונים רבים ממקור תוך-תאי, והעשרת התפקוד המולקולרי זיהתה תפקיד בקשירת חלבונים עבור רוב המועמדים. שרשרת L-לקטט דהידרוגנאז B או LDHB נבחרה כמועמדת המשמעותית ביותר, וניתוח STRING זיהה את 10 השותפים האינטראקטיביים המובילים של LDHB. רוב השותפים ל-LDHB היו קשורים גם מבחינה תפקודית ומיקום לאקסוזומים ב-HIV-1.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע כל שלב בטמפרטורה ובמצב הנכונים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בידוד זיקה על מנת לאשר את התחזיות של ניתוח ביואינפורמטי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האקסוזומי לחקור את השינויים בפרוטאום האקסוזומי הקשורים לזיהומי HIV-1 בביולוגיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אקסוזום מתרבית תאים, לנתח את הפרוטאומים שלהם ולחקור את הקשר שלהם ל- HIV. אל תשכח, עבודה עם HIV או גורם זיהומי אחר עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.