הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבסס תרביות גליה מעורבות ראשוניות מחוטי השדרה של עכברים בוגרים למחקרי מבחנה. שיטה זו מספקת לנו מערכת חוץ גופית לחקור את תפקידיהם של תאי גליה במחלות נוירולוגיות הכרוכות בשינויים פתולוגיים בחוט השדרה, כגון כאב נוירופתי וטרשת נפוצה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתרביות הגליה מוכנות מחוט השדרה של עכבר בוגר, ומספקות מערכת המשקפת בצורה מדויקת יותר את תנאי in vivo.

שתדגים את ההליך תהיה ג'ניפר מאלון, טכנאית מהמעבדה שלי. בעבודה במכסה מנוע של תרבית רקמות, העבירו ארבעה חוטי שדרה של עכברים לצלחת פטרי של HBSS. השתמש במספריים ובמלקחיים סטריליים כדי לחתוך כל אחד מחוטי השדרה לחתיכות קטנות.

לאחר מכן, העבירו את החלקים לצינור חרוטי בגודל 50 מילימטר המכיל תערובת אנזים Papain DNAse. יש להימנע מהעברת HBSS לתערובת האנזימים, מכיוון שהדבר עלול לגרום לירידה בביצועי האנזים. חיוני שחלקי הרקמה יתעכלו היטב כדי לקבל תרחיף תא בודד.

עם זאת, עיכול יתר יביא לפחות תאים ברי קיימא. כל מעבדה צריכה לבצע בדיקות פיילוט כדי לקבוע את זמן העיכול המדויק על סמך מה שעובד הכי טוב עבור התאים שלהם. לאחר מכן, מערבל בעדינות את הצינור ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עם טלטול מסלולי במהירות של 150 סיבובים לדקה.

לאחר הדגירה, מערבל את הצינור, ולאחר מכן טריטוציה נמרצת של הרקמה באמצעות פיפט של חמישה מיליליטר כדי לקדם דיסוציאציה נוספת. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה למשך 300 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הצנטריפוגה, ב -300 מיקרוליטר של תמיסת מעכב אלבומין אובומוקואיד משוחזר ל -2.7 מיליליטר ABSS בצינור סטרילי ומערבבים היטב.

לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת DNAse. לאחר הצנטיפוגציה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא במעכב האלבומין הטרי וה-DNAse בתמיסת ה-DNASE. מערבולת היטב כדי לשבור את גלולת התא.

לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת מעכב אלבומין אובומוקואיד משוחזרת, ללא DNAse, לתרחיף התאים. צנטריפוגה של התאים ב-70 x גרם למשך שש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט, המכיל שברי קרום, ושמור על הגלולה.

כדי להסיר מיאלין מתאי חוט השדרה המנותקים, הוסף תחילה שמונה מיליליטר של מדיום צפיפות שיפוע של 20% בטמפרטורת החדר לתוך הצינור המכיל את כדור התא והמערבולת בעדינות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 800 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מבלי להישבר. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את שכבת הפסולת העליונה, המכילה בעיקר מיאלין ואת הסופרנטנט, והשאירו את הגלולה.

כדי להסיר כל שיפוע צפיפות שנותר, שטפו את התאים על ידי השעיית הגלולה עם שמונה מיליליטר cDMEM מדולל ב-HBSS. צנטריפוגה של התאים ב-400 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים עם cDMEM מדולל כמו קודם.

לאחר הסרת הסופרנטנט, ניתן לאחסן את הגלולה על קרח עד לזריעת התאים. לאחר שהיו מוכנים לציפוי, השעו מחדש את התאים ב-14 מיליליטר של cDMEM, בתוספת 2-מרקפטואתנול. והוסף מיליליטר אחד של מתלה התאים לכל באר בצלחת של 12 בארות.

צלחת בארות נוספות שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע את מספר התאים הממוצע לבאר ואת תכולת המיקרוגליה של התרבית. לאחר שהתאים הוצפו יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 35.9 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שנה את המדיום ביום הראשון, שהוא היום שאחרי הציפוי.

חלק מהתאים מחוברים לצלחת התרבית, אך הם עדיין עגולים ברובם. ישנם גם תאים צפים רבים ופסולת משמעותית. חזור על החלפת המדיה שלושה עד ארבעה ימים לאחר מכן עד שהתאים מוכנים לטיפול בין הימים 12 ל-14.

תאי גליה מעורבים משישה עכברים שחורים C57 בוגרים תורבבו ב-37 מעלות צלזיוס או 35.9 מעלות צלזיוס ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. כפי שאתם יכולים לראות, אין הבדל ברור בסך אוכלוסיות התאים בטמפרטורות האלה. תרשימים מייצגים אלה מראים את אוכלוסיות המיקרוגליה החיוביות ל-CD45 CD11b מבודדות מכלל אוכלוסיות התאים שהוצגו קודם לכן.

איור זה מדגים כי ניתן להשיג תכולת מיקרוגליה גבוהה יותר כאשר מגדלים גליה מעורבת ב-35.9 מעלות צלזיוס, במקום 37 מעלות צלזיוס. חוט שדרה בוגר, תרביות גליה מעורבות הוכנו משישה עכברים שחורים C67. מוצגות תמונות מייצגות של התאים המתורבתים בימים הראשון, הרביעי, השמיני וה-12.

תמונות המציגות את ההתקדמות האופיינית של התרבות, כמו גם מדגימות את חשיבות התקשורת, משתנות ביום הראשון של הממסד הפוסט-תרבותי. לאחר השליטה, ניתן להשלים את ההגדרה הראשונית של תרבית תאי גליה מעורבת תוך כארבע שעות, אם מבוצעת כראוי. לאחר הקמת תרבית גליה מעורבת, ניתן להשיג תרביות מועשרות במיקרוגליה ומועשרות במיקרוגליה מאוכלוסייה מעורבת ראשונית זו.

עם זאת, התפוקה של תאים מועשרים במיקרוגליה תהיה מוגבלת אלא אם כן נעשה שימוש במספר רב של חוטי שדרה להקמת תרביות. טכניקה זו תוכננה בתחילה לחקור את תפקידם של תאי גליה במהלך התפתחות כאב נוירופתי. עם זאת, ניתן להשתמש בו כדי לחקור מחלות נוירולוגיות אחרות הכרוכות בשינויים פתולוגיים בחוט השדרה הבוגר.