Name: הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למדו הכנת תרבויות גליה מעורבות ראשיות מחוט השדרה של עכבר מבוגר לחקר כאב נוירופתי ומחלות נוירולוגיות. שיטה זו מספקת מודל מדויק של תנאי in vivo לחקירת תפקידי תאי הגליה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תרביות מעורבות של חוט השדרה למבוגרים פותחו לראשונה באמצעות חולדות בתמיכת מענק מפרס NIH/NIDA R01 (PI De Leo) ומענק הכשרה של NIH T32 (PI Green). שיטות אלה הותאמו עוד יותר לחוט השדרה של עכברים בתמיכת המענקים הבאים: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) ו-NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). המחברים רוצים גם להודות לד"ר אלחנדרו מאייר, המחלקה לפרמקולוגיה, מכללת שיקגו לרפואה אוסטאופתית, על עזרתו הטכנית בהשגת תאי גליה מעורבים עשירים במיקרוגליה.

הפרוטוקול הבא אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) באונ&#39; ניו אינגלנד. פרוטוקול להלן להכנת תרבויות גליה מ -4 מיתרי השדרה עכבר בוגר. 1. הכנת פתרונות במנדף תרבות בתנאי aseptic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת תרבות: השינוי של Dulbecco המלא של התקשורת של הנשר (cDMEM) המכיל DMEM (עם 4.5 g / גלוקוז L), 10% בסרום שור עובר (FBS), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 פניצילין IU / mL, 100 מ&quot;ג / mL סטרפטומיצין ng, 250 / מ&quot;ל ​​Amphotericin B, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol (2-ME, ראה 1.1.1). מערבבים ולסנן לעקר כל הרכיבים האחרים ולאחר מכן להוסיף FBS. אחסן את התקשורת והתרבות ב 4 מעלות צלסיוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;מ 2-ME / שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) פתרון המניות: להוסיף 100 μL של מרוכז 2-ME (14.3 M) לתוך 28.6 מ&quot;ל של PBS 1x, ולסנן לעקר (הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס עבור מספר חודשים). Use 1 מ&quot;ל של 2-ME פתרון המניות לכל 1,000 מ&quot;ל של התקשורת והתרבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תקשורת שיפוע הצפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון תקשורת שיפוע צפיפות איזוטוני מניות (למשל, 100% Percoll) מ 1 חלק 10x PBS סטרילי רגיל ו -9 חלקים בתקשורת שיפוע צפיפות מניית סטרילי (למשל, Percoll). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תקשורת שיפוע צפיפות 100% (תוצרת 1.2.1) עם PBS סטרילית 1x הרגיל לעשות תקשורת שיפוע צפיפות 20% (למשל, 10 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות 100% עם 40 מיליליטר של PBS 1x) ולאחסן אותו ב 4 o C. תביאו את התקשורת שיפוע צפיפות 20% לטמפרטורת החדר (RT) לפני הכנת תרבית תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות ממערכת דיסוציאציה פפאין הערה: מערכת ניתוק פפאין יכולה להיות מזוהית טבלת החומרים. ערכות דיסוציאציה דומות אחרות (כולל אלה התאספו ללא צורך במיקור חוץ) יכולות לשמש גם. כל components חייב להיות סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 32 מ&quot;ל של תמיסת מלח מאוזן של ארל (EBSS) לתערובת מעכב ovomucoid (אבקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של EBSS אל הבקבוקון פפאין אחד (אבקה). מניחים את הצנצנת פפאין באמבט מים C 37 o במשך 10 דקות או עד פפאין נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של EBSS כדי בקבוקון DNase אחד (אבקה). מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL של פתרון DNase (לעיל) כדי בקבוקון פפאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום הכולל של התערובת פפאין / DNase מעל הצורך (כ 800 μL של תערובת פפאין / DNase לכל כבל העכבר השדרה) ולהעביר את התערובת הדרושה לתוך צינור 50 מ&quot;ל לעיכול רקמת (שלב 3.2). אחסן את שאריות הבקבוקון המקורי ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל רכיבי הערכות על קרח עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות אוסף חוט השדרה: סטרילי אחד 15 מ&quot;ל צינור עם 5 מ&quot;ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS; ממערכת דיסוציאציה פפאין,0; לאיסוף מיתרי השדרה) וסטרילי אחד 15 צינור מ&quot;ל עם 1x PBS (למילוי את מזרק 5 מ&quot;ל, ראה שלב 2.4). בנוסף, להכין צלחת פטרי סטרילית אחד (35 מ&quot;מ או 60 מ&quot;מ) עם 5 מ&quot;ל של HBSS ולשמור אותו למכסה המנוע בתרבית. </li></ol> 2. אוסף חוט שדרה הערה: כל הציוד חייב להיות סטרילי. בצע את האוסף באזור מיועד שאושר על ידי IACUC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הכלים הבאים עבור מיתרי השדרה עכבר קציר: ישר חדה / מספריים כירורגיות 18 ס&quot;מ בוטה, אזמל תקן 12 ס&quot;מ (# 3 מוצק), להבים אזמל סטרילי פלדה פחמן 10 #, decapitator חיה קטנה, 12 ס&quot;מ סטנדרטי מעוקל מלקחיים, ומחט 20G סטרילי מצורף מזרק 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו עם CO 2 ולחטא את הראש העכבר באזור הגב עם 70% אתנול (EtOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף חיה עם decapitator. ביצוע חתך אורכי באמצע על הגב התחתון כדי לחשוף את שכבת השריר. עשהחיתוך רוחב נקי דרך עמודת החוליות ברמת הירך (גם חיתוך דרך שכבת השריר המכסה את העמודה החולייתנים) עם מספרי כירורגיות הישרים סטרילי (18 סנטימטרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החיה על גיליון טרי לנגב הפנויה. בזהירות להכניס 20 המחט G (מצורף מזרק 5 מ&quot;ל מלא PBS 1x סטרילי (שלב 1.4)) לתוך עמוד השדרה כלפי הצד מקורי. להחזיק את החיה למטה בחוזקה ודחף את המזרק במהירות. חוט השדרה כולו צריך לצאת מסוף צוואר הרחם. אסוף את חוט השדרה לתוך 15 הצינור מ&quot;ל המכיל HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 עבור שאר העכברים. בין כל חיה, לחטא את כל המכשירים המשמשים עם 70% EtOH. הערה: בדרך כלל, צלחת 12 גם אחת ניתן לקבוע עבור כל 4 עכבר מיתרי השדרה (ראה 4.3). </li></ol> 3. הכנה של תרחיף התא הבודד הערה: בצע את השלבים 3 ו -4 במנדף התרבות לשמור על הכל סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל מיתרי השדרה לתוך צלחת פטרי HBSS המכילים (שלב 1.4). חותכים כל של מיתרי השדרה לתוך חתיכות רבות בסדר, קטן עם מספריים מלקחיים סטרילית. מעבירים את רקמת חוט השדרה אל צינור חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל את פפאין מוכן / תערובת אנזים DNase (שלב 1.3.5) באמצעות מלקחיים סטרילית או פיפטה 10 מ&quot;ל (להימנע מהוספת HBSS לתערובת אנזים, כמו זה יהיה עוד יותר לדלל את מוכן פתרון אנזים ועלול לגרום לביצועים ירד של האנזים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס הצינור בעדינות לתערובת. דגירת הצינור ב 37 o צלזיוס במשך שעה 1 ב שייקר אינקובטור / עם רעד מסלולית ב 150 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס הצינור שוב נמרצות triturate הפתרון האנזים עם רקמות בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל לקדם דיסוציאציה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל ב 300 XG במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, לערבב 2.7 מ&quot;ל EBSS עם 300 μL של Inh אלבומין-ovomucoid מחדשפתרון ibitor (1.3.1) בצינור סטרילי. הוספת 150 μL של פתרון DNase (שלב 1.3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant ו resuspend התא גלולה עם פתרון מוכן לעיל (שלב 3.5). וורטקס היטב כדי לשבור את התא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של תמיסת מעכב אלבומין-ovomucoid מחדש (שלב 1.4.1) על השעיית התא. תאים צנטריפוגה ב 70 XG במשך 6 דקות ב RT. הסר את supernatant (המכיל שברי קרום). </li></ol> הסרת .4 בהמשך של המיאלין מן תרחיף התא הבודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות 20% (מוכנה בשלב 1.2.2) לתוך השפופרת המכילה את התא גלול, מערבולת בעדינות כדי לשבש את הגלולה, צנטריפוגות התאים ב 800 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלימה. מוציאים בזהירות את השכבה העליונה של פסולת (בעיקר המיאלין) ואת supernatant, אבל לשמור על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר שאריות של שיפוע צפיפות, לשטוף את התאים על ידי resuspending התא גלולה עם 8 מ&quot;ל של cDMEM מדולל (1 חלק cDMEM ו -2 חלקים HBSS). צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס הסר את supernatant לשטוף את התאים שוב עם מדולל cDMEM (לעיל), באותו אופן. שמור את התאים על קרח עד זריעה אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה בתקשורת תרבות (cDMEM מסופק עם 2-ME (מוכן בשלב 1.1)). עבור צלחת אחת 12-היטב, השתמש 3 מ&quot;ל x 4 (מספר העכברים בשימוש) + 2 מ&quot;ל = 14 מ&quot;ל התקשורת. פעולה זו תבטיח כי יש השעית תא מספיק עבור הצלחת כולה (12 בארות) ותספק עבור בארות נוספות שיכול לשמש כדי לקבוע את המספר סלולארי הממוצע לכל טוב ותוכן microglial של התרבות. אם סוגים אחרים של כלי התרבות ישמשו, לחשב את הנפח הכולל של תקשורת ותרבות הדרושה באופן יחסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של ההשעיה תא לבאר כל צלחת 12-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב C 35.9 o עם 5% CO 2. </li><li&gt; שנה את התקשורת (להסיר המדיה הישנה באמצעות שאיפה) על D 1 ולאחר מכן כל 3 - 4 ד ואילך (בדרך כלל לשנות את התקשורת על D: 1, 4, 8, ו -11, ולאחר מכן להשתמש בתאים ביום 12). הערה: ביום 1, התרבות עלולה להכיל כמויות משמעותיות של פסולת בשל המיאלין שאריות רקמת חוט השדרה; וכך, שינוי התקשורת ביום 1 מומלץ (עיין הדיון למידע נוסף). תרבויות מוכנות לטיפול בין D 12 - 14. תאים בדרך כלל הם 80% ומחוברות ב D 12 ויכולים להיות קרוב ל- 100% ומחוברים על ידי D 14. בדרך כלל, על D 12, יש כ 100,000 תאים לכל היטב צלחת 12 גם . </li></ol><img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> איור 2:. נציג תמונות של תאי גליה מעורבים בזמנים שונים לאחר הקמת התרבות גליה המעורבת גליה מעורבת חוט השדרה ראשית הוכנה ממבוגר C57Bl / 6 עכברים. נציג תמונותלהציג את ההתקדמות של תרבות גליה לאחר הציפוי. באותו יום 1, תאים מסוימים מצורפים צלחת התרבות, אבל הם עדיין בעיקר סביב. יש גם הרבה תאים צפים ופסולת משמעותית. באותו יום 4, רוב התאים מצורפים צלחת התרבות. תאים להופיע ענפים עם תהליכים גלויים. תאים מופצים באופן ספוראדי ותרבויות הן כ 20-30% ומחוברים בשלב זה. באותו יום 8, תרבויות הן בין 50-60% ומחוברות. באזורים מסוימים של התרבויות כתמים גדולה של תאים. יש תחומים אחרים של תרבויות צמיחה דלילה של תאים. כמה תאים בתוך הטלאים לקחת על מראה &quot;מרובע דמוי&quot;. באותו היום 12, תרבויות הן בבית או מעל 80% ומחוברות (כ -90% ומחוברים בתמונה המוצגת כאן). תא נמצא בשלב היומן של צמיחה בשלב זה ובין ימים 12-14 זה הזמן האופטימלי עבור שימוש בתאי גליה לניסויים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את תוכן microglial באמצעות תאי מבארות הנוספות (שלב 4.3) באמצעות מיון תא קרינה המופעלת סטנדרטי (FACS) פרוטוקול מכתים 11 באמצעות השילוב של נוגדנים חד שבטיים אנטי עכבר CD45 ואנטי עכבר CD11b. CD45 + CD11b + תאים מזוהים microglia. </li></ol>

<ol><li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain%22%5BJournal%5D)">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li>
<li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+and+pain%3A+Is+chronic+pain+a+gliopathy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNi%2C+M+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Maines, M. D., et al. , (2010).</li>
<li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures%3A+microglial-dependent+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li>
<li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+%2F+v-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li>
<li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li>
<li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li>
<li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li>
<li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li>
<li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+Infiltrating+CD4%28%2B%29+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li>
<li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability%2C+tumor+necrosis+factor-alpha%2C+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7(2001).</li>
<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li>
<li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li>
<li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

זה קריטי כדי לבצע את כל השלבים, כולל בתקשורת שינוי לוח זמנים-באופן עקבי על מנת לקבל תוצאות לשחזור בין ניסויים. השלבים הבאים הם קריטיים במיוחד בהשגת גליה מעורבת מבוגרים באיכות מעולה. עיכול אנזימטי הוא היבט חשוב של פרוטוקול זה. זה חיוני כי פיסות הרקמה הם גם מתעכל כדי לקבל השעיה תא בודד. עם זאת, יתר העיכול יגרום פחות תאים משמעותיים. מעבדה כל צריך לבצע בדיקות ניסיוניות לקביעת זמן עיכול המדויק המבוסס על סוגי הבקבוקוני...

כאב כרוני הוא בעיה בריאותית חמורה המשפיעה על כ -100 מיליון מבוגרים בארצות הברית, עם עלות שנתית משוערת של עד 635 מיליארדים $ 1. ראיות מצטבר ציינו תרומה משמעותית של תאי גלייה בחוט שדרה בפיתוח בכאב עצבי, אחד המיני ההרסני ביותר של כאב כרוני 2. מערכת תרבות ראויה במבחנה תעזור משמעותית נוספים חוקרים את התפקידים של ותאי גלייה ברמות התאיות ומולקולריות. נכון לעכשיו, מערכות התרבות גליה במבחנה מנוצלות על ידי חוקרים כוללות בעיקר תאי גלייה נגזרו רקמות קליפת מוח של מוח עכבר או עכברוש בילוד והנציחו שורות תאי גליה הנגזרות עכבר בילוד או להלשין ותאי גלייה עיקריים. תאים עובריים מכילים כמויות משמעותיות של תאים שלא עברו התמיינות אשר ניתן להבדיל נוספת לתאי גליה (בעיקר האסטרוציטים ו microglia), ובכך לספקתאי bundant לשימוש 3 ניסיוני. עם זאת, המחקר קודם שלנו הראה כי תאי גלייה בילוד המוח הגיבו באופן שונה משמעותי מתא גליה בחוט שדרה מבוגרת על lipopolysaccharide (LPS) גירוי. לדוגמה, interleukin (IL) -4 מוצג משופרת השפעות מעכבות על תחמוצת החנקן הנגרמת LPS (NO) ב גליה בחוט השדרה עכברוש מבוגר לעומת גליה 4 המוח בילוד. יתר על כן, את הפרופילים של ייצור chemokine על גירוי על ידי neuropeptide, calcitonin פפטיד הקשורים גן (CGRP), הם unarguably שונים בין גליה המוח עכבר בילוד (השיטות המתוארות Ref. 5) ועכבר מבוגר גליה חוט השדרה (איור 1). שורות תאים הוקמו קלות לשימוש ולתחזוקה והוא יכול לספק מספר רב של תאים בתוך פרק זמן קצר. באופן כללי, הנציח שורות תאים נוצרות גם באמצעות מערכת הנצחה וירוס בתיווך (כגון שורת תאים microglial בשימוש נרחב BV2) 6, 7 או ה הבאהדואר זיהוי של טרנספורמציה ספונטנית (כגון שורת תאי astrocyte C8-D1A וקו תא microglial-B4 C8) 8, 9 שורות תאים מצוינות ללמוד את המאפיינים המולקולריים של האסטרוציטים ו microglia בנפרד.; עם זאת, התוצאות שהתקבלו מן שורות תאים תמיד דורשות אימות נוספת תאים ראשוניים או בתנאי in vivo. כמו כן יש לציין כי לא חל דו&quot;ח של קו תא גלייה כי נגזר גליה בחוט שדרה מכרסמת. כדי לסייע בחקירת התפקיד של תאי גלייה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי, מערכת התרבות הנגזרת חוט השדרה עכבר בוגר פותחה על ידי התאמת שיטת בעבר דיווח השתמשו כדי ליצור תרבויות גליה מעורבת חולדה בוגרת 4, 5 . תרבות גליה שדרת כבל העכבר הייתה מעודנת יותר לאחרונה 10 והוא מתואר בפירוט רב יותר במאמר זה. ג תרבויות שדרה למבוגר גליה מעורבת כבלשתוקם עם העכבר זנים נבחרים שמתאימים לצרכים של מחקר מסוים, ותאי יכול להישמר בתרבות עד 21 לפוסט חניכה של התרבות. שיטה זו יכולה לשמש במחקרים כאב נוירופתי, כמו גם בחקירות של מחלות נוירולוגיות שונות שכוללות שינויים פתולוגיים בתוך חוט השדרה, כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) -associated נוירופתיה סנסורית, מרובים טרשת (MS).

<table><tbody><tr><td>דולבקו s שינוי של Eagle' s media (DMEM) עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>מדיית cDMEM היא מדיית תרבית סטנדרטית בשימוש נרחב. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש את ה-DMEM ואת כל הרכיבים האחרים המשמשים לייצור מדיה cDMEM.</td></tr><tr><td>L-גלוטמין (100x)</td> <td>לונזה</td><td>17-605E</td><td>ה-L-גלוטמין הוא רכיב סטנדרטי בשימוש נרחב עבור מדיות תרבית שונות. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש L-גלוטמין.</td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>זהו שילוב של פניצילין, סטרפטומיצין ואמפוטריצין שנוסח להכיל 10,000 יחידות/מ"ל פניצילין G, 10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין סולפט ו-25 מיקרו; גרם/מ"ל אמפוטריצין B. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש רכיבים בודדים.</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול (2-ME)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td>מגיב ביולוגי, מתאים לתרבית תאים, ביולוגיה מולקולרית ואלקטרופורזה.</td></tr><tr><td>מערכת דיסוציאציה פפאין</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>ניתן לרכוש רכיבים בודדים של ערכה זו בנפרד.&nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll נמכר כתמיסה סטרילית. ניתן לבצע חיטוי מחדש של פרקול לא מדולל במידת הצורך.</td></tr><tr><td>חממה/שייקר של קו מעבדה&nbsp;</td><td>Barstead/Lab-line</td><td>MaxQ4000&nbsp;</td><td>זו החממה/שייקר שיש לנו כרגע. ניתן להשתמש בסוגים אחרים של שייקרים במקום.</td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים, Salmonella Minnesota Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>זנים אחרים של LPS יכולים גם הם לגרום לתגובות גליה. עם זאת, היקף התגובות עשוי להשתנות.</td></tr><tr><td>עכבר IL-6 DuoSet ELISA&nbsp;</td><td>מו"פ D Systems</td><td>DY406</td><td>כל חוקר בודד יכול לבחור את ערכת ELISA המועדפת עליו.</td></tr><tr><td>עכבר TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY410</td><td>כל חוקר בודד יכול לבחור את ערכת ELISA המועדפת עליו.</td></tr><tr><td>עכבר IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY466</td><td>כל חוקר בודד יכול לבחור את ערכת ELISA המועדפת עליו.</td></tr><tr><td>עכבר MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>כל חוקר בודד יכול לבחור את ערכת ELISA המועדפת עליו.</td></tr><tr><td>כימוקין עכבר Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>מוצר זה לא היה זמין לבדיקה פנימית באותה עת. במקום זאת, שלחנו דגימות ליצרן לניתוח.</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>ניתן להשתמש בנוגדנים מאותו שיבוט אך מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>ניתן להשתמש בנוגדנים מאותו שיבוט אך מספקים אחרים.</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&nbsp;</td><td>כל חוקר יכול להשתמש בכל ציטומטר זרימה שהוא מעדיף.</td></tr><tr><td>תוכנת FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>כל חוקר יכול להשתמש בכל תוכנת ניתוח שהוא מעדיף.</td></tr></tbody></table>

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

זה כבר טוב כי קיבל תגובות גליה בחוט השדרה לתרום רבות להתפתחות כאב נוירופתי. מידע עצום בנוגע לפעילות גליה ברמות התאיות ומולקולריות הושג באמצעות מערכות תרבות תאים במבחנה. המערכות חוץ הגופייה המנוצלת, כוללות בעיקר גליה עיקרית נגזרה רקמת קליפת מוח מוח בילוד והנציחו שורות תאים. עם זאת, מערכות אלה לא יכולים לשקף את המאפיינים של תאי גלייה בחוט השדרה in vivo. כדי להמשיך לחקור את התפקידים של תאים גליה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי-induced פגיעה עצבית היקפית באמצעות מערכת תרבות משקפת טוב יותר את מצב in vivo, במעבדה שלנו פיתחה שיטה להקים תרבויות גליה מעורבת חוט השדרה העיקרי מן עכברים בוגרים. בקצרה, נאספים מיתרי השדרה של עכברים בוגרים ומעובד באמצעות עיכול פפאין ואחריו הסרת המיאלין עם מאורותity-שיפוע בינוני. המתלים תא בודדים בתרבית תקשורת הנשר השונה של שלמה Dulbecco (cDMEM) בתוספת 2-mercaptoethanol (2-ME) ב 35.9 מעלות צלסיוס תנאי תרבות אלה מותאמים במיוחד עבור הצמיחה של תאי גליה מעורבים. בתנאים אלה, תאים מוכנים לשמש לניסויים בין 12 - 14 ד (תאים הם בדרך כלל בשלב יומן במהלך הזמן הזה) לאחר הקמת התרבות (D 0) ו יכולים להישמר בתנאי תרבות עד D 21. מערכת תרבות זו יכולה לשמש כדי לחקור את התגובות של תאי גלייה בחוט שדרה על גירוי עם חומרי סוכנים שונים. מלבד כאב נוירופתי, מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור תגובות גליה במחלות אחרות שכוללות שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט שדרה.

שיטה זו יכולה לשמש כדי להכין ותאי גלייה מעורבים משני עכברים וחולדות. מספר התאים הכולל ממוצע לכל היטב צלחת 12 גם ב -12 D-ייזום פוסט של התרבות צריך להיות יציב יחסית, עם כ 100,000 תאים לכל טוב כאשר תאים נגזרים מייתרי שדרת עכבר. תאי גלייה המתקבלים בשיטה זו ניתן להשתמש בניסויים שנועדו לבחון את תגובות גליה בחוט שדרה מבוגרות על מתן חומרים והסוכנים של עניין. איור 3 מספק דוגמא של תגובות ציטוקינים ו chemokine מניסוי טיפוסי אחד שבו microglia ...

התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להקים תרביות ראשוניות מעורבות של תאי גליה מחוט השדרה של עכברים בוגרים למחקרים in vitro. שיטה זו מספקת לנו מערכת in vitro לחקירת תפקידיהם של תאי גליה במחלות נוירולוגיות הכרוכות בשינויים פתולוגיים בתוך חוט השדרה, כגון כאב נוירופתי וטרשת נרעים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שתרביות הגליה מוכנות מחוט שדרה של עכברים בוגרים, ובכך הן מספקות מערכת המשקפת בצורה מדויקת יותר את התנאים in vivo.את הפרוצדורה תדגים ג'ניפר מאלון, טכנאית מהמעבדה שלי. בעבודה תחת מabilis תרביות רקמה, העבירו ארבעה שרירי שפיריכה של עכבר לצלוחית פטרי עם HBSS. השתמשו במספריים ופינצטה סטריליים כדי לחתוך כל אחת מהשרירי שפיריכה לחתיכות קטנות.לאחר מכן, העבירו את החלקים למבחנה קונית בנפח 50 מיליליטר המכילה תערובת אנזימים של Papain ו-DNAse. הימנעו מהעברת HBSS לתערובת האנזימים, שכן הדבר עלול להוביל לירידה בביצועי האנזים. זהו שלב קריטי שחתיכות הרקמה יעברו עיכול מלא כדי להשיג סספנסיה של תאים בודדים.עם זאת, עיכול יתר יוביל למספר מופחת של תאים חיוניים. כל מעבדה צריכה לבצע בדיקות פיילוט כדי לקבוע את זמן העיכול המדויק, בהתאם למה שעובד בצורה הטובה ביותר עבור התאים שלה. לאחר מכן, ערבבו בעדינות בעזרת וורטקס (vortex) את המבחנה ולאחר מכן דגרו ב-37 °C למשך שעה אחת עם ניעור אורביטלי ב-150 rpm.לאחר הדגירה, ער

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר את הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ מיתרי השדרה העובר ומתוחזק במבחנה או להשתלה או למחקר של שושלת oligodendrocytic.

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial...

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט לבידוד דפנות החדר הצידי ממוחו של עכבר בוגר וביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמות להשגת תאים בודדים. תאים אלה נתונים לאחר מכן לתנאי תרבית ספציפיים המשפרים באופן סלקטיבי את התפשטות תאי גזע עצביים ומקדמים את התמיינותם לתרביות משותפות של אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים.

השגת תרבית אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים מעורבת מתאי גזע עצביים של עכברים בוגרים

הסרטון הדגים את השיטה של בידוד וטיפוח תאים ממוחו של עכבר בילוד. היא כללה דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של המוח, ואחריה תרבית במצע גדילה חסר גורם גדילה עצבי כדי להשיג אוכלוסיית גלייה מעורבת.

השגת תרבית תאי גליה מעורבת ממוח עכבר יילוד

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גלייה מעורבים ראשוניים מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. הפרוטוקול כולל עיכול אנזימטי של הרקמה, ואחריו הסרת קרומי תאים שבורים ופסולת מיאלין כדי להשיג אוכלוסייה של תא יחיד. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיה המותאמת לגידול תאי גלייה מעורבים.

הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

לתאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSCs) יש תכונות אימונומודולטוריות חזקות השימושיות לטיפול במחלות הקשורות לדלקת. אנו מדגימים כיצד לבודד ולגדל בתרבית של AdMSCs ותאי גליה מעורבים ראשוניים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים אנטי דלקתיים וגורמי גדילה, להעריך הגירה של AdMSCs, ותרבית משותפת של AdMSCs עם גליה מעורבת ראשונית נגועה בפריון.

תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מתורבתים יחד עם גליה מעורבת ראשונית כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

למדו הכנת תרבויות גליה מעורבות ראשיות מחוט השדרה של עכבר מבוגר לחקר כאב נוירופתי ומחלות נוירולוגיות. שיטה זו מספקת מודל מדויק של תנאי in vivo לחקירת תפקידי תאי הגליה.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

גלה סרטונים נוספים