שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal

המטרה הכללית של מחקר זה היא לתאר טכניקה חדשה להזרקה תת-רשתית (subretinal) שניתן להשתמש בה כדי להוביל וקטורים ויראליים, סוכנים פרמקולוגיים או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים לחלל התת-רשתי בעכברים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מרכזיות בתחומי מדעי הראייה והעיניים, כגון הערכת היעילות של התערבויות טיפוליות חדשניות עבור דגנרציות של הרשתית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה להעברת חומרים לחלל התת-רשתי ביעילות גבוהה, תוך גרימת נזק מינימלי והשגת התאוששות מהירה של מבנה ותפקוד הרשתית.

את הפרוצדורה ידגים סאצ'ין פ', טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, קצצ את השפם של עכבר הרדום כדי להקל על הראות, ושמור על טמפרטורת גוף החיה ב-37 °C באמצעות פד מים במעגל סירקולציה. לאחר מכן, הרחב את אישוניו בעזרת טיפות עיניים של phenylephrine בריכוז 2.5%.

לאחר מכן, יש להשתמש בטיפות עיניים של methylcellulose למניעת יובש ולצמצום הופעת קטרקטים זמניים המושרים על ידי חומרי הרדמה. עקרו את המכשירים לפני הניתוח. לאחר מכן, הכינו את ה-fluorescein המדולל בתוך קבينة בטיחות ביולוגית.

מלאו את המזרק בכמות המתאימה של פלואורסצאין. לאחר מכן, בצעו צביטה של בהונות הרגליים כדי לוודא שהבעל החיים נמצא תחת הרדמה עמוקה, ומקמו את העכבר כך שהעין שבה תבוצע ההזרקה פונה כלפי מעלה ונראית בבירור במיקרוסקופ הדיסקציה. צבטו בעדינות את הלחמיה הרקה (temporal conjunctiva) באמצעות פינצטה בעלת קצוות דקים.

לאחר מכן, בצעו חתך היקפי של כ-90 מעלות באמצעות מספרי Vannas מעוקלים. חזרו על הפעולה על קפסולת טנון (Tenon's capsule) שמתחתיה. לאחר מכן, הסִירו את רקמת החיבור המקיפה בעזרת פינצטה בעלת קצה דק, תוך סיבוב הגלגלגל לכיוון האף (nasally).

עבדו לכיוון אתר ההזרקה במרחק של כ-0.5 מילימטרים מהעצב האופטי, והקפידו מאוד להימנע מפגיעה בסינוס הרטרו-אורביטלי (retro-orbital sinus). שלב קריטי הוא חשיפת אתר ההזרקה, הדורשת סיבוב של העין, ללא פגיעה בעין עצמה או במבנים הסמוכים לה, ובמיוחד הימנעות מפגיעה בשקיק הדם האורביטלי. בהליך זה, בצעו חתך קטן בסקלרה (lutea) באתר ההזרקה, על ידי שריטה עדינה של גלובוס העין עם להב אופתלמי של 22.5 מעלות.

חתך זה צריך להיות גדול מספיק רק כדי לאפשר לקצה המחט לעבור דרך הלובנה (sclera). לאחר מכן, הכניסו את המחט בקליבר 33 בעלת החלוץ (beveled) אל תוך הסקלרוטומיה, כאשר החלוץ פונה ומסומן במקביל לרשתית. הזריקו את הכמות הרצויה של 0.01% fluorescein על ידי לחיצה איטית ובלחץ אחיד על הבוכנה.

שימו לב שכאשר המחט נמצאת במרווח הסוב-רטינלי (subretinal space), יורגש התנגדות קלה בעת לחיצה על הבוכנה. לא תורגש התנגדות אם המחט תנקב את הרשתית, אך תורגש התנגדות גבוהה אם המחט לא תחדור את הלובן (sclera) או את ה-RPE. שלב קריטי נוסף הוא ההזרקה המכוונת למרווח הסוב-רטינלי.

יש לבצע זאת מבלי לחדור דרך הרשתית הנוירוסנסורית אל חלל הזגוגית. המתן מספר שניות לפני שליפת המחט, כדי למזער זרימה לאחור. לאחר מכן, שטוף את העין בתמיסת סליין סטרילית, וודא שהעין חזרה למנחיה הרגילים.

לאחר מכן, מרחו שכבה עבה של משחת עיניים אנטיביוטית משולשת (triple antibiotic ophthalmic cream) על פני הקרנית של העין שהוזרקה. לאחר מכן, הניחו את העכבר בכלוב נפרד ונקי לצורך התאוששות. עקבו אחר הנשימה וטמפרטורת הגוף שלו במהלך ההתאוששות מההרדמה, ובדקו כי הוא מסוגל לשמור על שכיבה על הבטן (sternal recumbency).

בצעו ניטור וטיפול פוסט-אופרטיביים מתאימים נוספים, כולל הזרקה תת-עורית של carprofen, לניהול כאב לאחר הניתוח. להלן שחזור תלת-ממדי של הבועה (bleb) בצורת כיפה באתר ההזרקה. הבועה בצורת הכיפה צבועה לאחר מכן בלבן צפוף כדי להראות את ההיקף והשוליים של היפרדות הרשתית.

ניתן לראות חתכים רוחביים של הרשתית מה-OCT בצבע לבן, בעוד שהחלל המלא בנוזל בגובה ה-RPE והפוטורספטורים מופיע בשחור. ובאיור זה, מוצגות סריקות OCTB מייצגות באתר ההתנתקות המקסימלית של הרשתית עבור לפני ההזרקה, 10 דקות לאחר ההזרקה, וארבעה שבועות לאחר ההזרקה. תמונה זו מראה את ההיווצרות והנסיגה של בלב (bleb) שטוח מהזרקה של 0.3 µL.

ותמונה זו מראה את ההיווצרות והספיגה של שלפוחית (bleb) כישומית מהזרקה של 0.5 microliter, בעוד שתמונה זו מראה את ההיווצרות והספיגה של שלפוחית כישומית מהזרקה של one microliter. לבסוף, כאן דוגמה לצלקת כישומית חמורה ולדיקוק של הרשתית באתר ההזרקה. הרשתית שומרת על תפקוד תקין לאחר ספיגת השלפוחית.

בתשע עצימויות תאורה, מוצגות צורמות הגל לתגובות המתווכות על ידי קולטנים של מוטות בתנאי סקוטופי (scotopic), לפני ההזרקה וארבעה שבועות לאחר ההזרקה, עבור הזרקות של 0.3 microliter, 0.5 microliter ו-1 microliter. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו ב-10 עד 15 דקות לכל עין. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להעריך את בריאות העיניים לפני התחלת הפעולה.

יש להוציא מהמחקר עיניים עם עכירות בקרנית או בעדשה, או עיניים שקועות שבהן הליך זה יהיה קשה מאוד לביצוע. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון OCT והדמיית קרקית כדי להעריך את איכות ההזרקה.