Name: שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal דרך בגישה אחורית Transcleral (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למד שיטת הזרקה תת-רשתית חדשנית בעכברים לטיפול בניווני רשתית. טכניקה זו מאפשרת מסירת וקטורים ויראליים ותרופות עם נזק מינימלי והחלמה מהירה של מבנה ותפקוד הרשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה על תמיכתם של הקתדרה לרפואת עיניים ע"ש הרולד ופאולין פרייס ומכון העיניים ע"ש ז'ול שטיין ל-MBG, מענק הליבה של NEI (EY00331-43) ל-SN. המחקר נתמך בחלקו על ידי תרומה נדיבה ממשפחת סקריה ל-SN ו-MGB, וממענק בלתי מוגבל מהמחקר למניעת עיוורון למחלקת העיניים. אנו מודים לשרלוט יייי וואנג מבית הספר לאופטומטריה בברקלי על קבלת תמונות OCT ראשוניות של זריקות תת-רשתית.

בעלי חיים: סוג Wild עכברים C57Bl / 6J bred באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס (UCLA). כל בעלי החיים היו בין 11 - בן 17 שבועות, וכלל זכר עכברות. כל העכברים היו שוכן קבוצה, שמור מחזור אור / חושך 12:12 עם כרצונך מזון ומים. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של UCLA והאגודה לחקר חזון הצהרת עיניים לשימוש של בעלי חי עיניים ו Vision Research. הערה: כל התרופות והסוכנים להזרקה הן ארצות הברית Pharmacopeia (USP) ציון. 1. הכנת כירורגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 100 מ&quot;ג / קילו קטמין ו xylazine 8 מ&quot;ג / קילו תערובת מלוחה. נהל הרדמה עד לעומק כך העכבר אין קמצוץ בוהן או רפלקסים מגע קרניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טמפרטורת הגוף על 37.0 מעלות צלזיוס עם כרית מים במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתרחב תלמידים עם ד עין phenylephrine 2.5%ROPs לקצץ שפם כדי להקל להדמיה. שפם לספק קלט חושי משמעותי העכבר, ולכן, זיף זמירה צריך להסיר רק את החלק כי גישה חוסמת ברורה לעין, ולא בבסיס השערה. מניסיוננו, עכברים להראות התאוששות רגילה לאחר הליך זה. החל עין methylcellulose טיפות למניעת יובש ולמזער קטרקט חולף מושרה הרדמת 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירים לפני ניתוח (כלומר, בבטאדין ואתנול או חרוזים חמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן והעמסה מדוללת (0.01% באמצעות מי מלח 0.9%) בסביבת סטרילית (כלומר, ארון בטיחות ביולוגי) אם להדמיה תבוצע (ראה סעיף 3 להלן). </li></ol> 2. הזרקת הכנת האתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין מזרק (למשל, 5 μl מזרק) עם נפח ההזרקה המתאים (למשל, 0.3 כדי 1.0 מיקרוליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר כך העין פונה כלפי מעלה נראה בבירור dissecting מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות קמצוץ הלחמית הזמני עם מלקחיים קנס היטה. לעשות חתך היקפי של כ 90 מעלות באמצעות מספרי Vannas מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.3 עם הקפסולה של שבבסיס שֶׁגֶם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות את רקמת החיבור שמסביב עם מלקחיים קנס היטה תוך סיבוב הגלובוס nasally. לפעול הזריקה כ 0.5 מ&quot;מ הזמני אל עצב הראייה. השתמש בזהירות רבה כדי למנוע שיבוש סינוס רטרו מסלולית. </li></ol> הזרקת 3. Sclerotomy ו subretinal הערה: מומלץ כי הזרקת והעמסת 0.01% ב 0.9% מלוחים לשמש כדי לסייע עם להדמיה תוך לימוד הליך זה. החלוקה הטופוגרפית של והעמסה אפשר לתעד בצורה יעילה עם הדמיה הפונדוס (ראה סעיף 4 להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך scleral קטן במקום הזרקה ידי גירוד עיינית בעדינות עם להב עיני 22.5 מעלות. שו חתך זהLD להיות גדול מספיק רק כדי לאפשר את קצה המחט לעבור דרך בלובן העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט מהשופעת 33 G (זוויתי 5 -. 10 ° לתוך sclerotomy עם שפוע פונה ובמקביל זוויתי לרשתית להזריק נפח רצוי (למשל, 0.3 ל 1.0 מיקרוליטר של 0.01% והעמיסו למטרות למידה). הערה: לשמור על סטריליות של המזרק על ידי ניקוי יסודי עם שטיפות רצופות של ממס מתאים DI מים לפני כל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוחץ על המתג לאט (מעל ~ 3 שניות) מבלי להזיז את המחט עם הפעלת לחץ. הערה: כאשר המחט נמצאת במרחב subretinal, התנגדות קלה תורגש בעוד מדכא את הבוכנה. לא יהיה התנגדות מינימאלית אם מחט מפוצצת הרשתית, עמידות גבוהה אם המחט אינה חודרת בלובן העין או רשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו כמה שניות לפני הוצאת המחט כדי למזער backflow. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העין עם בופר סטרילי ולהבטיח את h העיןכמו לסובב בחזרה למצב הרגיל שלו. </li></ol> הערכה 4. של הפרדות רשתית על ידי אוקטובר ו הפונדוס הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה אוקטובר מיד לאחר ההזרקה כדי להעריך את איכות הזריקה בשלב המתאים מצביע לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך מבנה הרשתית. הערה: דוגמאות לשימוש של אוקטובר במחקרים דומים תוארו בעבר 7,14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם וליישר את התמונה אוקטובר למקד באתר ההזרקה. הזריקה צריכה להיות קו אמצע ו -0.5 מ&quot;מ זמני אל ראש עצב הראייה. חזור לפי הצורך אם ההתנתקות היא מחוץ למסגרת או לא מרוכז בצורה אופטימלית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו היפרדות רשתית לצבוע באזור ההזרקה עם הדמיה הפונדוס en פנים 7,14. הערה: אם מערכת הדמית אוקטובר אינה זמינה, הזרקה של כמות קטנה של והעמסה עם וקטור לאימון תאפשר להדמיה עם כל מצלמת הפונדוס שמבצעת angio והעמיסgraphy באמצעות אותו אורכי גל עירור וחסימת מסננים. באזורי נקודות של קרינת Hyper יוצגו מתחת בכלי הדם ואת כלי הדם יהיו גבולות חדים וברורים ככל ששטחי subretinal הוא ממוקדים בצורה נכונה. הקצה של הבועה מן הזריקה יהיה מוגדר על ידי מעבר פיגמנטציית-יתר פלואורסצנטי הצבועה. מכשירים אחדים לספק יכולת זו העכבר; המכשור משמש כאן מתואר במקומות אחרים 14. </li></ol> טיפול 5. לאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעייל עבה של קרם עיניים אנטיביוטי משולש אל פני השטח של הקרנית של העין המוזרקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח עכברים בכלובים בודדים נקיים להתאוששות. אין לשלב עכברים שעברו ניתוח עד שהם החלימו לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג נשימה וטמפרטורה במהלך התאוששות הרדמה. צג חיות עד שהם יכולים לשמור על שכיבה sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניטור שלאחר הניתוח מתאים נוסףוטיפול, כולל הזרקה תת-עורית של carprofen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) לניהול כאב לאחר ניתוח. </li></ol> 6. הערכה של תפקוד רשתית ידי Electroretinography (ERG) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מראש הזרקת ניתוח ERG ובזמנים המתאימים לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך תפקוד הרשתית. אם נעשתה הזריקה לחלל subretinal, הפרדות הרשתית צריכות לפתור תוך 72 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקות ERG תקן לאבחון תפקוד רשתית לפני ואחרי ההזרקה כפי שתואר לעיל 14,15. </li></ol></li></ol> שחזור 3D 7. וכימות נפח בועה הערה: Oct סריקות עם ניגודיות גבוהה המקיפה את הניתוק כולו בתוך המסגרת של נוף הם אופטימליות לשימוש. ImageJ / פיג&#39;י 17,18 ו Imaris שימשו, אך ניתן להשתמש בתוכנה אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הסריקה-ב של עניין, לייבא ImageJ / פיג&#39;י היבול (תמונה&gt; Crop) את החלק של SC אוקטוברלהיות המודל באמצעות כלי הבחירה המלבני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוונון ניגודיות (תמונה&gt; התאם&gt; הבהירות / ניגודיות) להתוות שום גבולות חסרים על ידי חיבור שני חלקים עם קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר קו ישר עם כלי שורה (המשמרת מחזיקה) החובק את הרשתית לשכבת קולטי האור. מדוד (לנתח&gt; מדוד) אורך הקו כדי להשיג גודל של ניתוק מירבי צעד 7.8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבוא קצוץ מסגרות תוכנת 3D-השחזור (ראה טבלה של חומרים) באמצעות &quot;RGB לאפור&quot; תוסף ו MATLAB מהדר זמן ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל voxel (תחת מאפייני תמונה) באמצעות פרמטרים כיול מן הסריקה אוקטובר (x, y, z). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוסף &quot;RGB כדי גריי&quot; (תחת מאפייני תמונה), עם שקלול שווה כל ערוץ, כדי ליצור ערוץ רביעי. מחק ערוצים האדום-ירוק-כחול המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הערוץ האפור באמצעות שינוי הניגודיות. Image Store. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;להוסיףEW שטח &quot;כפתור על כרטיסיית 3D-View, ולהתחיל בתהליך צעד 4 מודרך יוצר את פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפירוט פני השטח (שלב 1 מתוך 4). הערה: מניסיוננו 8.0 כדי 12.0 היה הטווח היעיל ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל כדור המרבי (תחת בחירת רקע) כדי מעט פחות מגודל הניתוק המרבי שנמדד 7.1.2. צור את השטח ולבטל היפוך ערוץ אפור (שלב 2 מתוך 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סף לערך המקסימאלי כך את פני השטח של הרווחים השליליים מחוץ הרשתית ושל היחידה אינו באים במגע (שלב 3 מתוך 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הסוג מסנן למספר ווקסלים ולבודד את החלל השלילי באתר הניתוק לפי גודל. לסיים את פני השטח (שלב 4 מתוך 4). הערה: היקף שטח הניתוק ממוקם מתחת נפח בלשונית הסטטיסטיקה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li>
<li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials%3A+Safety+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285(2015).</li>
<li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
<li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3%2C+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523(2015).</li>
<li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li>
<li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li>
<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li>
<li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+%28LCA%29+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li>
<li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li>
<li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li>
<li>Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li>
<li>Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li>
<li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
</ol>

לאף אחד מהכותבים אין גילויים מסחריים.

זריקות subretinal הן את שיטת בחירה עבור המשלוח של וקטורים ויראליים גזע טיפול תאים שמקורם מניפולציה קולטני אור ואת הרשתית הוא במחקר בסיסי טיפול מרפאתי. בחולים, זריקות subretinal נעשים בדרך כלל עם sclerotomy הקדמי ליד פלאנה Pars, vitrectomy הליבה האחורי וחדירה של הרשתית על ידי מחט עם להדמיה ישירה. כמו במרבית ההליכים vitrectomy, זה נפוץ היווצרות קטרקט להתרחש בטרם עת, אלא אם העין היא כבר pseudophakic. בעכברים, זריקות subretinal נעשות באופן מסורתי עם קדמי sclerotomy לרשתית, שיטה קשורה ...

זריקות subretinal הן האמצעי העיקרי של אספקת סוכנים הסלולר ויראלי אל הרשתית של עכברים ללמוד והשפיע על קולטני אור ואת 1,2 שבבסיס הרשתית. רוב פרוטוקולי הזרקת subretinal בעכברים להשתמש transcorneal או קדמי זריקת transcleral לקו המשווה (איור 1). גישה זו יכולה לגרום נזק סביבתי הגלום הכולל שסחב ו ערפול כתוצאה של העדשה, שיבוש של שלמות, חדירה הזגוגית של הרשתית הנוירו ואיריס, דימום ברשתית, היפרדות רשתית משמעותי ובצקת subretinal קיימא 3-9. מניפולציות ניסוייות חייבות להתגבר על תופעות אלה על מנת להעריך את ההשפעות של התערבויות טיפוליות 3,7,10,11. מחקר זה מספק תיאור מפורט ואימות של שיטת הזרקה אחורית transcleral כי תמנע סיבוכים אלה, ממזער טראומה בעל שיעור הצלחה גבוה של מיקוד המשנהשטח הרשתית. זריקות מיקוד במרחב subretinal בעכברים הן בדרך כלל מאוד קשות לביצוע רוב החוקרים נתקלים בתדירות גבוהה של ניסיונות כושלים שבו הווקטור מועבר על מיקום לא נכון או שיש פגיעה ברשתית משמעותית, למשל היפרדות רשתית מלאה 6. מספר העיניים מחוץ ניתוח עקב סיבוכי הזרקת בדרך כלל אינו מדווח במחקרי עכבר, אבל הניסיון שלנו והן בדיון עם חוקרים אחרים, מספר זריקות נכשלו יכולה להיות גבוהים ככל 50% ולגוון תלוי הניסיון יכולות של החוקר שמבצע את הזריקות. ההצלחה של ההזרקה נבחנת בדרך כלל על ידי הדמיה הפונדוס ישירה ו / או טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) 7,9. שיטה לשלוט בקלות עם שיעורי הצלחה גבוהים עבור זריקות subretinal בעכברים יכול לזרז ניסויים ולהפחית את העלות של מחקרים פרה של טרהatments למחלות רשתית כי הם הגורמים העיקריים לעיוורון בארצות הברית. האחורי, טכניקת הזרקת subretinal transcleral המתוארת כאן היא עיבוד פרוטוקולים קליניים פרה-קליניים 9,12. הערכות האבחנתיות פולשנית שבוצעו עכברים שהוזרקו להדגים ניזק עדין מאוד מקומי וחסרי עדשה בטוחה נוספת ברשתית ופגיעת רשתית. יתר על כן, עם קצת אימון יחסית, נסיין יכול להשיג את התוצאות הללו עם שיעור הצלחה גבוה (80 - 90% או יותר), ובכך להפחית את העלויות הכרוכות מחקרים כאלה. הליך זה יכול לשמש כדי לספק הסלולר, ויראלי, או התערבויות טיפוליות תרופתיות כדי קולטני אור ו / או רשתית במחקרים פרה-קליניים להעריך התערבויות ניסיוני בקלות.

<table><tbody><tr><td>המילטון דגם 62 RN SYR</td><td>המילטון</td><td>87942</td><td>מזרק x 1</td></tr><tr><td>מחט המילטון 33 גרם, 1.0 אינץ', 20 מעלות, נקודה 3 (304 נירוסטה)</td><td>המילטון</td><td>7803-05</td><td>מחטים x 6</td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים של Vannas</td><td>טד פלה, INC.</td><td>1347</td><td>5 מ"מ להב</td></tr><tr><td>22.5 מעלות סכין מיקרו-כירורגיה</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>קטג'קט&nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>קטמין</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>קסילזין</td></tr><tr><td>פלואורסצאין 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>0.9% מי מלח USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>משחה אנטיביוטית</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td></td></tr><tr><td>מי עיניים משאבת מחזור</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T / משאבה&nbsp;</td><td>מקט יצרן 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת פונדוס</td><td>מסחרית מעבדות מחקר פניקס</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מסוג 3</td><td>טד פלה, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% פנילפרין</td><td>פרגון BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>עיניים Bitplane</td><td></td><td>גרסה 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&nbsp; 2.5%</td> <td>Goniovisc</td><td>AX0401</td> טיפות עיניים <td>מתיל צלולוז</td></tr><tr><td>(שטיפה)</td><td>Bausch & תמיסת מלח Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>מקור אור</td></tr></tbody></table>

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal<i&gt; דרך</i&gt; בגישה אחורית transcleral

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

זריקות subretinal שימשו בהצלחה בשני בני אדם ומכרסמים לספק התערבויות טיפוליות של חלבונים, סוכנים ויראלי, ותאי לתא interphotoreceptor / subretinal כי יש חשיפה ישירה קולטני האור ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). זריקות subretinal של plasminogen וכן ניסויים פרה-קליניים וקליניים האחרונים הוכיחו בטיחות ו / או יעילות של מתן וקטורים ויראליים ותאי גזע ליחידים עם מחלת רשתית מתקדמת. מודלים עכבר של מחלת רשתית, במיוחד dystrophies רשתית תורשתי, חיוניים לבדיקת לטיפולים אלה. הליך ההזרקה הנפוץ ביותר במכרסמים הוא להשתמש transcorneal הקטן או חתכי transcleral עם גישה קדמית לרשתית. עם גישה זו, מחט הזריקה חודר הרשתית הנוירו לשבש את הרשתית הבסיסית ועל החדרת יכול בקלות ניק העדשה, גרימת עכירות העדשה וירידת ערך Imagi פולשניתng. גישה למרחב subretinal באמצעות transcleral, גישה אחורית תמנע בעיות אלה: המחט חוצה את בלובן העין כ 0.5 מ&quot;מ מן עצב הראייה, ללא חדירת רשתית ונמנעה לשבש את הזגוגית. נזק סביבתי מוגבל כי הקשורים מוקדי sclerotomy ואת ההשפעות של חולף, היפרדות רשתית הצפק. הפשטות של השיטה ממזער פגיעה עינית, מבטיחה שחיבור רשתית מהיר והתאוששות, ויש לו שיעור כישלון נמוך. הניזק המינימאלי רשתית הרשתית מאפשר הערכה ברורה של יעילויות התרופות ותופעות ישירות של הסוכנים הטיפוליים עצמם. כתב יד זה מתאר טכניקת ההזרקה subretinal הרומן, שניתן להשתמש בהם כדי למקד וקטורים ויראליים, סוכני תרופתי, תאי גזע או גזע מושרים (iPS) תאים למרחב subretinal בעכברים עם יעילות גבוהה, נזק מינימלי, והתאוששות מהירה.

אחורי גישת זריקות subretinal transcleral בוצעו ב -31 עיני בריאות מ -16 עכברים פראיים סוג עם זריקות של 0.3 μl (n = 18), 0.5 μl (n = 8) ו 1.0 מיקרוליטר (n = 5) של והעמסת 0.01%. עין אחת לא נכללה הזרקה בשל אטימות קרניות קיימות שמנעו ניתוח מבני ותפקודי. כל עין מוזרקת נכללת בדוח זה. אין היפרדות רשתית לא מכוונת, דקירות של רשתית הנוירו, או דליפה לתוך הזגוגית אותרו ולא הייתה שום ראיה של nicking עדשה, תגובות דלקתיות, אובאיטיס, או לאחר ניתוח זיהומים בכל עיניי...

זריקות תת-רשתית הן הטכניקה הנפוצה ביותר להעברת חומרים טיפוליים גדולים כגון חלבונים ווקטורים נגיפיים לקולטני האור ולאפיתל הפיגמנט ברשתית. שיטה חלופית בעכברים המכוונת בהצלחה לחלל התת-רשתית עם נזק אגבי מינימלי וזמני התאוששות מהירים מתוארת כאן.

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal<i&gt; דרך</i&gt; בגישה אחורית Transcleral

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

המטרה הכללית של מחקר זה היא לתאר טכניקה חדשה להזרקה תת-רשתית (subretinal) שניתן להשתמש בה כדי להוביל וקטורים ויראליים, סוכנים פרמקולוגיים או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים לחלל התת-רשתי בעכברים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מרכזיות בתחומי מדעי הראייה והעיניים, כגון הערכת היעילות של התערבויות טיפוליות חדשניות עבור דגנרציות של הרשתית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה להעברת חומרים לחלל התת-רשתי ביעילות גבוהה, תוך גרימת נזק מינימלי והשגת התאוששות מהירה של מבנה ותפקוד הרשתית.את הפרוצדורה ידגים סאצ'ין פ', טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, קצצ את השפם של עכבר הרדום כדי להקל על הראות, ושמור על טמפרטורת גוף החיה ב-37 °C באמצעות פד מים במעגל סירקולציה. לאחר מכן, הרחב את אישוניו בעזרת טיפות עיניים של phenylephrine בריכוז 2.5%.לאחר מכן, יש להשתמש בטיפות עיניים של methylcellulose למניעת יובש ולצמצום הופעת קטרקטים זמניים המושרים על ידי חומרי הרדמה. עקרו את המכשירים לפני הניתוח. לאחר מכן, הכינו את ה-fluorescein המדולל בתוך קבينة בטיחות ביולוגית.מלאו את המזרק בכמות המתאימה של פלואורסצאין. לאחר מכן, בצעו צביטה של בהונות הרגליים כדי לוודא שהבעל החיים נמצא תחת הרדמה עמוקה, ומקמו את העכבר כך שהעין שבה תבוצע ההזרקה פונה כלפי מעלה ונראית בבירור במיקרוסקופ הדיסקציה. צבטו בעדינות את הלחמיה הרקה (temporal conjunctiva) באמצעות פינצטה בעלת קצוות דקים.לאחר מכן, בצעו חתך היקפי של כ-90 מעלות באמצעות מספרי Vannas מעוקלים. חזרו על הפעולה על קפסולת טנון (Tenon's capsule) שמתחתיה. לאחר מכן, הסִירו את רקמת החיבור המקיפה בעזרת פינצטה בעלת קצה דק, תוך סיבוב הגלגלגל לכיוון האף (nasally).עבדו לכיוון אתר ההזרקה במרחק של כ-0.5 מילימטרים מהעצב האופטי, והקפידו מאוד להימנע מפגיעה בסינוס הרטרו-אורביטלי (retro-orbital sinus). שלב קריטי הוא חשיפת אתר ההזרקה, הדורשת סיבוב של העין, ללא פגיעה בעין עצמה או במבנים הסמוכים לה, ובמיוחד הימנעות מפגיעה בשקיק הדם האורביטלי. בהליך זה, בצעו חתך קטן בסקלרה (lutea) באתר ההזרקה, על ידי שריטה עדינה של גלובוס העין עם להב אופתלמי של 22.5 מעלות.חתך זה צריך להיות גדול מספיק רק כדי לאפשר לקצה המחט לעבור דרך הלובנה (sclera). לאחר מכן, הכניסו את המחט בקליבר 33 בעלת החלוץ (beveled) אל תוך הסקלרוטומיה, כאשר החלוץ פונה ומסומן במקביל לרשתית. הזריקו את הכמות הרצויה של 0.01% fluorescein על ידי לחיצה איטית ובלחץ אחיד על הבוכנה.שימו לב שכאשר המחט נמצאת במרווח הסוב-רטינלי (subretinal space), יורגש התנגדות קלה בעת לחיצה על הבוכנה. לא תורגש התנגדות אם המחט תנקב את הרשתית, אך תורגש התנגדות גבוהה אם המחט לא תחדור את הלובן (sclera) או את ה-RPE. שלב קריטי נוסף הוא ההזרקה המכוונת למרווח הסוב-רטינלי.יש לבצע זאת מבלי לחדור דרך הרשתית הנוירוסנסורית אל חלל הזגוגית. המתן מספר שניות לפני שליפת המחט, כדי למזער זרימה לאחור. לאחר מכן, שטוף את העין בתמיסת סליין סטרילית, וודא שהעין חזרה למנחיה הרגילים.לאחר מכן, מרחו שכבה עבה של משחת עיניים אנטיביוטית משולשת (triple antibiotic ophthalmic cream) על פני הקרנית של העין שהוזרקה. לאחר מכן, הניחו את העכבר בכלוב נפרד ונקי לצורך התאוששות. עקבו אחר הנשימה וטמפרטורת הגוף שלו במהלך ההתאוששות מההרדמה, ובדקו כי הוא מסוגל לשמור על שכיבה על הבטן (sternal recumbency).בצעו ניטור וטיפול פוסט-אופרטיביים מתאימים נוספים, כולל הזרקה תת-עורית של carprofen, לניהול כאב לאחר הניתוח. להלן שחזור תלת-ממדי של הבועה (bleb) בצורת כיפה באתר ההזרקה. הבועה בצורת הכיפה צבועה לאחר מכן בלבן צפוף כדי להראות את ההיקף והשוליים של היפרדות הרשתית.ניתן לראות חתכים רוחביים של הרשתית מה-OCT בצבע לבן, בעוד שהחלל המלא בנוזל בגובה ה-RPE והפוטורספטורים מופיע בשחור. ובאיור זה, מוצגות סריקות OCTB מייצגות באתר ההתנתקות המקסימלית של הרשתית עבור לפני ההזרקה, 10 דקות לאחר ההזרקה, וארבעה שבועות לאחר ההזרקה. תמונה זו מראה את ההיווצרות והנסיגה של בלב (bleb) שטוח מהזרקה של 0.3 µL.ותמונה זו מראה את ההיווצרות והספיגה של שלפוחית (bleb) כישומית מהזרקה של 0.5 microliter, בעוד שתמונה זו מראה את ההיווצרות והספיגה של שלפוחית כישומית מהזרקה של one microliter. לבסוף, כאן דוגמה לצלקת כישומית חמורה ולדיקוק של הרשתית באתר ההזרקה. הרשתית שומרת על תפקוד תקין לאחר ספיגת השלפוחית.בתשע עצימויות תאורה, מוצגות צורמות הגל לתגובות המתווכות על ידי קולטנים של מוטות בתנאי סקוטופי (scotopic), לפני ההזרקה וארבעה שבועות לאחר ההזרקה, עבור הזרקות של 0.3 microliter, 0.5 microliter ו-1 microliter. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו ב-10 עד 15 דקות לכל עין. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להעריך את בריאות העיניים לפני התחלת הפעולה.יש להוציא מהמחקר עיניים עם עכירות בקרנית או בעדשה, או עיניים שקועות שבהן הליך זה יהיה קשה מאוד לביצוע. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון OCT והדמיית קרקית כדי להעריך את איכות ההזרקה.

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

מקור: Park, S. W., et al. גישה לימבלית - הזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לטיפול גנטי באפיתל פיגמנט רשתית של עכברים. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מתאר את השיטה להזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לאפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) במודל עכבר. הוא מפרט את ההליך מהרדמה והכנת עיניים ועד לאספקה מדויקת של וקטור לנטי-ויראלי, מה שמבטיח אינטגרציה וביטוי גנים ב-RPE.

הזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לאפיתל פיגמנט הרשתית במודל עכבר

מקור: Parikh, S., et al. שיטת הזרקה חלופית ומאומתת לגישה לחלל התת-רשתית באמצעות גישה אחורית טרנסקלרלית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את ההליך להעברת צבע פלואורסצנטי לחלל התת-רשתית של עכבר. התהליך כולל הרדמת העכבר, הכנת העין, ביצוע חתכים מדויקים לגישה לחלל התת-רשתית והזרקת הצבע ליצירת היפרדות רשתית מבוקרת. טכניקה זו מאפשרת אספקה ממוקדת של הצבע, ומאפשרת הדמיה מפורטת וניתוח של מבני הרשתית.

אספקת צבע פלואורסצנטי לחלל התת-רשתית של עכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

הזרקה תת-רשתית היא טכניקה כירורגית להעברת גנים יעילה לאפיתל פיגמנט הרשתית בעין העכבר.  כאן אנו מתארים שיטה קלה וניתנת לשכפול להזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לאפיתל פיגמנט רשתית בעכברי ניסוי.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להזרקה תוך-מצלמה בחולדות באמצעות חתך מרכזי בקרנית ומנהרה ארוכה לתוך החדר הקדמי. שיטת הזרקה זו ממזערת את הסיכון לגרימת נזק לא מכוון לרקמות ובכך משפרת את הדיוק והשחזור.

הזרקה תוך-מצלמה בחולדות עם סיכון נמוך לתופעות לוואי

מאמר זה מתאר שיטות להזרקה תת-רשתית בחולדות, תוך שימוש בהדמיה תוך ניתוחית כדי לשלוט הן באתר ההזרקה והן באזור היפרדות הרשתית.

הדמיה תוך ניתוחית של הזרקה תת-רשתית והיפרדות רשתית בחולדות

מחקר זה מציג מתודולוגיה להעברת טיפולים לרשתית ולעצבי הראייה של החולדה הבוגרת. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לאחזור רקמות לאיסוף מלמעלה למטה של עצב הראייה והרשתית בחולדה בוגרת.

מתן טיפולי בעיניים ושליפת רקמות מתקדמת בחולדות בוגרות

זריקות תת-רשתית הן טכניקה הכרחית לפיתוח פרה-קליני של טיפולים למחלות קולטני אור ו-RPE. אנו מתארים טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית אופטימלית בעכברים המשפרת את שיעורי ההצלחה תוך ניתוחיים וממזערת נזק לרשתית.

טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית זעיר פולשנית אופטימלית בעכבר

למד שיטת הזרקה תת-רשתית חדשנית בעכברים לטיפול בניווני רשתית. טכניקה זו מאפשרת מסירת וקטורים ויראליים ותרופות עם נזק מינימלי והחלמה מהירה של מבנה ותפקוד הרשתית.

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal

גלה סרטונים נוספים