Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב C. elegans

המטרה הכוללת של פרוטוקול מוטגנזה זה היא להשתמש במערך LED פשוט כדי לבצע מוטגניזציה של ה-DNA הגנומי של C.elegans המבטאים חלבוני מחולל חמצן תגובתי תלויי אור כחול. שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם אחד, פרוטוקול המוטגנזה הוא פשוט מאוד ואינו דורש את הכימיקלים הרעילים. ושנית, מחולל המוטגנזה מוכיח את עצמו לאחר מוטציה ארוכה.

לראשונה יש לי את הרעיון לשיטה זו, ואני מבין שמעולם לא נעשה שימוש בחלבונים המייצרים ROS כדי לגרום למוטציות תורשתיות. לצורך ניסוי זה, חבר את הבקר של מכשיר תאורת ה-LED למחולל פונקציות דיגיטלי באמצעות כבל BNC. בעזרת מחזיק מותאם אישית, אבטח את נורות ה-LED 10 סנטימטרים מעל הבמה.

כעת, כסו חלקית את ההגדרה כדי להגביל את חשיפת האור הכחול לסביבה, אך לא עד כדי כך שהחום יצטבר על הבמה. כאן נעשה שימוש בכיסוי פלסטיק קשיח בהתאמה אישית עם חלק עליון ותחתית פתוחים. במהלך פעולת ה-LED, הרכיבו תמיד משקפי מגן לייזר או משקפי שמש, מכיוון שהאור בהיר מאוד.

כעת, העבר את הידית של בקר ה-LED לפנימי, והגדר אותו ל-65% מההספק המרבי שלו. בעזרת פוטומטר, כוונו את עוצמת האור במידת הצורך, כך שעל הבמה, הוא יהיה 2.0 מילי-וואט למילימטר רבוע במהלך תאורה רציפה. עבור פרוטוקול זה, שמור על הזן הרגיש לאור בחושך בתנאים סטנדרטיים.

יש להימנע מחשיפה מיותרת לאור, אך שימוש שגרתי במנורת הלוגן למעבר, אינו גורם למוטציות. מכיוון שמוטציה מקרית היא דאגה, הקפיאו כמויות של הזן כאשר הן מתקבלות לראשונה. עבור המוטגנזה, הכינו נייר סינון שיתאים לצלחת של 60 מילימטר עם חור מרובע של כ-25 מילימטר במרכז, והניחו אותו על צלחת לא זרועה.

לאחר מכן, פזרו 100 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי נחושת כלוריד באופן שווה על נייר הסינון כדי למנוע מהתולעים לעזוב את החור המרובע. כעת, מתוך צלחת תולעים, שנמצאות כ-12 שעות לאחר שלב L4 שלהן, בחרו את ההרמפרודיטים הבוגרים הצעירים והכניסו אותם לריבוע המרכזי בצלחת. לאחר מכן, הפעל את הנורית ואת מחולל הפונקציות.

לאחר מכן, העבר את בקר ה-LED לחיצוני כדי לשלוט בו באמצעות מחולל הפונקציות, והגדר את הכוח בהתאם. ממחולל הפונקציות, הפק גל סינוס ב -4 הרץ. כעת, העבירו את הצלחת לבמה והאירו את התולעים באור כחול למשך 30 דקות.

מיד לאחר הטיפול העבירו את כל התולעים הבריאות למראה לצלחת זרעים. תולעים אלו ייראו לא מתואמות לאחר הטיפול הקל, אך הן יתאוששו. שמור את התולעים שטופלו באור בחושך.

מאוחר יותר, בדוק אם יש מורפולוגיות או התנהגויות חריגות בצאצאי F2 הבוגרים. סריקה גנטית קדמית בוצעה באמצעות הטכניקה המתוארת עבור 60 לוחות F1, המתאימים ל-120 גנומים הפלואידים מוטגניים. שמונה מתוך 60 לוחות F1 עם תולעי F2 הציגו פנוטיפים גלויים, כגון מבנה גוף, תנועה לא מתואמת או קטלניות של מבוגרים.

הצאצאים של תולעי F2 אלה שמרו על הפנוטיפים הנצפים הללו. מספר המוטציות הגלויות ממסך זה מצביע על כך שהזן וההגדרה פועלים כראוי עבור מוטגנזה אופטוגנטית. ניתן לבצע את הליך המוטגנזה תוך שעה.

אנא תיהנו משיטת המוטגנזה המהירה והבטוחה.