Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב C. elegans
14 בנובמבר 2016
גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.
המטרה הכוללת של פרוטוקול מוטגנזה זה היא להשתמש במערך LED פשוט כדי לבצע מוטגניזציה של ה-DNA הגנומי של C.elegans המבטאים חלבוני מחולל חמצן תגובתי תלויי אור כחול. שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם אחד, פרוטוקול המוטגנזה הוא פשוט מאוד ואינו דורש את הכימיקלים הרעילים. ושנית, מחולל המוטגנזה מוכיח את עצמו לאחר מוטציה ארוכה.
לראשונה יש לי את הרעיון לשיטה זו, ואני מבין שמעולם לא נעשה שימוש בחלבונים המייצרים ROS כדי לגרום למוטציות תורשתיות. לצורך ניסוי זה, חבר את הבקר של מכשיר תאורת ה-LED למחולל פונקציות דיגיטלי באמצעות כבל BNC. בעזרת מחזיק מותאם אישית, אבטח את נורות ה-LED 10 סנטימטרים מעל הבמה.
כעת, כסו חלקית את ההגדרה כדי להגביל את חשיפת האור הכחול לסביבה, אך לא עד כדי כך שהחום יצטבר על הבמה. כאן נעשה שימוש בכיסוי פלסטיק קשיח בהתאמה אישית עם חלק עליון ותחתית פתוחים. במהלך פעולת ה-LED, הרכיבו תמיד משקפי מגן לייזר או משקפי שמש, מכיוון שהאור בהיר מאוד.
כעת, העבר את הידית של בקר ה-LED לפנימי, והגדר אותו ל-65% מההספק המרבי שלו. בעזרת פוטומטר, כוונו את עוצמת האור במידת הצורך, כך שעל הבמה, הוא יהיה 2.0 מילי-וואט למילימטר רבוע במהלך תאורה רציפה. עבור פרוטוקול זה, שמור על הזן הרגיש לאור בחושך בתנאים סטנדרטיים.
יש להימנע מחשיפה מיותרת לאור, אך שימוש שגרתי במנורת הלוגן למעבר, אינו גורם למוטציות. מכיוון שמוטציה מקרית היא דאגה, הקפיאו כמויות של הזן כאשר הן מתקבלות לראשונה. עבור המוטגנזה, הכינו נייר סינון שיתאים לצלחת של 60 מילימטר עם חור מרובע של כ-25 מילימטר במרכז, והניחו אותו על צלחת לא זרועה.
לאחר מכן, פזרו 100 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי נחושת כלוריד באופן שווה על נייר הסינון כדי למנוע מהתולעים לעזוב את החור המרובע. כעת, מתוך צלחת תולעים, שנמצאות כ-12 שעות לאחר שלב L4 שלהן, בחרו את ההרמפרודיטים הבוגרים הצעירים והכניסו אותם לריבוע המרכזי בצלחת. לאחר מכן, הפעל את הנורית ואת מחולל הפונקציות.
לאחר מכן, העבר את בקר ה-LED לחיצוני כדי לשלוט בו באמצעות מחולל הפונקציות, והגדר את הכוח בהתאם. ממחולל הפונקציות, הפק גל סינוס ב -4 הרץ. כעת, העבירו את הצלחת לבמה והאירו את התולעים באור כחול למשך 30 דקות.
מיד לאחר הטיפול העבירו את כל התולעים הבריאות למראה לצלחת זרעים. תולעים אלו ייראו לא מתואמות לאחר הטיפול הקל, אך הן יתאוששו. שמור את התולעים שטופלו באור בחושך.
מאוחר יותר, בדוק אם יש מורפולוגיות או התנהגויות חריגות בצאצאי F2 הבוגרים. סריקה גנטית קדמית בוצעה באמצעות הטכניקה המתוארת עבור 60 לוחות F1, המתאימים ל-120 גנומים הפלואידים מוטגניים. שמונה מתוך 60 לוחות F1 עם תולעי F2 הציגו פנוטיפים גלויים, כגון מבנה גוף, תנועה לא מתואמת או קטלניות של מבוגרים.
הצאצאים של תולעי F2 אלה שמרו על הפנוטיפים הנצפים הללו. מספר המוטציות הגלויות ממסך זה מצביע על כך שהזן וההגדרה פועלים כראוי עבור מוטגנזה אופטוגנטית. ניתן לבצע את הליך המוטגנזה תוך שעה.
אנא תיהנו משיטת המוטגנזה המהירה והבטוחה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול למוטגנזה המשתמש ב-histone-miniSOG מקודד גנטית כדי להשרות מוטציות תורשתיות ברחבי הגנום באופן התלוי באור כחול. השיטה היא פשוטה, מהירה ונקייה מחומרים כימיים רעילים, מה שהופך אותה לאידיאלית לסריקה גנטית קדימה (forward genetic screening) ולהחדרת טרנסגנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנטיקה
- מדעי המוח
- מוטגנזה
רקע
- חלבונים מקודדים גנטית יכולים לייצר מיני חמצן רהאקטיביים (ROS).
- שיטות קודמות להשראת מוטציות כוללות לעיתים קרובות כימיקלים רעילים.
- מחקר זה בוחן גישה חדשנית למוטגנזה תורשתית.
- C. elegans משמש כאורגניזם המודל עבור פרוטוקול זה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול פשוט למוטגנזה באמצעות אור כחול.
- הדגמת היעילות של חלבונים המייצרים ROS בהשראת מוטציות.
- סיוע בביצוע סריקה גנטית קדימה (forward genetic screening) ובשילוב טרנס-גנים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש במערך LED פשוט לצורך מוטגנזה.
- חיבור מאיר LED לגנרטור פונקציות דיגיטלי.
- קיבוע נורות ה-LED מעל הבמה באמצעות מחזיק מותאם אישית.
- תצפית על השפעות המוטגנזה ב-C. elegans.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של מוטציות תורשתיות ברחבי הגנום.
- הדגמה של שיטת מוטגנזה שאינה רעילה.
- תיקוף של הטכניקה עבור סריקה גנטית קדימה (forward genetic screening).
- פוטנציאל לשילוב טרנסגנים באמצעות שיטה זו.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע גישה פשוטה ואפקטיבית למוטגנזה.
- מוטגנזה תלוית אור כחול היא טכניקה מבטיחה למחקרים גנטיים.
- שיטה זו יכולה לקדם את המחקר בגנטיקה ובביולוגיה מולקולרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
מוטגנזה אקראית אופטוגנטית באמצעות histone-miniSOG ב-C. elegans מאפשרת שינוי גנומי מהיר ותורשתי ללא שימוש בכימיקלים מסוכנים, ובכך מייעלת את תהליכי הגילוי המוקדמים. גישה זו תומכת בסריקה גנטית בקיבולת גבוהה (high-throughput) ובשילוב טרנסגנים, תוך הפחתת חסמים תפעוליים והגברת הגמישות של סל הפעולות. הבטיחות והפשטות שלה ממצבות אותה ככלי בר-הרחבה לגנומיקה תפקודית ותיקוף מטרות במחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה שיטתית של תפקוד גנים באמצעות סריקה גנטית קדימה (forward genetic screening).
- מסייע בזיהוי של מסלולים חדשים ומודיפיקטורים גנטיים הרלוונטיים למודלים של מחלות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי יצירת וריאנטים אלליים מגוונים למחקרים מכניסטיים.
- משפר את הביטחון החיזוי בבחירת מטרה על ידי מתן אפשרות למוטגנזיס בלתי מוטה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק מערכת מתוקף וניתנת לשחזור ליצירת ספריות מוטנטים ב-C. elegans.
- מבטל סיכונים כימיים, ובכך מפשט את סטנדרטיזציית הבדיקה והעמידה בתקני המעבדה.
- מאפשר הכנה מהירה של אוכלוסיות מגוונות גנטית עבור סריקות פנוטיפיות עוקבות.
- תומך בתהליכי עבודה ניתנים להרחבה ומוכנים לפלטפורמה לצורך הערכת תרכובות ומחקרי אינטראקציה גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם לפיתוח מודלים רלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות למוטגנזה ממוקדת ולהחדרת טרנסגן.
- מאפשר רצף מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף פרה-קליני באורגניזמי מודל.
- תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי אספקת כלים גנטיים חזקים להפחתת סיכונים מכניסטית.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת מוטגנזה אופטוגנטית זו משתלבת בשלבי הגילוי המוקדמים ובשלבי התיקוף של המטרה, ותומכת בזיהוי מועמדים מובילים ובפיתוח מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: מאיצה את בדיקת ההשערות ואת פענוח המסלולים באמצעות מוטגנזה בלתי מוטה.
- סריקה: מספקת תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור לבחירת מוטנטים וניתוח פנוטיפי.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של פנוטיפים של מוטנטים ויעילות שילוב של טרנסגנים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין גילוי גנטי לאופטימיזציה של מודלים פרה-קליניים ב-C. elegans.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה רב-פעמית ולא רעילה לסריקה גנטית מתמשכת ופיתוח כלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון בחיזוי ואת תיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות למוטגנזה רחבה ללא משתנים כימיים מבלבלים.
- ערך תפעולי: מגביר את הבטיחות במעבדה, את הסטנדרטיזציה ואת התפוקה על ידי ביטול השימוש בריאגנטים מסוכנים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות יעילה של go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות כלים גנטיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום גמיש של תוכניות לגילוי גנטי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של C. elegans ובהקמה של מערכות אופטוגנטיקה.
- נדרשת תשתית תאורה של LED ופרוטוקולי בטיחות מעבדה בסיסיים לחשיפה לאור.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה למערכות מודל אחרות עם מבנים אופטוגנטיים תואמים.
- תלוי בטיפול זהיר כדי למנוע מוטציות בלתי מכוונות המושרות על ידי אור.
