Name: לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: חקור את השפעת הכיח והאנטיביוטיקה על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאי coverglass. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה וניתוח כמותי של שינויים בארכיטקטורת הביופילם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TB מודה מלגת מחקר מקנדה סיסטיק פיברוזיס.

שים לב מועצת האתיקה מחקר (REB) נדרש לאסוף ולאחסן דגימות כיח מ בבני אדם. מחקרים אלה אושרו על ידי בית החולים לילדים REB # 1000019444. 1. הכנת דוגמאות כיח CF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף מדגם ליחה מחול במהלך ביקורים שיגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הובלת ליחה המדגם על הקרח במהלך השעה הראשונה של האוסף, למעבדת מחקר, לעבור עיבוד. </li></ol> 2. עיבוד כיח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את עוצמת הקול של מדגם הליחה שהושג. להוסיף בופר פוספט (PBS) כדי 2x היקף המדגם (כלומר, 2 חלקים PBS, מדגם חלק 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדגם היטב עם טפטפת ההעברה. וורטקס המדגם על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 1 דקות לערבב לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל של תערובת הנ&quot;ל לתוך הצינורות מספר 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge המתאים ומסובב ב 5000 XG עבור20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר את supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאסוף בתוך שפופרת microcentrifuge נקי. הערה: עקרות של תסנין נבחנות על ידי ציפוי על אגרת LB וכך גם ייחס תקשורת נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן supernatant כיח ב -80 ° C לשימוש עתידי. הערה: כיח מחולים רבים יכולים גם להיות ונקווה לאחר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, לדלל כיח תסנין 1/10 V / V (100 μl של ליחה, 900 μl של תקשורת) בתקשורת רצויה. הערה: כאן, lysogeny מרק סטנדרטי (LB) בתקשורת היה בשימוש. </li></ol> 3. תאיים coverglass שיטה ליצירת biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול לבודד בקטריאלי של לילה עניין התקשורת הרצוי על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (200 סל&quot;ד). הערה: מספר חיידקים שונים שימשו, כולל קליני מבודד Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia מורכבים cepacia ו Achromobacter xylosoxidans. בחירה של תקשורת תלוי זנים ותנאי ריבית, אולם תקשורת LB יכולה לשמש בניסויים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתרבים הלילה, להציב 40 μl של התרבות לתוך 4 מיליליטר של תקשורת הטריה לגדול במשך 3-4 שעות ב 37 ° C עם רועד (200 סל&quot;ד) להשיג תרבות עם צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כ 0.5 -0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבות משלב 3.2 ל 1/5 במדיה הרצויים עם 10% כיח תסנין או ללא תסנין ליחה (כמו שליטה). ריכוז אחר של תסנין כיח ניתן לבדוק (כלומר, 50% או 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 200 μl של דילול זרע בארות של תאי שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לחיידקים לצרף במשך 4 שעות ב 37 ° C בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, להסיר את התקשורת לשטוף בעדינות את biofilm עם תקשורת הטריה 1x. חלף עם 200 μl תקשורת טריה. הערה: כדי לחקור את ההשפעות של ליחה על ביופילם, את fresh התקשורת צריכה לכלול supernatant ליחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר biofilms לגדול במשך פרק הזמן הרצוי על 37 מעלות צלזיוס ללא רעד, החלפת התקשורת בכל 12 שעות, בלי לשטוף עד הפעם עבור במיקרוסקופ. הערה: כדי לחקור את ההשפעה של supernatants כיח על רגישות לאנטיביוטיקה ביופילם, אנטיביוטיקה מתווספת המדיה הבאות 24 שעות של צמיחת biofilm ומתוחזקים בתקשורת עד מכתים והדמיה של biofilms. </li></ol> Biofilms מכתים 4. מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זמן צמיחה רצוי (HR 24-48 עובד הכי טוב), להסיר תקשורת מבארת קאמרי לשטוף בעדינות כל תא פעמים עם 300 μl של PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תערובת מכתימה עבור ביופילם על ידי ערבוב 1 μl של כל צבע (המסופק בערכה הכדאית) עבור כל מיליליטר של פתרון הנדרש. הפוך צבע בתמיסת מים או תקשורת. הערה: מים מומלצים על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של תערובת לצבוע היטב כל תאיים coverglass דגירה בטמפרטורת החדר, בחושך במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור תערובת מכתימה מהלשכה ולשטוף היטב עם כל 300 μl של PBS סטרילית. הסר PBS ולהחליף עם מים או תקשורת טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם ויזואליזציה של biofilms באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 5. חזותי Biofilms עם מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא biofilms מוכתם בתאי מיד לאחר מכתים (בתוך שעה 1). מזער את העיכוב להדמיה של השקופיות על ידי צביעת 1 עד 2 תאים 8-גם בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם לייזרים לערכות עירור מסנן עבור הרכישה. הערה: כאן, confocal הדיסק מסתובב המערכת עם לייזרים זוהרים ספקטרלי (גרין: 491nm, אדום: 561 ננומטר) שמשה עירור. סינוני פליטת 515/40 ו 624/40 שמשו כדי להמחיש את הכתמים מתוך ההערכה הכדאית ביופילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות באמצעות מטרת מי 25x על מיקרוסקופ confocal עם מצלמה. </li><li&gt; השתמש Z- ערימות מנת ליצור מודל של ביופילם. צלמו תמונות בכל 0.5-1 מיקרומטר החל מהמטוס ב-המוקד הראשון למסגרת פוקוס האחרון של ביופילם (בדרך כלל פורש 30-80 מיקרומטר עבור 48 biofilms hr) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3-5 תמונות מכל טוב. הערה: כך עבור 8 גם מחולק לתאי coverglass, 24-40 תמונות תופקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תמונות לניתוח. הערה: התמונה צריכה להיות נשמר כמו שת-TIFF קבצים לנתח באמצעות לסטטמ&quot;מ 18,19. הוראות לניתוח תמונה biofilm ניתן למצוא בכתובת http://www.comstat.dk/. ברגע תמונות מיובאות, פרמטרים כגון עובי ממוצע, ביומסה כיסוי שטח לכל ערוץ (אדום וירוק) ניתן לנתח. </li></ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation%3A+a+clinically+relevant+microbiological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
<li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li>
<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
<li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Adv%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).</li>
<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
 . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVorregaard%2C+M+%22Informatics+and+Mathematical+Modelling%22">Informatics and Mathematical Modelling</a>. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

אף לא אחד.

השיטות שתוארו במסמך זה לאפשר להדמיה של biofilms החיידקים גדל בנוכחות מוצרים אקסוגניים. באופן לא מפתיע, את הייצור של exoproducts הוא בעל חשיבות בעת שימוש בסוג זה של המערכת. למשל, Dithiothreitol (DTT), משמש לעתים קרובות על דגימות כיח אדם לעזור למוסס את הדגימות. עם זאת, ההשפעה של DTT לבדו יכול להקטין פיתוח biofilm ואת הכדאיות (מידע לא מוצג). לפיכך, בקרות נאותות עבור כל התנאים הדרושים. יתר על כן, התוספת של מוצרי ליחה אנושיים יוצרת את שוני פנימי על הניסוי בשל העובדה כי הליחה של כל מטופ...

biofilms חיידקים הם קבוצות של מיקרואורגניזמים מחוברים זה לזה עטוף מטריצה-מופרש עצמי. 1,2 קלסי, הם מייצגים חיידקים מחוברים פיזי משטח אביוטי או ביוטיים שנוצר בתנאים של זרימה. Biofilms גם הוכח לגדול בתנאים סטטיים (העדר זרימה) ו דיסטלי ממשטחים, כגון בממשק הנוזל אוויר של ברכות תרמיות או pellicles נוצרו במבחנות. biofilms אלה כבר מזמן מוכר בסביבה והם לרעת משמעותיים בתהליכים תעשייתיים, כפי שהם יכולים להיווצר מאגרי מים או בצינורות, וכתוצאה מכך biofouling, קורוזיה חסימות. 3,4 Biofilms הוא גם קריטי גדרות בריאות, כפי שהם הוכחו להיות מעורבי זיהומים הקשורים קטטר, דלקות ריאות בחולי סיסטיק פיברוזיס, כמו גם זיהומים רבים אחרים. 5,6 אחד מסימני ההיכר של זיהומים ביופילם הוא דהמקומט רגישות של חיידקים לאנטיביוטיקה ולקוי אישור על ידי מערכת החיסון המולדת. 7-9 למדו הכי טוב, תרחישים רלוונטיים קליני מעורבי זיהום מבוסס ביופילם מתרחשים בחולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), אשר נגועים באופן כרוני עם Pseudomonas aeruginosa biofilms. פ aeruginosa יכול לעבור מספר שינויים במהלך הקמת זיהום כרוני זה עושה את זה קשה מאוד לטיפול. 10,11 Biofilms יכול להפעיל מולדת חסינה ולנסוע דלקת דיפרנציאלי. 12-14 כמו זיהומים אלו מובילים לתחלואה ולתמותה מוגברות בחולי CF, חשוב להבין גורמים שיכולים להשפיע על התפתחות biofilm בהקשר זה. מחקר שנערך לאחרונה עולה כי גורמי מארח הם קריטיים ההיווצרות של אגרגטים ביופילם פ aeruginosa. 15 biofilms אלה תורמים רגישים מופחתים אנטיביוטיקה ומנגנוני הגנה מארחת. preseNCE גורמים מארחים נגזר, כגון אלסטט נויטרופילים, כמו גם מוצרים מופרשים מיקרואורגניזמים נוכחות ריאות CF, יש פוטנציאל לווסת היווצרות והתפתחות ביופילם מאוד. 16 בנוסף, biofilms אינטראקציה עם המארח לווסת ביטוי של מסלולים רבים וליזום דלקת. בעוד שיטות תפוקה גבוהה, כגון assay סגול קריסטל רגיל, יכול לספק קצת מידע לגבי תהליך ביופילם, להדמיה של biofilm בתגובה הגורמים הללו לספק יותר מידע מעמיק. בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לשימוש גורמים מן הליחה של חולי CF כדי ללמוד על ההתפתחות של biofilms במבחנה. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מהירה של biofilms חשופה לגורמי מארח המכיל כיח באמצעות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות ויזואלית שינויים המתרחשים במהלך צמיחת biofilm בנוכחות exogenoלנו מוצרים, ומייצג שיטה משופרת לנתח את השינויים בפיתוח ביופילם בתנאים שונים.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Chambered Coverglass, #1.5 בורוסיליקט, 8 בארות</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer ערכת Viabilty ביופילם חי/מת Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>צלחות אגר דם</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>אישור כדאיות באמצעות ספירת CFU או בחירת מושבות לחיסון</td></tr><tr>תוכנת<td>COMSTAT</td><td>זמינה באינטרנט</td><td></td><td>COMSTAT היא תוכנה לניתוח תמונות ביופילם. זמין www.comstat.dk&nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>מדיה סטנדרטית לגידול לילה / ביופילם</td></tr><tr><td>מסנני מזרק Millex-GV Millipore</td><td></td><td>SLGV013SL</td><td>סינון של סופרננטים של</td></tr><tr><td>ליחה פוספט חוצץ מלח (Dulbecco A)</td> <td>BR0014G אוקסואיד</td><td></td><td>שטיפת תאי ביופילם לאחר הסרת מדיה</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרל בוראליס</td><td>Qs טכנולוגיות בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרקין אלמר Volocity</td><td>QS טכנולוגיות בע"מ</td><td></td><td>הוראות לתוכנה זו ניתן למצוא בכתובת: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms מורכב קבוצות של חיידקים עטופים מטריצה-מופרש עצמי. הם משחקים תפקיד חשוב זיהום תעשייתי כמו גם בפיתוח וההתמדה של זיהומים רבים הקשורים לבריאות. אחד biofilms תיאר הכי טוב ולמד מחלות אנושיות מתרחשת דלקת ריאות כרונית של חולי סיסטיק פיברוזיס. כאשר לומדים biofilms בהקשר של המארח, גורמים רבים יכולים להשפיע היווצרות והתפתחות ביופילם. על מנת לזהות כיצד גורמי מארח עשויים להשפיע היווצרות ביופילם ופיתוח, השתמשנו בשיטת coverglass חדרים סטטי לגדול biofilms בנוכחות גורמים נגזרים מארחים בצורת supernatants ליחה. חיידקים הם זורעים לתוך תאי וחשוף filtrates ליחה. בעקבות 48 שעות של צמיחה, biofilms מגואלות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית לפני מיקרוסקופיה וניתוח confocal. בעקבות רכישת תמונה, תכונות biofilm ניתן להעריך באמצעות פלטפורמות תוכנה שונות.שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין תכונות מפתח של צמיחת biofilm בנוכחות של חומרים שונים כולל אנטיביוטיקה.

העיצוב הכללי של הניסוי מיוצג באיור 1. השימוש בפרוטוקול זה מספק שיטה נוחה כדי להמחיש את השינויים biofilms גדל במשך תקופות זמן שונות (למשל, 24, 48 או 72 שעות). חשוב לציין, אותות אקסוגניים, כגון ליחה filtrates, ניתן להוסיף כדי להמחיש את השינויים בפיתוח ביופילם. כפי שניתן לראות באיור 2, בנוכחות filtrates כיח 10% יכול לשנות את הארכיטקטורה של ביופילם (איור 2A, לוחות נמוך). 16 תמונות א...

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של התפתחות הביופילם לאחר חשיפה לגורמי מארח באמצעות מודל תא שקופיות. מודל זה מאפשר הדמיה ישירה של התפתחות ביופילם וכן ניתוח פרמטרים של ביופילם באמצעות תוכנות מחשב.

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים וכמת שינויים בביופילמים בתגובה לליחה ולאנטיביוטיקה. שיטה זו יכולה לשמש חוקרים כדי להבין שאלות מפתח, כגון כיצד נוכחותה של ליחה עשויה להשפיע על היעילות של אנטיביוטיקות שונות נגד ביופילמים חיידקיים. היתרון המרכזי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מאפשרת לאנשים לראות שינויים המתרחשים בביופילמים בתגובה לגורמים שונים.כדי להתחיל בניסוי, רשמו את נפח דגימת הליחה שהושגה קודם לכן. הוסיפו תמיסת סליין מרוכזת בבופר פוספט, או PBS, בכמות השווה לפעמיים מנפח הדגימה. לאחר מכן, השתמשו בפיפט העברה כדי לערבב את הדגימה ביסודיות.ערבלו את הדגימה במערבל Vortex בהגדרה הגבוהה ביותר למשך דקה אחת כדי לערבב אותה באופן מלא. העבירו מנה (Aliquot) של 1 מיליליטר מהתערובת לשפופרות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, סובבו את השפופרות בצנטריפוגה (Spin down).לאחר הצנטריפוגה, שמרו את העלייה (supernatant) והשליכו את המשקע (pellet). סננו את העלייה לסטריליזציה באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון ואספו אותה למבחנה נקייה למיקרוצנטריפוגה. שמרו את העלייה של הליחה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.העבירו 40 µL של תרבית שהוכנה מראש לתוך 4 mL של מצע Luria broth טרי, או מצע LB, וגדלו את החיידקים עד לקבלת תרבית בעלת צפיפות אופטית (OD) של 0.55 ב-600 nm. לאחר מכן, דללו 100 µL מתרבית ב-0.5 OD לתוך 400 µL של סינוני ליחה (sputum filtrates) בריכוז 10% שהוכנו ב-LB. השתמשו ב-200 µL מהדלול להזריעה בבארות של תאי השקף. אפשרו לחיידקים להיקשר למשך ארבע שעות ב-37 °C ללא ניעור.לאחר ארבע שעות, הסירו את המצע ושטפו בעדינות את הביופילם ב-1X LB טרי. החליפו את המצע הנותר ב-200 microliters של LB טרי. אפשרו לביופילמים לגדול בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ללא ניעור. החליפו את המצע בכל 12 שעות ללא שטיפה עד שהביופילם יהיה מוכן למיקרוסקופיה. חשוב מאוד לשטוף את השקופיות בעדינות כדי לא להפריע לחיידקים המודבקים.לאחר הצמיחה, יש להסיר את המצע מבארות התאים ולשטוף בעדינות כל תא פעמיים עם 300 µL של PBS סטרילי. לאחר מכן, כדי להכין את תערובת הצביעה של הביופילם, יש להוסיף מיקרוליטר אחד מכל צבע המסופק בערכת הבדיקה (viability kit) לכל מיליליטר של תמיסה נדרשת ולערבב את התמיסה. הכמות האופטימלית של הצבע וזמן הצביעה נקבעים באופן אמפירי עבור כל אורגניזם.הוסיפו 200 µL מתערובת הצביעה לכל באער של זכוכית הכיסוי בעלת התאים. דגרו את זכוכית הכיסוי. לאחר הדגירה, הסירו את תערובת הצביעה מהתאים ושטפו כל באער עם 300 µL של PBS סטרילי.החליפו את ה-PBS במצע טרי. לבסוף, המשיכו לוויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. תמונות מייצגות של בידודים קליניים של Burkholderia cepacia complex, או BCC, לאחר 48 שעות של צמיחה בזכוכית כיסוי עם תאי דגימה במצע בלבד או בנוכחות 10% מסנני ליחה, מדגימות כי נוכחותם יכולה לשנות את ארכיטקטורת הביופילם.התמונות נותחו באמצעות תוכנת Comstat כדי להשיג פרמטרים מרכזיים של הביופילם, כולל העובי הממוצע של הביופילם, אשר עלה בעקבות טיפול ב-10% sputum. כדי להעריך את השפעת הגורמים השונים על צמיחת הביופילם, בידודים קליניים גודלו במצע בלבד או עם sputum, וכל אחד מהם טופל עם או ללא אנטיביוטיקה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן היצירה והטיפול בביופילמים על זכוכית כיסוי עם תאים (chambered cover glass) והכנתם לצביעה ולניתוח קונפוקאלי.

visualizing-effects-sputum-on-biofilm-development-using-chambered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר שיטות שונות של...

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

מאמר זה מתאר את הליך הקמת ויזואליזציה של biofilm חיידקי גדל בתוך שקופית 8-גם...

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

מקור: בודואן, ט. ואחרים. המחשת השפעות הליחה על התפתחות ביופילם באמצעות מודל זכוכית כיסוי עם תאים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את השימוש בזכוכית כיסוי תאית לחקר השפעת גורמי מארח ליחה שמקורם בחולה בפיברוזיס ציסטיק על התפתחות ביופילם חיידקיים.

שיטת זכוכית כיסוי תאית להיווצרות ביופילם חיידקי במבחנה

מקור: בודואן, ט. ואחרים. המחשת השפעות הליחה על התפתחות ביופילם באמצעות מודל זכוכית כיסוי עם תאים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים שיטה במבחנה כדי להעריך כיצד ליחת סיסטיק פיברוזיס שמקורה במטופל משפיעה על יצירת ביופילם חיידקים. באמצעות שקופיות תא, צביעה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא חושף עובי מוגבר, ארכיטקטורה משתנה וביומסה בוגרת ערך גבוהה יותר בביופילמים שגודלו בליחה, ומדגיש את תפקיד רכיבי המארח בעיצוב התפתחות הביופילם.

הדמיה קונפוקלית של ביופילמים חיידקיים שנגרמו על ידי ליחה מתנדלקת אצל חולי סיסטיק פיברוזיס

נדונים פרוטוקולים לחקר היווצרות ביופילם במכשיר מיקרופלואידי, המחקה מדיה נקבובית. המכשיר המיקרופלואידי מורכב ממערך של מיקרו-עמודים והיווצרות ביופילם על ידי Pseudomonas fluorescens במכשיר זה נחקרת.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

דרכי הנשימה המחוברות לריר של חולי סיסטיק פיברוזיס (CF) הן סביבה אידיאלית לפטוגנים חיידקים לשגשג. כתב היד מתאר שיטה חדשה לחקר מיקרוביום הריאות CF בסביבה שבה מחקה את המחלה, וכיצד שינויים בתנאים כימיים יכולים להניע דינמיקה מיקרוביאלית.

מודל ה- WinCF - מיקרוסקוס הזול והבלתי נסבל של ברונכייל מחובר ריר לחקר המיקרוביולוגיה של זיהומי ריאות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

אנו מתארים את מכלול, המבצע, ועוצב ניקוי של מנגנון זרימה כדי התמונה פטרייתי ביופילמים בזמן אמת בזמן תחת זרימה. אנחנו גם מספקים ולדון אלגוריתמים כמותיים כדי לשמש על תמונות נרכשות.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

שינויים אנטי-מיקרוביאליים בארכיטקטורת הביופילם Pseudomonas aeruginosa שונים בין מבודדים קליניים שגודלו בתרבית מחולים עם סיסטיק פיברוזיס וזיהום ריאתי כרוני. לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להשתמש בתוכנת COMSTAT כדי לכמת וריאציות בארכיטקטורת ביופילם (למשל, שטח פנים, עובי, ביומסה) עבור מבודדים בודדים כדי להעריך את היעילות של חומרים אנטי זיהומיים.

כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT

חקור את השפעת הכיח והאנטיביוטיקה על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאי coverglass. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה וניתוח כמותי של שינויים בארכיטקטורת הביופילם.

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

גלה סרטונים נוספים