לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass
14 בדצמבר 2016
פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של התפתחות הביופילם לאחר חשיפה לגורמי מארח באמצעות מודל תא שקופיות. מודל זה מאפשר הדמיה ישירה של התפתחות ביופילם וכן ניתוח פרמטרים של ביופילם באמצעות תוכנות מחשב.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת שינויים בביופילמים בתגובה לכיח ואנטיביוטיקה. שיטה זו יכולה לשמש חוקרים כדי להבין שאלות מפתח, כגון כיצד היעילות של אנטיביוטיקות שונות נגד ביופילמים חיידקיים יכולה להיות מושפעת מנוכחות ליחה. היתרון העיקרי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מאפשרת לאנשים לראות שינויים המתרחשים בביופילמים בתגובה לגורמים שונים.
כדי להתחיל בניסוי, רשום את נפח דגימת הליחה שהושגה בעבר. הוסף מי מלח עם חוצץ פוספט, או PBS, הוסף פי שניים מנפח הדגימה. לאחר מכן, השתמש בפיפטת העברה כדי לערבב היטב את הדגימה.
מערבל את הדגימה בהגדרה הגבוהה ביותר למשך דקה אחת כדי לערבב אותה לגמרי. יש לצרף מיליליטר אחד מהתערובת לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. ואז סובב את הצינורות.
לאחר הצנטריפוגה, שמור את הסופרנטנט והשליך את הגלולה. מסנן לעקר את הסופרנטנט דרך מסנן 0.22 מיקרון ולאסוף אותו בצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי. אחסן את נוזל הליחה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
מניחים 40 מיקרוליטר של תרבית שהוכנה בעבר לארבעה מיליליטר של מרק לוריא טרי, או מדיה LB, ומגדלים את החיידקים לקבלת תרבית עם צפיפות אופטית של 0.55 ב-600 ננומטר. לאחר מכן, יש לדלל 100 מיקרוליטר של תרבית 0.5 OD ל-400 מיקרוליטר של תסנני כיח מוכנים של 10% ב-LB. השתמש ב -200 מיקרוליטר של הדילול כדי לזרוע את הבארות של תאי המגלשות. הניחו לחיידקים להיצמד במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד.
לאחר ארבע שעות, הסר את המדיה ושטוף בעדינות את הביופילם ב-1X LB טרי. החלף את המדיה הנותרת ב-200 מיקרוליטר של LB טרי. אפשרו לביופילם לגדול ב-37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. החלף את המדיה כל 12 שעות ללא כביסה עד שהביופילם מוכן למיקרוסקופיה. חשוב מאוד לשטוף בעדינות את המגלשות כדי לא לשבש חיידקים מחוברים.
לאחר הצמיחה, הסר את המדיה מבארות התא ושטוף בעדינות כל תא פעמיים עם 300 מיקרוליטר PBS סטרילי. לאחר מכן, כדי להכין את תערובת צביעת הביופילם, הוסף מיקרוליטר אחד מכל צבע המסופק בערכת הכדאיות לכל מיליליטר של תמיסה הדרושה וערבב את התמיסה. הכמות האופטימלית של זמן הצבע והצביעה נקבעת באופן אמפירי עבור כל אורגניזם.
הוסף 200 מיקרוליטר מתערובת הצביעה לכל באר של זכוכית הכיסוי החדרית. דגרו את זכוכית הכיסוי. לאחר הדגירה, הוציאו את תערובת הצביעה מהתאים ושטפו כל באר עם 300 מיקרוליטר PBS סטרילי.
החלף את ה-PBS במדיה חדשה. לבסוף, המשך בהדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. תמונות מייצגות של קומפלקס Burkholderia cepacia, או מבודדים קליניים של BCC, לאחר 48 שעות של צמיחה בזכוכית כיסוי תא עם מדיה בלבד או בנוכחות 10% תסנני כיח מדגימים כי נוכחותם יכולה לשנות את הארכיטקטורה של הביופילם.
התמונות נותחו באמצעות תוכנת Comstat כדי לקבל פרמטרים מרכזיים של ביופילם, כולל העובי הממוצע של הביופילם, שהוגדל כאשר טופלו ב-10% ליחה. על מנת להעריך את השפעות הגורמים השונים על צמיחת הביופילם, מבודדים קליניים גודלו במדיה בלבד או עם כיח וטופלו עם או בלי אנטיביוטיקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד ליצור ולטפל בביופילמים על זכוכית כיסוי תא ולהכין אותם לניתוח מכתים וקונפוקלי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הוויזואליזציה והכימות של התפתחות ביופילם בתגובה לליחה ולאנטיביוטיקה באמצעות מודל תא שקופית. מודל זה מאפשר תצפית ישירה על שינויים בביופילם ומאפשר ניתוח מפורט באמצעות תוכנה ממוחשבת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- מחקר ביופילמים
- יעילות אנטיביוטית
רקע
- ביופילמים הם קהילות מורכבות של מיקרואורגניזמים.
- הבנת תגובת הביופילם לאנטיביוטיקה היא קריטית לאסטרטגיות טיפול.
- ליחה עשויה להשפיע על יעילותן של אנטיביוטיקות נגד ביופילמים.
- מחקר זה נועד להמחיש אינטראקציות אלו באופן יעיל.
מטרת המחקר
- לוויזואליזציה של שינויים בביופילמים כתוצאה מחשיפה לליחה ולאנטיביוטיקה.
- לכימות השפעתם של גורמי מאכסן על התפתחות הביופילם.
- להעמקת ההבנה בנוגע ליעילות של אנטיביוטיקה נגד ביופילמים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- איסוף דגימות ליחה.
- דילול של הליחה בעזרת תמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS).
- ערבוב הדגימות להשגת אחידות.
- ויזואליזציה של התפתחות הביופילם באמצעות מודל תא זכוכית (slide chamber).
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה ישירה של שינויים בביופילם כמענה לאנטיביוטיקה.
- ניתוח כמותי של פרמטרי ביופילם.
- תובנות לגבי האינטראקציה בין ליחה לבין תגובת הביופילם.
- הדגמה של יעילותן של אנטיביוטיקות שונות.
מסקנות
- מודל תא השקופית יעיל לחקר דינמיקה של ביופילם.
- גורמי מאכסן, כגון ליחה, משפיעים באופן משמעותי על התנהגות הביופילם.
- מתודולוגיה זו עשויה להנחות אסטרטגיות עתידיות לטיפול אנטיביוטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה כמותית של התפתחות ביופילם בנוכחות ליחה המופקת ממארח ואנטיביוטיקה נותנת מענה לאתגר קריטי בגילוי תרופות אנטי-אינפקטיביות ובדיוק של מודלים תרגומיים. גישה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי חשיפת האופן שבו גורמי מארח מווסתים את יעילות האנטיביוטיקה ואת ארכיטקטורת הביופילם, ובכך מספקת מידע לאסטרטגיות של סריקה ותיקוף מטרות בשלבים מוקדמים. השיטה תומכת בביטחון חיזוי לצורך קבלת החלטות לגבי פורטפוליו במחקר ופיתוח של מחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות בנוגע להשפעת גורמי המארח על עמידות הביופילם.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות תגובת הביופילם לאנטיביוטיקה במטריצות הרלוונטיות למחלה.
- מקל על תיקוף של מטרות תפקודיות על ידי מדידת חיוניות ומבנה הביופילם תחת תנאים מוגדרים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות ביופילם שעברו תיקוף לבדיקה של תרכובות בהמשך, בנוכחות גורמים בעלי רלוונטיות קלינית.
- מנstandardizes תנאי הבדיקה לצורך הדירות והשוואה כמותית בין הזרועות הניסיוניות.
- מייצר פלטים כמותיים חסונים, כגון עובי הביופילם וחיוניות, לצורך הערכה אמינה של התרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מודלים של ביופילם in vitro לסביבות מאכסן הרלוונטיות למחלה, ובכך משפר את הרצף התרגומי.
- תומך בהקדמה מותאמת-סיכון על ידי חשיפת ביצועי האנטיביוטיקה במטריצות ביולוגיות מורכבות.
- מספק תובנה מכניסטית לגבי אינטראקציות בין המאכסן, הפתוגן והתרופה לצורך הפחתת סיכונים חיזויית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל זכוכית כיסוי עם תאים זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-השערות של יעילות אנטיביוטית במערכות ביופילם המדמות מאחסן.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות לגבי השפעת גורמי מאכסן והבהרת מסלולים בפיתוח ביופילם.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך תיעדוף תרכובות בהקשרי ביופילם.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מבוססות תמונה ופלטים סטטיסטיים להשוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים על ידי שילוב מטריצות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להתאמה להערכה חוזרת של אסטרטגיות אנטי-ביופיליות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר ופיתוח של תרופות אנטי-אינפקטיביות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות ביופילם.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) ויעילות הון על ידי חשיפת יעילות תרופתית התלויה בהקשר.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מועמדים מותאם סיכון על בסיס ביצועים במערכות המדמות מאכסן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול ביופילם, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח כמותי של תמונות.
- נדרשת גישה למערכות של כיסורי זכוכית עם תאי דגימה (chambered coverglass), ערכות לצביעת חיוניות ותוכנות ניתוח כגון Comstat.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות והדמיה.
- עשוי לדרוש התאמה עבור מינים שונים של חיידקים או מטריצות ממקור מאכסן.
- תלוי באופטימיזציה אמפירית של פרמטרי הצביעה וההדמיה עבור כל אורגניזם.
