לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass
December 14th, 2016
פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של התפתחות הביופילם לאחר חשיפה לגורמי מארח באמצעות מודל תא שקופיות. מודל זה מאפשר הדמיה ישירה של התפתחות ביופילם וכן ניתוח פרמטרים של ביופילם באמצעות תוכנות מחשב.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת שינויים בביופילמים בתגובה לכיח ואנטיביוטיקה. שיטה זו יכולה לשמש חוקרים כדי להבין שאלות מפתח, כגון כיצד היעילות של אנטיביוטיקות שונות נגד ביופילמים חיידקיים יכולה להיות מושפעת מנוכחות ליחה. היתרון העיקרי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מאפשרת לאנשים לראות שינויים המתרחשים בביופילמים בתגובה לגורמים שונים.
כדי להתחיל בניסוי, רשום את נפח דגימת הליחה שהושגה בעבר. הוסף מי מלח עם חוצץ פוספט, או PBS, הוסף פי שניים מנפח הדגימה. לאחר מכן, השתמש בפיפטת העברה כדי לערבב היטב את הדגימה.
מערבל את הדגימה בהגדרה הגבוהה ביותר למשך דקה אחת כדי לערבב אותה לגמרי. יש לצרף מיליליטר אחד מהתערובת לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. ואז סובב את הצינורות.
לאחר הצנטריפוגה, שמור את הסופרנטנט והשליך את הגלולה. מסנן לעקר את הסופרנטנט דרך מסנן 0.22 מיקרון ולאסוף אותו בצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי. אחסן את נוזל הליחה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
מניחים 40 מיקרוליטר של תרבית שהוכנה בעבר לארבעה מיליליטר של מרק לוריא טרי, או מדיה LB, ומגדלים את החיידקים לקבלת תרבית עם צפיפות אופטית של 0.55 ב-600 ננומטר. לאחר מכן, יש לדלל 100 מיקרוליטר של תרבית 0.5 OD ל-400 מיקרוליטר של תסנני כיח מוכנים של 10% ב-LB. השתמש ב -200 מיקרוליטר של הדילול כדי לזרוע את הבארות של תאי המגלשות. הניחו לחיידקים להיצמד במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד.
לאחר ארבע שעות, הסר את המדיה ושטוף בעדינות את הביופילם ב-1X LB טרי. החלף את המדיה הנותרת ב-200 מיקרוליטר של LB טרי. אפשרו לביופילם לגדול ב-37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. החלף את המדיה כל 12 שעות ללא כביסה עד שהביופילם מוכן למיקרוסקופיה. חשוב מאוד לשטוף בעדינות את המגלשות כדי לא לשבש חיידקים מחוברים.
לאחר הצמיחה, הסר את המדיה מבארות התא ושטוף בעדינות כל תא פעמיים עם 300 מיקרוליטר PBS סטרילי. לאחר מכן, כדי להכין את תערובת צביעת הביופילם, הוסף מיקרוליטר אחד מכל צבע המסופק בערכת הכדאיות לכל מיליליטר של תמיסה הדרושה וערבב את התמיסה. הכמות האופטימלית של זמן הצבע והצביעה נקבעת באופן אמפירי עבור כל אורגניזם.
הוסף 200 מיקרוליטר מתערובת הצביעה לכל באר של זכוכית הכיסוי החדרית. דגרו את זכוכית הכיסוי. לאחר הדגירה, הוציאו את תערובת הצביעה מהתאים ושטפו כל באר עם 300 מיקרוליטר PBS סטרילי.
החלף את ה-PBS במדיה חדשה. לבסוף, המשך בהדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. תמונות מייצגות של קומפלקס Burkholderia cepacia, או מבודדים קליניים של BCC, לאחר 48 שעות של צמיחה בזכוכית כיסוי תא עם מדיה בלבד או בנוכחות 10% תסנני כיח מדגימים כי נוכחותם יכולה לשנות את הארכיטקטורה של הביופילם.
התמונות נותחו באמצעות תוכנת Comstat כדי לקבל פרמטרים מרכזיים של ביופילם, כולל העובי הממוצע של הביופילם, שהוגדל כאשר טופלו ב-10% ליחה. על מנת להעריך את השפעות הגורמים השונים על צמיחת הביופילם, מבודדים קליניים גודלו במדיה בלבד או עם כיח וטופלו עם או בלי אנטיביוטיקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד ליצור ולטפל בביופילמים על זכוכית כיסוי תא ולהכין אותם לניתוח מכתים וקונפוקלי.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה והכימות של התפתחות ביוממברנה בתגובה לכיח ואנטיביוטיקה באמצעות מודל של תא שקופיות. מודל זה מאפשר תצפית ישירה על שינויים בביוממברנה ומאפשר ניתוח מפורט באמצעות תוכנת מחשב.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- מחקר ביוממברנה
- יעילות אנטיביוטיקה
רקע
- ביוממברנות הן קהילות מורכבות של מיקרואורגניזמים.
- הבנת התגובה של ביוממברנה לאנטיביוטיקה חיונית לאסטרטגיות טיפול.
- כיח יכול להשפיע על יעילות האנטיביוטיקה כנגד ביוממברנות.
- מחקר זה שואף להדגים את האינטראקציות הללו בצורה יעילה.
מטרת המחקר
- להדגים שינויים בביוממברנות כתוצאה מחשיפה לכיח ואנטיביוטיקה.
- לכמת את השפעת גורמי המארח על התפתחות הביוממברנה.
- לשפר את ההבנה של יעילות האנטיביוטיקה נגד ביוממברנות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות כיח.
- דילול כיח עם מלח פוספט מזורק (PBS).
- ערבוב דגימות לאחידות.
- הדמיה של התפתחות ביוממברנה באמצעות מודל של תא שקופיות.
תוצאות עיקריות
- תצפית ישירה על שינויים בביוממברנות בתגובה לאנטיביוטיקה.
- ניתוח כמותי של פרמטרים של ביוממברנה.
- תובנות לגבי האינטראקציה בין כיח והתגובה של הביוממברנה.
- הדגמה של יעילות אנטיביוטיקה שונים.
מסקנות
- מודל תא השקופיות יעיל לחקר הדינמיקה של ביוממברנות.
- גורמי מארח כמו כיח משפיעים באופן משמעותי על התנהגות הביוממברנה.
- מתודולוגיה זו יכולה לספק מידע לגבי אסטרטגיות טיפול אנטיביוטיקה עתידיות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of biofilm development in the presence of host-derived sputum and antibiotics addresses a critical challenge in anti-infective discovery and translational model fidelity. This approach enables mechanistic de-risking by revealing how host factors modulate antibiotic efficacy and biofilm architecture, informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for portfolio decisions in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding host factor influence on biofilm resilience.
- Supports biological de-risking by quantifying biofilm response to antibiotics in disease-relevant matrices.
- Facilitates functional target validation by measuring biofilm viability and architecture under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biofilm systems for downstream compound screening in the presence of clinically relevant factors.
- Standardizes assay conditions for reproducibility and quantitative comparison across experimental arms.
- Generates robust, quantitative outputs such as biofilm thickness and viability for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant host environments, enhancing translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing antibiotic performance in complex biological matrices.
- Provides mechanistic insight into host-pathogen-drug interactions for predictive de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This chambered coverglass model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of antibiotic efficacy in host-mimetic biofilm systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on host factor impact and pathway clarification in biofilm development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound prioritization in biofilm contexts.
- Analytics: Provides image-based measurements and statistical outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by incorporating disease-relevant matrices.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated evaluation of anti-biofilm strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective R&D.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of biofilm assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by revealing context-dependent drug efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on performance in host-mimetic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biofilm culture, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to chambered coverglass systems, viability staining kits, and analytical software such as Comstat.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different bacterial species or host-derived matrices.
- Dependent on empirical optimization of staining and imaging parameters for each organism.
