לדמיין את רקמות Interrenal Steroidogenic ו microenvironment הדם שלה דג הזברה
December 21st, 2016
בלוטת interrenal דג הזברה היא עמיתו teleostean של בלוטת יותרת הכליה היונקת. פרוטוקול זה מציג כיצד לבצע את dehydrogenase 3-β-hydroxysteroid (איזומראז Δ 5-4; 3β-HSD) assay הפעילות האנזימטית, אשר מזהה תאים steroidogenic הבדיל של דג הזברה פיתוח.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות תאים סטרואידוגניים בין-כלייתיים מובחנים בדג הזברה המתפתח באמצעות בדיקת פעילות אנזימטית פשוטה שלמה. הליך צביעה זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות למנגנונים המולקולריים והתאיים של היווצרות ומום בבלוטות הבין-כליות. היתרון העיקרי של בדיקת צביעה זו הוא שהיא מהירה, פשוטה ואמינה, מה שהופך אותה לכלי רב עוצמה לבדיקות גנטיות או כימיות בדגי הזברה.
ניתן לבצע הליך זה על קווי דיווח פלואורסצנטיים טרנגניים, המסמנים את הכליה וכלי הדם כך שניתן יהיה לנתח רקמות מרובות באותו עובר. בשילוב עם חתך ויברטום, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן גם לדמיין את המיקרו-סביבה של כלי הדם של הרקמה הבין כליתית. לאחר הכנת פתרונות מלאי לשלושה צביעת פעילות בטא-HSD על פי פרוטוקול הטקסט, הנח עוברי דג זברה מתפתחים ב-0.03% PTU במי ביצה כדי לעכב היווצרות פיגמנט.
תקן עוברים מפורקים, או זחלים, ב-2% או 4% PFA ב-PBS עם 0.1% טווין 20, או PFAT. עם PBST, שטפו את העוברים ארבע פעמים במשך 10 דקות כל אחד, וודאו שהדגימות לא יתייבשו בין השטיפות. לפני תגובות הצביעה, הכינו טרי את חלקים A ו-B בצינורות נפרדים, ואז מערבולת וצנטריפוגה את התמיסות.
חיוני להכין חלקים A ו-B בצינורות נפרדים. הוספת כל הרכיבים ישר לצינור אחד בודד תגרום למשקעים קשים מיד. הוסף את כל הצינור של חלק A לכל הצינור של חלק B.מערבבים היטב, ומיד מחלקים מיליליטר אחד לכל צינור מיקרופוגה המכיל עוברים קבועים ושטופים.
השתמש בנייר אלומיניום כדי לעטוף את הצינורות, והניח אותם בטמפרטורת החדר על מסובב או על פלטפורמת נדנדה עם ניעור עדין. קבע באופן אמפירי את זמן התגובה באמצעות מיקרוסקופ לניטור אותות כרומוגניים. עם הזמן יתפתחו משקעים קלים שלא יפריעו לתהליך התגובה.
עצור את התגובה על ידי שימוש ב-PBST כדי לשטוף את העוברים ארבע פעמים למשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן לתקן את העוברים המוכתמים ב-4% PFAT בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות. למיקרוסקופיה שלמה, השתמש ב-50% גליצרול ב-PBS כדי לנקות את העוברים. לאחר מכן, לאחר כיוונם כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה, התבונן בדגימות באמצעות מיקרוסקופ זקוף תחת תאורת שדה בהירה.
הסר חלמון מהעובר והשתמש בו להכנת תושבת שטוחה. לאחר מכן, צלם תמונה ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה של הרקמה הבין כליתית. כדי לנתח את המיקרו-סביבה של כלי הדם של הרקמה הסטרואידוגנית, יש לתקן את העוברים המוכתמים ב-2% PFA.
הוסיפו לו 1% טריטון X-100 בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה, והשתמשו ב-PBST-X כדי לשטוף את העוברים בטמפרטורת החדר ארבע פעמים למשך 10 דקות כל אחד. כדי להטמיע את העוברים, הכינו אגרוז בעל התכה נמוכה של 4% על ידי המסת אגרוז ב-PBS ב-95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש למקם בצינורות מיקרו-צנטריפוגה, ולאחסן בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס.
ממיסים אליקוט של 4% אגרוז נמס נמוך ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז שומרים את האליקוט על 47 מעלות צלזיוס. בעזרת מכסה מנותק מצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5% מיליליטר כתבנית, הטמיעו עובר באגרוז מותך, והניחו לו להתקרר עד שהוא מוצק. כדי לבצע חיתוך ויברטום, הדביקו פיסת נייר לפלטפורמה היבשה של הוויברטום.
לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את גוש האגרוז המוקשה מהתבנית. מרחו דבק-על סרט הנייר שעל הרציף, וקבעו את גוש האגרוז על סרט הנייר כשהצד הקדמי של הדגימה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, חתוך את גוש האגרוז לצורת פריזמה טרפזית עם כארבעה עד שמונה מילימטרים מכל צד של הפן העליון והתחתון בהתאמה.
השתמשו בטפטפת מלאה ב-PBS קר עם 0.5% Trident X-100 כדי לשטוף את גוש האגרוז. לאחר מכן, השתמש בוויברטום על פי הוראות היצרן להכנת קטעים של 100 מיקרומטר. בעזרת מחט בגודל 26, הסר חלקים חתוכים מהוויברטום והעביר אותם לצלחת נקודתית המכילה 500 מיקרוליטר קר 0.5% PBST-X לבאר.
אסוף את שלושת חלקי הרקמה החיוביים של פעילות בטא-Hsd על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, והשתמש בקצה פיפטה כדי להעביר את החלקים לצלחת של 96 בארות המכילה 0.5% PBST-X קר. המשיכו להכתים ולדמיין את הקטעים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כדי לקבוע כיצד רקמה בין-כלייתית סטרואידוגנית מתפתחת יחד עם גלומרולוס הכליה הפרונפרי וכלי הדם המתהווים שלה, בוצעה בדיקת הפעילות האנזימטית של שלושת בטא-Hsd על עובר דג זברה טרנסגני כפול, המבטא הן פלואורסצנטיות ספציפית לכליה והן ספציפית לאנדותל.
כפי שמוצג כאן, שלוש רקמות סטרואידוגניות חיוביות לבטא-Hsd ממוקמות ממש מקו האמצע ומייד מתרפקות על גלומרולוס הכליה הפרונפרי. חלק מהתאים הסטרואידוגניים מתחילים גם לנדוד על פני קו האמצע. קטעי ויברטום אלה מעוברים טרנסגניים המבטאים GFP אנדותל שעברו בדיקת בטא-HSD נותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה כדי לזהות פיברונקטין ואפקטור במורד הזרם, קינאז הידבקות מוקדית זרחנית.
שקיעת אבי העורקים הפרי-גבי של פיברונקטין חיונית לתמיכה בצמיחת כלי הדם הבין-כליות. עבור עובר הדג או הזחל, הצביעה ההיסטוכימית השלמה יכולה להיעשות תוך יום אחד אם היא מבוצעת כראוי. למרות ששיטת צביעה זו היא פשוטה ומהירה, חשוב לזכור שהיא מזהה רק אנזים אחד בודד של המסלול הסטרואידוגני.
אם מכוונים לניתוח התפתחותי של הרקמה הבין כליתית, בנוסף לבדיקה זו, יהיה צורך לבצע אכלוס באתרו כדי לזהות ביטוי של גנים קריטיים אחרים המעורבים בסטרואידוגנזה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי תאי סטרואידוגניים אינטרנליים ממוינים בדגיקי זהב מנוקדים במהלך התפתחות באמצעות ניסוי פעילות אנזימטית בצורה שלמה. טכניקה זו בעלת ערך רב לחקר היווצרות ועיוות של בלוטת האינטרנל.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי העצב
- ביולוגיה התפתחותית
- אנדוקרינולוגיה
רקע
- בלוטת האינטרנל בדגיק זהב מנוקדים היא אנלוגית לבלוטת יותר הכליה של היונקים.
- הבנת בלוטת האינטרנל חשובה לקבלת תובנות לגבי סטרואידוגנזה.
- ניסוי זה מאפשר ויזואליזציה של תאי סטרואידוגניים במהלך ההתפתחות.
- ניתן ליישם אותו על קווי תרבות תאיים ליצירת ניתוח משופר.
מטרת המחקר
- לזהות תאי סטרואידוגניים ממוינים בדגיקי זהב מנוקדים.
- לחקור את המנגנונים המולקולריים של התפתחות בלוטת האינטרנל.
- לספק שיטה אמינה לבדיקה גנטית וכימית.
שיטות ששימשו
- ניסוי פעילות אנזימטית בצורה שלמה לאנזים 3-β-hydroxysteroid dehydrogenase.
- שימוש ב-0.03% PTU כדי לעכב היווצרות פיגמנטים בעוברים.
- שילוב עם חתכי ויברטום ואימונוהיסטוכימיה.
- ויזואליזציה של הסביבה המיקרוסקופית של כלי הדם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאי סטרואידוגניים אינטרנליים ממוינים.
- הודגם הליך צביעה מהיר ואמין.
- יכולת לנתח רקמות מרובות בעובר אחד.
- תובנות לגבי הסביבה המיקרוסקופית של כלי הדם ברקמת האינטרנל.
מסקנות
- הניסוי הוא כלי רב עוצמה לחקר התפתחות בלוטת האינטרנל.
- הוא מקל על חקר השפעות גנטיות וכימיות על סטרואידוגנזה.
- שיטה זו מגבירה את הבנתנו לגבי היווצרות מערכת הורמונים אנדוקריניים בבעלי חוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This enzymatic activity assay enables rapid visualization of steroidogenic tissue in zebrafish embryos, supporting early-stage target validation in endocrine pathway research. By detecting 3β-Hsd activity without reliance on antibodies, the method provides a reliable readout for mechanistic de-risking of compounds affecting steroidogenesis. Its compatibility with transgenic reporter lines and vascular microenvironment analysis enhances predictive confidence in preclinical safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of steroidogenic tissue differentiation through direct enzyme activity detection.
- Operational Value: Provides antibody-independent readout for target engagement in zebrafish-based mutant or chemical screens.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical disruptions in the steroidogenic pathway.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chromogenic readout correlating with 3β-Hsd enzymatic activity in intact tissues.
- Operational Value: Compatible with whole-mount imaging and sectioning for multiplexed tissue analysis in single embryos.
- Scalability: Rapid staining procedure allows integration into high-throughput screening workflows for endocrine disruptor detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Permits co-localization of steroidogenic tissue with vascular markers to assess microenvironmental influences on hormone production.
- Operational Value: Enables sequential staining for enzyme activity followed by immunohistochemistry to map fibronectin and phosphorylated FAK in vascular niches.
- Translational Relevance: Models interrenal-adrenal axis conservation, supporting cross-species extrapolation of steroidogenesis findings.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows where functional readouts of endocrine tissue maturation are required prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports interrogation of steroidogenic lineage specification and tissue morphogenesis in vivo.
- Screening: Delivers enzyme-based phenotypic readout suitable for compound library screening in zebrafish.
- Analytics: Generates spatially resolved activity maps that can be co-registered with vascular or glomerular markers.
- Translational Research: Enables analysis of tissue-stromal interactions critical for endocrine tissue maturation and vascular support.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for developmental endocrinology and toxicology applications across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in steroidogenic tissue identification through direct enzymatic detection.
- Operational Value: Standardizes whole-mount staining across laboratories using defined reagent preparation and reaction timing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early biomarker of pathway disruption in vertebrate models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on steroidogenic tissue integrity and vascular niche formation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, fixation, and whole-mount staining techniques.
- Dependent on access to vibratory microtome, confocal microscopy, and immunohistochemistry infrastructure for vascular analysis.
- Necessitates standardization of reaction timing and chromogenic development across batches for reproducible quantification.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of permeability and staining conditions.
- Limitation: Detects only one enzymatic step (3β-Hsd) in the steroidogenic pathway, necessitating complementary assays for full pathway assessment.
