לדמיין את רקמות Interrenal Steroidogenic ו microenvironment הדם שלה דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות תאים סטרואידוגניים בין-כלייתיים מובחנים בדג הזברה המתפתח באמצעות בדיקת פעילות אנזימטית פשוטה שלמה. הליך צביעה זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות למנגנונים המולקולריים והתאיים של היווצרות ומום בבלוטות הבין-כליות. היתרון העיקרי של בדיקת צביעה זו הוא שהיא מהירה, פשוטה ואמינה, מה שהופך אותה לכלי רב עוצמה לבדיקות גנטיות או כימיות בדגי הזברה.

ניתן לבצע הליך זה על קווי דיווח פלואורסצנטיים טרנגניים, המסמנים את הכליה וכלי הדם כך שניתן יהיה לנתח רקמות מרובות באותו עובר. בשילוב עם חתך ויברטום, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן גם לדמיין את המיקרו-סביבה של כלי הדם של הרקמה הבין כליתית. לאחר הכנת פתרונות מלאי לשלושה צביעת פעילות בטא-HSD על פי פרוטוקול הטקסט, הנח עוברי דג זברה מתפתחים ב-0.03% PTU במי ביצה כדי לעכב היווצרות פיגמנט.

תקן עוברים מפורקים, או זחלים, ב-2% או 4% PFA ב-PBS עם 0.1% טווין 20, או PFAT. עם PBST, שטפו את העוברים ארבע פעמים במשך 10 דקות כל אחד, וודאו שהדגימות לא יתייבשו בין השטיפות. לפני תגובות הצביעה, הכינו טרי את חלקים A ו-B בצינורות נפרדים, ואז מערבולת וצנטריפוגה את התמיסות.

חיוני להכין חלקים A ו-B בצינורות נפרדים. הוספת כל הרכיבים ישר לצינור אחד בודד תגרום למשקעים קשים מיד. הוסף את כל הצינור של חלק A לכל הצינור של חלק B.מערבבים היטב, ומיד מחלקים מיליליטר אחד לכל צינור מיקרופוגה המכיל עוברים קבועים ושטופים.

השתמש בנייר אלומיניום כדי לעטוף את הצינורות, והניח אותם בטמפרטורת החדר על מסובב או על פלטפורמת נדנדה עם ניעור עדין. קבע באופן אמפירי את זמן התגובה באמצעות מיקרוסקופ לניטור אותות כרומוגניים. עם הזמן יתפתחו משקעים קלים שלא יפריעו לתהליך התגובה.

עצור את התגובה על ידי שימוש ב-PBST כדי לשטוף את העוברים ארבע פעמים למשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן לתקן את העוברים המוכתמים ב-4% PFAT בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות. למיקרוסקופיה שלמה, השתמש ב-50% גליצרול ב-PBS כדי לנקות את העוברים. לאחר מכן, לאחר כיוונם כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה, התבונן בדגימות באמצעות מיקרוסקופ זקוף תחת תאורת שדה בהירה.

הסר חלמון מהעובר והשתמש בו להכנת תושבת שטוחה. לאחר מכן, צלם תמונה ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה של הרקמה הבין כליתית. כדי לנתח את המיקרו-סביבה של כלי הדם של הרקמה הסטרואידוגנית, יש לתקן את העוברים המוכתמים ב-2% PFA.

הוסיפו לו 1% טריטון X-100 בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה, והשתמשו ב-PBST-X כדי לשטוף את העוברים בטמפרטורת החדר ארבע פעמים למשך 10 דקות כל אחד. כדי להטמיע את העוברים, הכינו אגרוז בעל התכה נמוכה של 4% על ידי המסת אגרוז ב-PBS ב-95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש למקם בצינורות מיקרו-צנטריפוגה, ולאחסן בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס.

ממיסים אליקוט של 4% אגרוז נמס נמוך ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז שומרים את האליקוט על 47 מעלות צלזיוס. בעזרת מכסה מנותק מצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5% מיליליטר כתבנית, הטמיעו עובר באגרוז מותך, והניחו לו להתקרר עד שהוא מוצק. כדי לבצע חיתוך ויברטום, הדביקו פיסת נייר לפלטפורמה היבשה של הוויברטום.

לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את גוש האגרוז המוקשה מהתבנית. מרחו דבק-על סרט הנייר שעל הרציף, וקבעו את גוש האגרוז על סרט הנייר כשהצד הקדמי של הדגימה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, חתוך את גוש האגרוז לצורת פריזמה טרפזית עם כארבעה עד שמונה מילימטרים מכל צד של הפן העליון והתחתון בהתאמה.

השתמשו בטפטפת מלאה ב-PBS קר עם 0.5% Trident X-100 כדי לשטוף את גוש האגרוז. לאחר מכן, השתמש בוויברטום על פי הוראות היצרן להכנת קטעים של 100 מיקרומטר. בעזרת מחט בגודל 26, הסר חלקים חתוכים מהוויברטום והעביר אותם לצלחת נקודתית המכילה 500 מיקרוליטר קר 0.5% PBST-X לבאר.

אסוף את שלושת חלקי הרקמה החיוביים של פעילות בטא-Hsd על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, והשתמש בקצה פיפטה כדי להעביר את החלקים לצלחת של 96 בארות המכילה 0.5% PBST-X קר. המשיכו להכתים ולדמיין את הקטעים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כדי לקבוע כיצד רקמה בין-כלייתית סטרואידוגנית מתפתחת יחד עם גלומרולוס הכליה הפרונפרי וכלי הדם המתהווים שלה, בוצעה בדיקת הפעילות האנזימטית של שלושת בטא-Hsd על עובר דג זברה טרנסגני כפול, המבטא הן פלואורסצנטיות ספציפית לכליה והן ספציפית לאנדותל.

כפי שמוצג כאן, שלוש רקמות סטרואידוגניות חיוביות לבטא-Hsd ממוקמות ממש מקו האמצע ומייד מתרפקות על גלומרולוס הכליה הפרונפרי. חלק מהתאים הסטרואידוגניים מתחילים גם לנדוד על פני קו האמצע. קטעי ויברטום אלה מעוברים טרנסגניים המבטאים GFP אנדותל שעברו בדיקת בטא-HSD נותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה כדי לזהות פיברונקטין ואפקטור במורד הזרם, קינאז הידבקות מוקדית זרחנית.

שקיעת אבי העורקים הפרי-גבי של פיברונקטין חיונית לתמיכה בצמיחת כלי הדם הבין-כליות. עבור עובר הדג או הזחל, הצביעה ההיסטוכימית השלמה יכולה להיעשות תוך יום אחד אם היא מבוצעת כראוי. למרות ששיטת צביעה זו היא פשוטה ומהירה, חשוב לזכור שהיא מזהה רק אנזים אחד בודד של המסלול הסטרואידוגני.

אם מכוונים לניתוח התפתחותי של הרקמה הבין כליתית, בנוסף לבדיקה זו, יהיה צורך לבצע אכלוס באתרו כדי לזהות ביטוי של גנים קריטיים אחרים המעורבים בסטרואידוגנזה.