Name: מדידת דיפרנציאלי Methylated אחי DNA מינים בדגימות אדם סרום כמו מוות של תאים ביומרקר של איילט β (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: למדו למדוד DNA מתילציה דיפרנציאלי של אינסולין בסרום אנושי כביומרקר למוות תאי בטא. שיטת ה-PCR הדיגיטלי מאפשרת זיהוי רגיש של סוכרת מסוג 1 בכמויות זעירות של דגימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק UC4 DK104166 של המכונים הלאומיים לבריאות. ברצוננו להודות לסיוע של מרכז המחקר לסוכרת באינדיאנה הנתמך על ידי מענק P30 DK097512 של המכונים הלאומיים לבריאות.

הצהרת אתיקה: הפרוטוקולים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת אינדיאנה. הורי הנבדקים סיפקו הסכמה מדעת בכתב, וילדים מעל גיל 7 סיפקו הסכמה להשתתפותם.
1. עיבוד סרום
הערה: הבדיקה כמתואר נבדקה בקפדנות באמצעות סרום אנושי מבודד כדלקמן.
<ol>
	<li>אסוף דם בצינור איסוף דם אדום עליון (ללא תוסף; לא מצופה).</li>
	<li>השאירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לקריש להיווצר.</li>
	<li>צינור צנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הסופרנטנט (סרום) לצינור חדש המיועד לאחסון בסרום (צינורות עליונים בורגיים מפוליפרופילן, הגודל תלוי בדגימות).</li>
	<li>אחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לבידוד DNA.</li>
</ol>
2. מיצוי DNA בסרום
הערה: DNA מופק עם ערכת מיצוי DNA באמצעות 50 מיקרוליטר סרום (מומלץ), בהתאם לפרוטוקול היצרן עם כמה שינויים.
<ol>
	<li>הכן מאגר ליזה של 200 מיקרוליטר + 1 מיקרוליטר פולי (A) (5 מיקרוגרם) לדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבולת למשך 15 שניות. מניחים בצד עד שלב 2.3.</li>
	<li>קח דגימות סרום מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס והפשיר בטמפרטורת החדר. יש להביא את נפח דגימת הסרום עד ל-200 מיקרוליטר בסך הכל באמצעות תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS, עם סידן כלורי ומגנזיום כלוריד).</li>
	<li>ליזה את הדגימה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר פרוטאז (1.4 יחידות אנסון/מ"ל) לדגימה, ואחריה 200 מיקרוליטר מאגר ליזה/תערובת פוליA (משלב 2.2) ומערבולת למשך 8 שניות. דגירה של דגימה ב-56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה למשך 7 שניות במהירות מרבית במיקרו-צנטריפוגה (>10,000 x גרם).</li>
	<li>לזרז DNA על ידי הוספת 230 מיקרוליטר 100% אתנול לדגימה ומערבולת למשך 8 שניות>.</li>
	<li>החל את ה-DNA על עמודת הספין על ידי הוספת תערובת דגימה של 600 מיקרוליטר לעמודת הספין המיני. צנטריפוגה ב 6,000 x גרם למשך דקה. השליכו את הזרימה והניחו את העמודה בצינור נקי.</li>
	<li>שטפו את ה-DNA על ידי הוספת מאגר כביסה של 500 מיקרוליטר 1 לעמודה. צנטריפוגה ב 6,000 x גרם למשך דקה. השליכו את הזרימה והניחו את העמודה בצינור נקי. הוסף מאגר כביסה 2 של 500 מיקרוליטר לעמודה ולצנטריפוגה במהירות מרבית (>10,000 x גרם) למשך 3 דקות. הנח את העמודה בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות המרבית שוב למשך דקה אחת.</li>
	<li>הוצא את ה-DNA על ידי הנחת עמודה בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל והוספת מאגר פליטה של 60 מיקרוליטר ישירות על המסנן. חשוב להחליף טיפים בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ואז צנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 x גרם למשך דקה. הוסף עוד 60 מיקרוליטר של מאגר פליטה וצנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך דקה אחת. </li>
	<li>אחסן DNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, או המשך מיד להמרת ביסולפיט.</li>
</ol>
3. המרת ביסולפיט
הערה: המרת ביסולפיט מתבצעת באמצעות ערכת המרה של ביסולפיט, בהתאם לפרוטוקול היצרן עם כמה שינויים.
<ol>
	<li>כדי להמיר ציטוזינים ללא מתילציה לאורצילים, הוסף 130 מיקרוליטר של מגיב המרה ביסולפיט ל-20 מיקרוליטר של DNA משלב 2.7 בשפופרת PCR (צינור PCR יחיד של 0.2 מ"ל או צינורות PCR עם 8 רצועות). שמור את 40 המיקרוליטר הנותרים של DNA לשימוש עתידי, או השתמש בתגובות שכפול. מערבבים 20 פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצנטריפוגה קצרה כדי לוודא שאין טיפות בצדדים או במכסה. דגירה באמבט מים או במחזור תרמי כדלקמן: 98 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, 54 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
	<ol>
		<li>המשך לשלב 3.2 או אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 20 שעות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר כריכה לעמודת הסיבוב והנח את העמודה בצינור האיסוף המצורף. מרחו את ה-DNA הביסולפיטי על העמודה וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. צנטריפוגה במהירות מרבית (>10,000 x גרם) למשך 30 שניות.</li>
	<li>שטפו DNA על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד ולצנטריפוגה במהירות מרבית (>10,000 x גרם) למשך 30 שניות.</li>
	<li>בצע דה-סולפונציה להסרת קבוצת סולפונאט כדי לסיים את ההמרה של ציטוזינים ללא מתילציה לאורציל על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר דה-סולפונציה לעמודה. הניחו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות מרבית (>10,000 x גרם) למשך 30 שניות.</li>
	<li>שטפו DNA על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד ולצנטריפוגה במלוא המהירות למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה וחזרו על שלב הכביסה הזה.</li>
	<li>הנח את העמוד בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. לחסל DNA על ידי הוספת מאגר פליטה של 10 מיקרוליטר ישירות למסנן העמודות. דגירה למשך דקה. צנטריפוגה למשך 30 שניות במלוא המהירות כדי לחסל DNA. כימות DNA משוחזר על ידי ספקטרופוטומטריה ב-A260. 
	הערה: ה-DNA שזוהה על ידי ספקטרופוטומטריה מייצג בעיקר את ה-DNA ה-polyA הנשא שנוסף בשלב 2.3 לעיל. בדרך כלל, התאוששות של polyA היא ≥85% מהקלט (>4.25 מיקרוגרם).</li>
	<li>אחסן DNA ב-20 מעלות צלזיוס עד שמוכן להמשיך עם PCR דיגיטלי.</li>
</ol>
4. PCR דיגיטלי מולטיפלקס
<ol>
	<li>הכינו מיקס מאסטר עם מספיק פתרון לכל דגימה ובקרה. כלול לפחות דגימה אחת המכילה מים (בקרה שלילית), דגימה אחת של פלסמיד המכיל INS לא מתילציה (1 pg, בקרה חיובית), דגימה אחת של פלסמיד המכילה INS שעבר מתילציה (1 pg, בקרה חיובית), ודגימה אחת המכילה תערובת 1:1 של פלסמידים.
	<ol>
		<li>כדי להכין את תערובת המאסטר של PCR, הוסף 12.5 מיקרוליטר לכל תגובה של מאגר PCR (למשל, 125 מיקרוליטר לכל 10 דגימות), 1.25 מיקרוליטר לכל תערובת פריימר/בדיקה לתגובה (למשל, 12.5 מיקרוליטר לכל 10 דגימות), 8.25 מיקרוליטר לכל מי תגובה (למשל, 82.5 מיקרוליטר לכל 10 דגימות), 0.5 מיקרוליטר לכל תגובה אנזים EcoR1 (למשל, 5 מיקרוליטר לכל 10 דגימות). 
		הערה: פריימרים ובדיקות המשמשים כאן הם כדלקמן: פריימר קדימה: 5'-GGAAATTGTAGTTTTTAGTTTTTAGTTTTTTTTGTGT-3'; פריימר הפוך: 5'-AAAACCCTCCCCTACCTATCA-3'; בדיקת FAM: FAM-5'-ACCCCTACCTAAC-3'-MGB; בדיקת VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הגדר תגובת PCR מרובה בצלחת של 96 בארות. הוסף 19.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל באר. הוסף 2.5 מיקרוליטר של דגימת DNA מומרת ביסולפיט לכל באר מתאימה (שמור את 7.5 המיקרוליטר הנותרים של DNA שהומר בביסולפיט או השתמש בתגובות שכפול). מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. 
	הערה: כל 8 הבארות ברצף חייבות להכיל בקרת דגימה או מאגר.</li>
	<li>אוטמים עם אטם נייר כסף בעזרת אוטם צלחות וצנטריפוגה בספינר צלחת עד שאין נוזלים בצידי הבארות.</li>
	<li>הגדר את מחולל הטיפות האוטומטי במסך המגע. 
	הערה: כל 8 הבארות במחסנית חייבות להכיל בקרת דגימה או מאגר.
	<ol>
		<li>הגדר את מספר השורות בשימוש על ידי נגיעה בשורות שבהן נטענות דגימות על צלחת 96 הבארות משלב 4.2 וסמן את השורה בכחול כדי לציין שורה פעילה.</li>
		<li>טען חומרים מתכלים מאחור לפנים כדי למנוע זיהום. כדי להתחיל, הוסף מחסניות לאורך השורה האחורית של המכשיר. טען טיפים לשורה המרכזית של המכשיר. 
		הערה: מחסניות הדיו יכולות להיכנס למחזיקים רק בכיוון הנכון.</li>
		<li>הנח צלחת 96 באר לתוך הכלי. מוציאים גוש קר מהמקפיא של -20 מעלות צלזיוס ומניחים לתוכו צלחת חדשה עם חצאית של 96 בארות. הנח אותו בתוך המכשיר ליד הצלחת הטעונה ב-96 בארות.</li>
		<li>הוסף שמן למתקן בקדמת המכשיר. בחר את סוג השמן במסך המגע.</li>
		<li>גע בלחצן ההתחלה הכחול כדי להתחיל את הריצה. אשר את הגדרת הצלחת וגע בלחצן התחל הפעלה כדי להתחיל.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לאחר שתסיים, הסר את צלחת 96 הבארות המכילה את הטיפות החדשות שנוצרו ואטום עם אטם נייר כסף באמצעות אוטם צלחות.</li>
	<li>בצע PCR10 על מחזורי תרמי באמצעות התוכנית הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 10:00 דקות; 40 מחזורים ב: 94 מעלות צלזיוס למשך 00:30 דקות, 57.5 מעלות צלזיוס למשך 01:00 דקה; 98 מעלות צלזיוס למשך 10:00 דקות; 12 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד 24 שעות.</li>
	<li>הנח את הצלחת על קורא הטיפות והגדר את הקורא.
	<ol>
		<li>לחץ על הכרטיסייה הגדרה. פתח תבנית חדשה על ידי לחיצה על תבנית > חדשה. הזן שם קובץ.</li>
		<li>השתמש בעורך הבאר כדי להגדיר את הפרמטרים עבור כל דגימה. תן לכל דגימה שם ייחודי, הגדר את הניסוי לזיהוי אירועים נדירים (R-RED), והגדר את מיקס המאסטר לתמהיל ששימש בשלב 4.1.</li>
		<li>תנו ליעד 1 שם (כלומר, ללא מתילציה) והגדירו את יעד 1 כלא ידוע (U). תן ליעד 2 שם (כלומר, מתילציה) והגדר את יעד 2 כהתייחסות (R).</li>
		<li>לחץ על הכרטיסיה הפעלה כדי להתחיל את ההפעלה. בחלון אפשרויות ההפעלה, בחר את כימיית הזיהוי (FAM/VIC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. ניתוח נתונים
<ol>
	<li>פתח תוצאות בכרטיסיית ניתוח ונתח באמצעות תרשים דו-ממדי המבוסס על בקרות חיוביות (ראה איור 1).</li>
	<li>ייצא קובץ CSV שנוצר על ידי קורא droplet לתוכנית גיליון אלקטרוני לניתוח נתונים.</li>
	<li>כדי ליצור "עותקים למיקרוליטר" של סרום, השתמש בנוסחה: (ריכוז*250)/(נפח הסרום המשמש לבידוד DNA במיקרוליטר). 6 
	הערה: הנתונים מומרים בדרך כללל-log 10 כאשר הם נרכשים מסרום אנושי כדי להבטיח פיזור נורמלי. לחלופין, ניתן לשרטט נתונים בסולם לוג10 ולנתח אותם על ידי סטטיסטיקה לא פרמטרית.</li>
</ol>
<style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 16.0px 'Times New Roman'}
span.s1 {גופן: 16.0px Calibri}
</style>

<ol><li>Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+crosstalk+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell crosstalk in type 1 diabetes.</a> Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).</li>
<li>Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+beta-cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).</li>
<li>Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+immunobiology+to+%CE%B2-cell+biology%3A+the+changing+perspective+on+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes.</a> Islets. 6 (2), 28778(2014).</li>
<li>Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITN-JDRF+Type+1+Diabetes+Combination+Therapy+Assessment+Group+Developing+combination+immunotherapies+for+type+1+diabetes%3A+recommendations+from+the+ITN-JDRF+Type+1+Diabetes+Combination+Therapy+Assessment+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group.</a> Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).</li>
<li>Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hirnetwork.org/">https://hirnetwork.org/</a> (2016).</li>
<li>Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevations+in+Circulating+Methylated+and+Unmethylated+Preproinsulin+DNA+in+New-Onset+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Methylation+of+Human+Insulin+Gene+and+PCR+Assay+for+Monitoring+Beta+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death.</a> PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).</li>
<li>Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+cell+death+and+dysfunction+during+type+1+diabetes+development+in+at-risk+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals.</a> J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).</li>
<li>Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissue-specific+cell+death+using+methylation+patterns+of+circulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).</li>
<li>Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li>
<li>Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+gene+expression+is+regulated+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Insulin gene expression is regulated by DNA methylation.</a> PloS One. 4 (9), 6953(2009).</li>
<li>Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+%CE%B2+cell+death+in+diabetes+using+differentially+methylated+circulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).</li>
<li>Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+islet+%CE%B2-cell+death+in+vivo+by+multiplex+PCR+analysis+of+differentially+methylated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA.</a> Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+bisulphite+modification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li>
<li>Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR+unraveled%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR unraveled.</a> Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+methylation-specific+polymerase+chain+reaction+method+for+monitoring+beta+cell+death+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes.</a> PloS One. 7 (10), 47942(2012).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Sozzi, G., Roz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+storage+of+whole+plasma+or+isolated+plasma+DNA+on+the+results+of+circulating+DNA+quantification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays.</a> J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מתילציה של cytosines ידי methyltransferases DNA מאפשרת השליטה אפיגנטיים של שעתוק גנים רבים. גן אח&quot;י בבני האדם הוא כמעט לידי ביטוי אך ורק איון β תאים, נראה שיש קורלציה בין תדירות מתילציה של cytosines בגן INS כדי להשתיק של השעתוק שלה 11. ככזה, סוגי התאים ביותר מציגים תדירות גבוהה יותר באופן משמעותי של מתילציה של גני אח&quot;י ב cytosines השונה לעומת בטא תאים 11 - 13. הוצע כי השכיחות של מוות תאי β יכול להיות ...

סוכרת מסוג 1 (T1D) היא מחלה אוטואימונית אשר מאופיינת על ידי ההרס של איון מייצר אינסולין β תאים על ידי תאי אוטוריאקטיבים T 1. האבחנה של T1D היא בדרך כלל מתבצעת בזמן המדידה של היפרגליקמיה (הגלוקוז בדם&gt; 200 mg / dl) אצל אדם רזה וצעיר, עלול להוות עם בחמצת כעדות לחוסר באינסולין. בעת האבחנה של T1D, יש ראיות על אובדן משמעותי של תפקוד התא β ומסה (מ -50 - 90%) 2. במחקרים קליניים, מספר תרופות modulatory החיסונית שהונהגו בעת האבחנה הביאה להתייצבות של תפקוד התא β (ומן הסתם מסה), אבל אף אחד מהם לא הביא רמיסיה קלינית של מחלת, ממצא גייסה השיחה לפיתוח של סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם של המחלה ועבור מעקב האורך של האפקטיביות של שילוב טיפול בעזרת 3,4. מאמצי קונסורציומים בינלאומיים, כזהזה הקונסורציום רשת המחקר איילט האדם במכונים הלאומיים של הית 5, הדגישו את הצורך לפתח סמנים ביולוגיים המתמקדים מתח מוות תאי β ב T1D. עולה בקנה אחד עם המאמצים האלה, הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו לאחרונה מבחני סמן ביולוגי המודדים במחזור, קטעי דנ&quot;א שונה epigenetically שעולים בעיקר ממוות תאי β 6 - 9. בכל המבחנים שפורסמו עד כה, הדגש היה על quantitation של preproinsulin קידוד הגן האנושי (INS), אשר מביא לידי ביטוי מעלות פחות או יותר של אתרי CPG unmethylated באזורי קידוד אמרגן בהשוואה לסוגי תאים אחרים. שחרור שברי DNA unmethylated אח&quot;י שוער כמו הנובעת בעיקר ממוות (נמקי, אפופטוטיים) תאי β. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי שלנו בנוער, הגבהים בשני DNA אח&quot;י unmethylated ו מפוגל ב- BP עמדה -69 (ביחס ל- tהוא תעתיק להתחיל באתר) נצפו T1D חדש-onset, ויחד שימש סמנים ספציפיים לאוכלוסייה זו 6. מבחני סמן ביולוגי אלה כרוכים הבידוד של DNA התא מתוך סרום או פלזמה באמצעות ערכות ספין מסחרי, ואחריו המרה bisulfite של ה- DNA מבודד (להמיר cytosines הלא מפוגל כדי uracils, עוזב cytosines מפוגל ללא פגע). בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את ההיבטים הטכניים של אוסף מדגם בסרום, בידוד של DNA התא מתוך בסרום, המרה bisulfite, והביצועים של PCR דיגיטלי אגל (להלן, דיגיטלי PCR) עבור ה- DNA אח&quot;י מפוגל דיפרנציאלי.

<table><tbody><tr><td>שואב אדום עליון&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td></td><td>366441 ללא תוסף, פנים לא מצופה, 10 מ"ל</td></tr><tr><td>צינור קריוביאלי</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>פוליפרופילן, צינור מכסה בורג, בכל גודל</td></tr><tr><td>QIAamp DNA ערכת מיני דם</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>לא אהוב במאגר TE (10 מ"מ Tris-Cl pH 8.0 + 1 מ"מ EDTA) עד 5 ומיקרו; g/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט (200 הוכחה)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (עם CaCl2 ו-MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל PCR 8 רצועות צינורות</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8 רצועות, כיפה</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA ערכת מתילציה-ברק</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix לבדיקות (ללא dUTP)</td> <td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>בקרת חיץ לבדיקות</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>Human Unmethylated / Methylated פריימר/תערובת בדיקה</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96,</td><td>Eppendorf</td> חצאית <td>למחצה 951020346</td><td></td></tr><tr><td>חותם חום רדיד ניתן לניקוב</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR אוטם צלחת</td><td>Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG טיפה דיגיטלית PCR מערכת Biorad</td><td></td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>אוטומטי טיפות ייצור שמן לבדיקות</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 מחסנית לגנרטור טיפות אוטומטי</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>טיפות לפיפט לגנרטור טיפות אוטומטי</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>פחי טיפות למחולל טיפות אוטומטי</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 מגע Thermal Cycler</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 קורא טיפות</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR קורא טיפות שמן</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת דיפרנציאלי methylated<em&gt; אח&quot;י</em&gt; dna מינים בדגימות אדם סרום כמו מוות של תאים ביומרקר של איילט β

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

המוות של תאי β האיים נחשב כבסיס לפתוגנזה של כמעט כל צורות הסוכרת ומקדים את התפתחות היפרגליקמיה גלויה, במיוחד בסוכרת מסוג 1. פיתוח סמנים ביולוגיים רגישים ואמינים של מוות תאי β עשוי לאפשר התערבות טיפולית מוקדמת למניעה או עיכוב של התפתחות סוכרת. לאחרונה, מספר קבוצות, כולל שלנו, דיווחו כי DNA נטול תאים, מתילציה דיפרנציאלית המקודד פרה-פרואינסולין (INS) במחזור הדם נמצא בקורלציה למוות β של תאים בסוכרת טרום סוג 1 וסוכרת מסוג 1 חדשה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב באמצעות PCR דיגיטלי למדידת DNA INS נטול תאים שעובר מתילציה דיפרנציאלית בציטוזין במיקום -69 bp (ביחס לאתר התחלת השעתוק). אנו מדגימים כי הבדיקה יכולה להבחין בין ציטוזין שעבר מתילציה לבין ציטוזין ללא מתילציה במיקום -69 bp, הוא ליניארי בכמה סדרי גודל, מספק כימות מוחלט של מספרי עותקי DNA, וניתן ליישם אותו על דגימות של סרום אנושי מאנשים עם סוכרת מסוג 1 חדשה ובקרות ללא מחלות. ניתן להתאים את הפרוטוקול המתואר כאן לכל מין DNA שעבורו רצוי לזהות ציטוזינים שעברו מתילציה דיפרנציאלית, בין אם ממחזור הדם או מתאים ורקמות מבודדים, ויכול לספק כימות מוחלט של מקטעי DNA.

כדי לפרש את הנתונים כראוי, אנו משתמשים שולטים פלסמיד היא DNA אח&quot;י יעד unmethylated ו המפוגלת בכל ריצת PCR דיגיטלית. בקרות אלה להבטיח כי האותות המתאימים DNA המפוגל unmethylated וניתן להבחין בבירור. איור 1 מציג את מגרשים פיזור 2-D המתאים טיפות עבור פקדי פלסמיד המכיל אח&quot;י unmethylated המרה bisulfite DNA (איור 1 א), DNA אח&quot;י מפוגל (איור 1B), ו- 1: תערובת 1 של ש...

Islet β מוות תאי מקדים התפתחות של סוכרת מסוג 1, וגילוי תהליך זה עשוי לאפשר התערבות טיפולית מוקדמת. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט כיצד למדוד מיני DNA INS שעברו מתילציה דיפרנציאלית בסרום אנושי כסמן ביולוגי למוות של תאי β.

מדידת דיפרנציאלי Methylated<em&gt; אח&quot;י</em&gt; DNA מינים בדגימות אדם סרום כמו מוות של תאים ביומרקר של איילט β

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד מיני DNA של preproinsulin בעלי מתילציה דיפרנציאלית בסרום אנושי כסמן ביולוגי למות תאי בטא. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הסוכרת, כגון: האם מתרחש מוות של תאי בטא בנקודת זמן מסוימת במהלך התפתחות של סוכרת מסוג 1? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבגישה של digital PCR, אנו יכולים לקבוע את כמות מות תאי הבטא בכמויות קטנות מאוד של סרום.לאחר איסוף סרום מדגימות דם אנושיות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו 200 µL של תמיסת ליזיס ומיקרוליטר אחד של poly(A) לכל דגימה במבחנת מיקרוצנטריפוגה. ערבלו את המבחנה ב-Vortex למשך 15 שניות. הוציאו את דגימות הסרום מהמקפיא בטמפרטורה של 80- °C והמיסו אותן בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי להביא את נפח מדגם הסרום ל-200 µL. בצע ליזה לדגימות על ידי הוספה של 20 µL פרוטאז ו-200 µL של תמיסת ליזה poly(A)mix. ערבב את המבחנות ב-Vortex למשך שמונה שניות והדגרה את הדגימות בטמפרטורה של 56 °C למשך 10 דקות.לאחר מכן, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך שבע שניות. השקיפו את ה-DNA על ידי הוספת 230 µL של 100% ethanol לדגימות וערבבו את המבחנות בוורטקס למשך שמונה שניות. לאחר מכן, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך שבע שניות.בשלב הבא, העבירו 600 µL של תערובות הדגימה לעמודי ספינ (spin columns) וסובבו את העמודים בצנטריפוגה ב-6000 ×g למשך דקה אחת. השליכו את הנוזל שעבר (flowthrough) והניחו את העמודים במבחנות נקיות. הוסיפו לעמודים 500 µL של wash buffer one וסובבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-6000 ×g למשך דקה אחת.לאחר מכן, השליכו את הנוזל שעבר דרך העמודות והעבירו את העמודות למבחנות נקיות. הוסיפו 500 µL של wash buffer two לעמודות וסובבו אותן בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך שלוש דקות. לאחר מכן, העבירו את העמודות למבחנות מיקרוצנטריפוגה חדשות בנפח 1.5 mL וסובבו אותן שוב למשך דקה אחת.כדי לאלוט את ה-DNA, העבירו את העמודות לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה חדשות בנפח 1.5 millileter והוסיפו 60 microleters של תמיסת אלוציה (elution buffer) ישירות למסננים. לאחר דגירה של העמודות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 6000 times G למשך דקה אחת. השליכו את העמודה ואחסנו את הדגימות עד למועד ההמרה לביסולפיט (bisulfite conversion).כדי להמיר ציטוזינים שאינם ממתילים לאורצילים, הוסיפו 130 µL של ריאגנט להמרה לביסולפיט ל-20 µL של DNA במבחנות PCR. ערבבו את הדגימות 20 פעמים באמצעות שאיבה ופליטה בפיפט, וסבבו את המבחנות קצרת לריכוז הנוזל כדי לוודא שלא נותרו טיפות על הדפנות או על המכסה. הדגרימו את הדגימות באמבט מים או במכשיר תרמו-סייקליסט כפי שמוצג כאן.הניחו את העמודות בתוך מבחנות האיסוף המסופקות והוסיפו 600 µL של תמיסת קישור (binding buffer) לעמודות הספין. העבירו את ה-DNA שעבר ביסולפיט לעמודות וערבבו על ידי שאיבה ושחרור (pipetting) 10 פעמים. לאחר מכן, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך 30 שניות והשליכו את הנוזל שעבר דרך העמודה (flowthrough).בשלב הבא, הוסיפו 100 µL של תמיסת שטיפה לעמודה וסובבו בצנטריפוגה למשך 30 שניות. לאחר מכן, כדי להסיר את קבוצות הסולפינאט ולהשלים את ההמרה של ציטוזינים שאינם מתילתיים לאורציל, הוסיפו 200 µL של תמיסת דסולפינציה לעמודות. לאחר המתנה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, סובבו את העמודות בצנטריפוגה למשך 30 שניות.יש לשטוף את ה-DNA על ידי הוספת 200 µL של בופר שטיפה לעמודות וצנטריפוגה שלהן למשך 30 שניות. לאחר מכן, יש לנקז את הנוזל שעבר ולחזור על שלב השטיפה. יש להעביר את העמודות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL ואילוט את ה-DNA על ידי הוספת 10 µL של בופר אילוט ישירות למסנני העמודות.דגרו את הדגימות למשך דקה אחת, ולאחר מכן סובבו אותן בצנטריפוגה למשך 30 שניות כדי להפיק את ה-DNA. השליכו את העמודות ואחסנו את הדגימות. כמותו את ה-DNA שהופק באמצעות ספקטרופוטומטריה בבליעה של 260 nanometers.הכינו תערובת מאסטר (master mix) בכמות מספיקה עבור כל דגימה ובקרת איכות. כללו לפחות דגימה אחת המכילה מים, דגימה אחת של פלסמיד המכיל אינסולין שאינו מתיל, ודגימה אחת המכילה תערובת של פלסמידים ביחס של אחד לאחד. הגדירו תגובות multiplex PCR בפלטה בעלת 96 בארות על ידי הוספה ראשונית של 19.5 µL של תערובת המאסטר לכל בארה.הוסיפו 2.5 µL של דגימת DNA שעברה המרה בביסולפיט לבאריים המתאימים. לאחר מכן, ערבבו את התוכן בבאריים על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) מספר פעמים. השתמשו בנייר אלומיניום ובסוגר פלטות (plate sealer) כדי לאטום את הפלטה, וסובבו אותה בצנטריפוגה ייעודית לפלטות עד שלא יישאר נוזל על דפנות הבאריים.כדי להגדיר את מחולל הטיפות האוטומטי במסך המגע, קבעו את מספר השורות הנמצאות בשימוש על ידי לחיצה על השורות שבהן נטענו הדגימות בבארות של הפלטה. כדי למנוע זיהום, טענו את חומרי הצריכה מאחור לקדמה, החל מהמחסניות לאורך השורה האחורית של המכשיר. לאחר מכן, טענו את הטיפים לשורה המרכזית.בשלב הבא, הכניסו את פלטת 96 הבארות למכשיר. לאחר מכן, הוציאו בלוק קירור מהמקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס, והניחו בתוכו פלטת 96 בארות עם שוליים (skirted) חדשה. הכניסו את הבלוק עם הפלטה למכשיר, לצד הפלטה המכילה את הדגימות.הוסיפו שמן למתקן ההגשה לפני המכשיר ובחרו את סוג השמן במסך המגע. געו בכפתור Start הכחול כדי להתחיל את ההרצה. לאחר מכן, אשרו את הגדרות הפלטה וגעו בכפתור Start Run כדי להתחיל.עם סיום ההרצה, הוציאו את פלטת 96 הבארים המכילה את הטפטפות שנוצרו והשתמשו בסוגר פלטות כדי לאטום אותה בנייר אלומיניום. כעת, בצעו PCR במכשיר תרמוסייקלר (thermal cycler) בהתאם לתוכנית הבאה. הניחו את הפלטה על קורא הטפטפות והגדירו את הקורא על ידי לחיצה על לשונית ה-Setup.לאחר מכן, פתחו תבנית חדשה על ידי לחיצה על Template New. השתמשו בעורך הבארים (well editor) כדי להגדיר את הפרמטרים עבור כל דגימה. תנו לכל דגימה שם ייחודי.הגדירו את הניסוי כ-Rare Event Detection והגדירו את ה-master mix כתערובת ששימשה להכנת התגובה. תנו למטרה 1 (Target 1) שם, כגון Unmethylated, והגדירו את מטרה 1 כלא ידועה, או U. תנו למטרה 2 (Target 2) שם, כגון Methylated, והגדירו את מטרה 2 כרפרנס, או R. לחצו על לשונית ה-Run כדי להתחיל את ההרצה והזינו שם לקובץ. לאחר מכן, בחלון אפשרויות ההרצה (Run Options), בחרו את כימיית הגילוי.כדי לנתח את הנתונים, פתחו את התוצאות בלשונית Analyze והשתמשו בתרשים ה-2D המבוסס על בקרות חיוביות כדי לנתח את הנתונים. דמות זו מציגה את תרשימי הפיזור הדו-ממדיים (2D scatter plots) המתאימים לטיפות עבור בקרות פלסמיד, המכילות DNA של אינסולין שעבר המרה של ביסולפיט ואינו ממתיל, DNA של אינסולין ממתיל, ותערובת ביחס של אחד לאחד של שני הפלסמידים. שימו לב שבפאנל זה קיימת סטייה קלה של טיפות חיוביות ל-FAM אל ערוץ ה-VIC, המעידה על הגשוש (probe) עבור ה-DNA של אינסולין הממתיל.באופן דומה, קיימת סטייה קלה מאוד של טיפות החיוביות ל-VIC בערוץ ה-FAM, המעידה על תגובה צולבת של הגש השייך ל-DNA שאינו מתיל ב-DNA מתיל. כדי להדגים ליניאריות של הפריימרים, נעשה שימוש בתערובות של שני הפלסמידים בסדרי גודל שונים בתגובות ה-PCR. כפי שמוצג כאן, ניתן לזהות באופן ליניארי ריכוזים משתנים של פלסמיד אחד בנוכחות כמות קבועה של הפלסמיד השני.באיור זה, נותחו דגימות מארבעה אנשים עם סוכרת מסוג 1 בהתחלה (new onset) וארבע דגימות ביקורת ללא סוכרת מסוג 1. הנתונים מראים כי אנשים עם סוכרת מסוג 1 מראים רמות מוגברות הן של DNA של אינסולין לא מתילated והן של DNA מתילated בהשוואה לקבוצות הביקורת, כפי שהוצג בעבר. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשמונה שעות עבור 30 דגימות, אם היא מבוצעת כהלכה.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מזיהום בכל השלבים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הסוכרת לבחון את השימוש בטכניקה זו כסמן ביולוגי להתפתחות של סוכרת מסוג 1. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לקבוע את כמות מות תאי בטא על ידי מדידת preproinsulin שאינו ממתיל וממתיל ב-DNA חופשי מתסריג אנושי.יש לזכור כי עבודה עם תמיסות מיצוי DNA עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע פרוצדורה זו, כגון חבישת כפפות ומעיל מעבדה, והימנעות משימוש בחומרי חיטוי המכילים אקונומיקה.

measurement-differentially-methylated-ins-dna-species-human-serum

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

סרטון זה מציג את זיהוי האלקטרוכימילומינסנציה של נוגדנים עצמיים של איונים בסרום אנושי. הנוגדנים בסרום מגשרים בין האנטיגן המצומד רותניום לאנטיגן לכידת הביוטינילציה, ויוצרים קומפלקסים המזוהים על ידי מדידות אלקטרוכימילומינסנציה.

זיהוי נוגדנים עצמיים של האי האנושי באמצעות בדיקת אלקטרוכימילומינסנציה

microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

כאן, הצגנו את השיטות כדי לזהות עצמיים איון האנושי באמצעות מבחני electrochemiluminescence (ECL). הפרוטוקול, השתמשו כדי לחזות סוכרת מסוג 1, ניתן להרחיב על כדי לזהות עצמיים למחלות אוטואימוניות אחרות.

מבחני Electrochemiluminescence עבור האדם איון עצמיים

Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

מחקר זה משתמש בסמנים מבוססי פלואורסצנטיות מרובי כתמים של מוות תאים ואפופטוזיס בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ומוות ספציפי לתאי β באיי הלבלב. הוא חושף שינויים מרחביים וזמניים במוות תאים ואפופטוזיס בתגובה לגירויים חוץ-תאיים.

טיפול באי לבלב מבודד ומדידת אפופטוזיס

כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

אנו מתארים כאן גישה מהירה ופשוטה יחסית למיפוי תזמון שכפול יונקים ברחבי הגנום, מבידוד תאים ועד לניתוח בסיסי של תוצאות הריצוף. מפה גנומית של תוכנית שכפול מייצגת תסופק בהתאם לפרוטוקול.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

למדו למדוד DNA מתילציה דיפרנציאלי של אינסולין בסרום אנושי כביומרקר למוות תאי בטא. שיטת ה-PCR הדיגיטלי מאפשרת זיהוי רגיש של סוכרת מסוג 1 בכמויות זעירות של דגימות.

מדידת דיפרנציאלי Methylated

גלה סרטונים נוספים