הערכה של תפקוד Bioenergetic בתאי האנדותל מוחות דם

המטרות הכלליות של הליך זה הן להעריך כיצד שינויים בתפקוד המיטוכונדריה משפיעים על התפתחות הפרעות נוירולוגיות ולתכנן טיפולים בעלי השפעה ישירה על פתחי מחסום הדם-מוח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההפרעות הנוירולוגיות, כגון כיצד ניתן למזער את מוות תאי העצב לאחר שבץ מוחי? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הערכה בזמן אמת של תפקוד המיטוכונדריה בתאים שלמים שלמים.

לאחר גידול תאי האנדותל של כלי הדם במוח במדיום שלם, בבקבוק תרבית רקמה בגודל T75 סנטימטר מרובע, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד 80%, השליכו את מדיום תרבית התאים ושטפו את התאים עם טריפסין EDTA. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד עד שניים של טריפסין EDTA טרי לבקבוק ונתקו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר אישור שהתאים התרוממו תחת מיקרוסקופ הפוך, עצרו את התגובה בתוספת עדינה של 10 מיליליטר של מדיום תאים שלם טרי והעבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה ב -10 מיליליטר של מצע גידול שלם טרי לצנטריפוגה נוספת. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה במדיום גידול מלא בריכוז כפול 10 עד חמישי למיליליטר עבור תת-תרבית. לאחר המספר המתאים של תת-תרבויות, זרעו 1.6 כפול 10 לתאים הרביעיים ב-80 מיקרוליטר של מדיום שלם לבאר, על צלחת תרבית תאי שטף חוץ-תאית של 96 בארות והניחו את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

כאשר התאים נצמדו לצלחת, הוסיפו את הטיפול המעניין לבארות המתאימות והחזירו את התאים לחממה. יום לפני בדיקת ההערכה התפקודית של המיטוכונדריה, הרטיבו מחסנית צנזור שטף חוץ-תאית עם 150 מיקרוליטר של תמיסת קליברנט שטף חוץ-תאי ודגרו על הצלחת במהלך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני. למחרת בבוקר, השתמש בתחנת שטיפת הצלחות כדי לשנות את מדיום תרבית התאים למדיום בדיקת שטף חוץ-תאי pH 7.0.

לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ללא פחמן דו חמצני, למשך 30 עד 60 דקות. כאשר התאים התייצבו, טען את המחסנית המיובשת לתוך הביו-אנלייזר ולחץ על כפתור התחל כדי להתחיל בכיול. בסיום הכיול, לחץ על ההנחיה בטל את נעילת המחסנית כדי להסיר את הצלחת התחתונה של המחסנית ולטעון את לוחית התא.

לאחר מכן פתח את קובץ הנתונים כדי לקבל את ערכי הקצב מה-Bioanalyzer לייצוא לקובץ הגיליון האלקטרוני. בהתחשב בכך שהקינטיקה והעוצמה היחסית של התגובות משתנות בין סוגי תאי האנדותל השונים של כלי הדם במוח, בניסויים אלה, סדרה של ריכוזים של bEnd. 3 תאים שימשו לזיהוי מספר התאים האופטימלי למדידת רמות קצב צריכת החמצן בבדיקת פרופיל מטבולי.

כפי שנצפה, הנשימה הבסיסית והמקסימלית ויכולת הנשימה העודפת מדגימות תגובה פרופורציונלית לצפיפות התאים. ייצור ATP, לעומת זאת, יורד כאשר משתמשים בריכוז הגבוה ביותר של תאים לבאר, מה שמרמז על כך שתרבית תאים משולבת יתר אינה מתאימה לניסוי. כאשר נראה כי צפיפות התאים האופטימלית מתרחשת בטווח הבינוני של מספרי התאים לבאר.

לכן, רמות קצב צריכת החמצן הצפויות הוערכו בניסוי מייצג זה באמצעות ריכוז תאים בטווח בינוני, מה שמדגים כי מולקולות mRNA קודמות שאינן מקודדות מפחיתות את תפקוד המיטוכונדריה בתאי אנדותל כלי דם במוח. ניסויים אלה גם מראים כי הנשימה המקסימלית והקיבולת הרזרבית מופחתות באופן משמעותי על ידי ביטוי יתר של מולקולות אלה בתאי אנדותל כלי דם מוחיים 24 שעות לאחר הטרנספקציה, למרות שהנשימה הבסיסית, ייצור ה-ATP ודליפת הפרוטונים אינם מציגים שינויים משמעותיים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך יומיים.

החל מציפוי התאים ועד לגישה לתפקוד המיטוכונדריה, אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שקביעת צפיפות התאים האופטימלית חשובה ביותר לפני תחילת כל הליך אחר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו כדאיות תאים או בדיקות גליקוליטיות, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי השינויים המתרחשים בתפקוד המיטוכונדריה עקב ירידה בכדאיות התאים או שינויים במסלולים מטבוליים אחרים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תפקוד המיטוכונדריה לשימוש בתאים שלמים בתוך מיטוכונדריה מבודדת ובמגוון מחלות, כולל מחלות נוירולוגיות, סרטן או הפרעות מטבוליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגשת לתפקוד המיטוכונדריה בתאי אנדותל כלי דם במוח.