Name: הערכה של תפקוד Bioenergetic בתאי האנדותל מוחות דם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: חקור הערכת תפקוד מיטוכונדרי בתאי אנדותל מוחות דם לחקר מחלות נוירולוגיות ופיתוח טיפולים לשמירה על שלמות מחסום דם-מוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: AHA 16SDG31170008 ל-X.R. ו-NIH P20 GM109098, P01 AG027956 ו-U54 GM104942 ל-J.W.S.

הערה: התכנית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1, לרבות לוח זמנים של הנהלים. 1. התרבות מעבר של תאים CVE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי CVE (תאי bEnd.3) במדיום גידול מלא (גלוקוז גבוהה הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין בתוך בקבוק תרבות 2 רקמות T75 סנטימטר. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק את תרבית תאים בינונית. יש לשטוף את שכבת התאים עם פתרון EDTA 0.25% טריפסין-0.03%, ולאחר מכן להוסיף 1 - 2 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין-EDTA אל הבקבוק ולשמור את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 - 5 דקות. שים את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה עד שכבת התאים מנותקת. הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום הגידול להשלים לשאוב את התאים על ידי pipetting בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג נוזל ותאים לתוך צינור ספין צנטריפוגות 15 מ&quot;ל ב 700 XG במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מצינור צנטריפוגות. הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום הגידול להשלים מחדש להשעות את התא גלולה. ספין התאים ב XG 700 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מצינור צנטריפוגות. Re- להשעות את התא גלולה במדיום הגידול להשלים בריכוז של 2.0 × 10 5 תאים / מ&quot;ל (נקבע על ידי ספירת באמצעות hemocytometer; לכלול תאים מתים על ידי מכתים Trypan כחול). הערה: תאים מופשרים טרי הם תת תרבות לפחות 3 קטעים לניסויים. </li></ol> 2. זרע ולטפל תאים על צלחות תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על צלחת תרבית תאי שטף תאית 96-היטב: 80 μL / טוב. מניחים את צלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. הערה: 16 × 10 3 תאים לכל גם יגיעו 60 - 80% confluency בתוך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים נחשפים כימיקל, להוסיף הטיפולים פעם התאים מצורפים בתחתית הצלחת (8 - 24 שעות לאחר לראותדינג). הערה: בניסויים transfection, אל תוסיף אנטיביוטיקה במדיום הגידול להשלים. </li></ol> הערכה 3. פונקציה מיטוכונדריאלי באמצעות Bioanalyzer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת assay, מימה מחסנית חיישן שטף תאית עם calibrant על ידי הוספת 150 μL של תאי שטף calibrant פתרון לצלחת דוגרי O / N ב 37 מעלות צלזיוס ללא CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תחנת מכונת כביסת הצלחת, לשנות את מדיום תרבית תאים לתוך pH 7.0 בינוני assay שטף תאיים. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס ללא CO 2 למשך 30 - דקות 60. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות עבודה של 8 מיקרומטר oligomycin, 4.5 מיקרומטר FCCP, 10 rotenone מיקרומטר, ו -10 מיקרומטר antimycin DMEM. טען 25 μL של פתרונות מניות לתוך יציאות הזרקה מחסנית: נמל A, oligomycin; נמל B, FCCP; נמל C, rotenone ו- A antimycin עם מדיום assay שטף תאי. הטמע את פרוטוקול assay כמתואר בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המחסנית hydrated לתוך bioanalyzer ולבצע כיול על ידי לחיצה על כפתור &quot;התחל&quot;. לאחר הכיול יושלם, להסיר את הצלחת התחתונה המחסנית ולטעון צלחת התא על ידי לחיצה על פקודת &quot;ביטול טעינת המחסנית&quot;. המשך assay עד סוף כל המדידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ הנתונים ולקבל את ערכי שיעור מן bioanalyzer. לייצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני. </li></ol> 4. ניתוח נתונים הערה: החישובים עבור ניתוחי נתונים מנוסחים להלן. הערכים מתקבלים מכשיר bioanalyzer כמו OCR המוצג באיור 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב נשימה בסל, להפחית את הנשימה הלא המיטוכונדריה (מדידות 10 - 12) מהערך הבסיסי (מדידה 3). הערה: נשימה Basal = Basal - הלא המיטוכונדריה הנשימה = דרג ③ - שיעור ⑩ ~ ⑫. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב producti ATPעל, להפחית את הנשימה הצמודה ATP (מדידות 4 - 6) מהערך הבסיסי (מדידה 3). הערה: ייצור ATP = Basal - צמוד ATP נשימה = דרג ③ - שיעור ④ ~ ⑥. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב נשימה מקסימלי, להפחית את הנשימה הלא המיטוכונדריה (מדידות 10 - 12) מן הנשימה המקסימלי (מדידות 7 - 9). הערה: נשימה מרבית = נשימה מקסימלי - הלא המיטוכונדריה נשימה = דרג ⑦ ~ ⑨ - שיעור ⑩ ~ ⑫. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את קיבולת חילוף, לחסר הערך הבסיסי (מדידת 3) מן הנשימה המקסימלי (מדידות 7 - 9). הערה: לקיבולת = הנשימה מקסימלי - Basal = דרג ⑦ ~ ⑨ - שיעור ③. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב דליפת פרוטון, להפחית את הנשימה הלא המיטוכונדריה (מדידת 10 - 12) מן הנשימה הצמודה ATP (מדידת 4). הערה: דליפת פרוטון = נשימה צמודה ATP - הלא המיטוכונדריהl הנשימה = דרג ④ - שיעור ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47(2012).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li>
<li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li>
<li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li>
<li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke%3A+Mitochondrial+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinfect+Dis%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).</li>
<li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li>
<li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li>
<li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li>
<li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li>
<li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier%3A+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li>
<li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells%3A+A+role+for+mitoBKCa+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350(2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים ביחס למחקר, המחבר ו/או הפרסום של מאמר זה. עמלות גישה פתוחה עבור מאמר זה סופקו על ידי Agilent Technologies.

פרוטוקול זה מייצג שיטה להערכה של פנוטיפ bioenergetic בתאי האנדותל של כלי דם מוחיים. הוא משמש assay בסיסי להערכת המיטוכונדריה התא האנדותל, וזה הוא אופטימלי עבור ניסויים שנועדו לחקור את המנגנונים של גירויים שעשויים להשפיע על מסלול איתות המיטוכונדריה בתאי CVE. הוא גם מספק שיטה לבדיקה רפויה פוטנציאלי עבור מחלות הקשורות BBB-הפרעה. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול bioanalyzers שטף התאי יש את היכולת למדוד OCR בזמן אמת. ב assay זה, זיהוי צפיפות התאים המתאים הוא קריטי. אם צפיפות התאים נמוכה מ -8 × 10 3 תאים לכל היטב, OCR הבסיס נמוך מדי כדי להיות מנותח (איור 2 ואיור 3); אם צפיפות התאים הוא מעל 32 × 10 3 תאים לכל טוב, התאים אינם מגיבים oligomycin או FCCP מתכnts (איור 2 ואיור 3). צפיפות התאים האופטימלי עבור שורות התאים במודל ניסיוני שלנו הוא 16 × 10 3 תאים לכל טוב, אשר מביא לידי ביטוי בתוצאות לשכפול ורגישות לגירויים 7 וטיפולים 10,14. אם bioanalyzer 24 גם משמש, titrations החדש של צפיפות התאים יידרש עבור assay. זה מתועד שיש CVEs נפח גדול של המיטוכונדריה לעומת תאי אנדותל אחרים או סוגי רקמות 15,16, דבר המצביע על הצורך לייצור אנרגיה גדולים יותר פחות תאים למדידת מטבוליזם bioenergetics. בדקנו מספר סוגים של תאי אנדותל המוח, כגון יסודי וחטיבת הנציח בתאי האנדותל של כלי הדם במוח בעכברים 7 והנציח תאי האנדותל האדם כלי דם במוח (נתונים שלא פורסמו). תאים אלה נדרשים צפיפות תא דומה להגיע OCR OCR המקובל (הנשימה בסיסית תוך 40 - 160 pmol / min96-גם צלחות ו -50 - 400 pmol / min 24 גם צלחות) כאשר assay bioenergetics בוצע. Kaczara et al. דיווח מדידת חילוף החומרים bioenergetic בתאי האנדותל וריד אדם הטבור (HUVEC), אשר משמש צפיפות התאים גבוהה 17. הקבוצה שלנו לא להעריך תאי כלי מרקמות או איברים אחרים. באופן תיאורטי, bioanalyzer עלול לשמש על כל סוג תא, אבל זה דורש אופטימיזציה של assay עבור צפיפות התאים, תרבית תאים בינוני, ותנאי תרבות (כמה תאים ספציפיים עשויים לדרוש צלחות מצופות לגדול היטב). היא נדרשת כי הניסויים הושלמו כדי להבטיח את שיעור OCR הוא בטווח המקובל. אם OCR בתאי האנדותל מאיברים אחרים הוא נמוך יותר מאשר CVEs מן המוח, הגדלת צפיפות התאים יכול לעזור כדי לקבל בטווח OCR מקובל. לחלופין, אם התאים אינם באמצעות זירחון חמצוני כמקור האנרגיה העיקרי שלהם, bioanalyzer לא יהיה אופטימהassay l. Bioanalyzer מאפשר על ההפרעה הרציפה של שרשרת העברת אלקטרונים, המבוסס על ההסדר שבו ריאגנטים מוחלים. ראשית, oligomycin מוחל, אשר מעכב V קומפלקס המיטוכונדריה (synthase ATP). שנית, FCCP, גידול uncoupler אלקטרונים, מוחל, אשר מוביל שיבוש של שיפוע פרוטון. לבסוף, rotenone ו antimycin, אשר מעכבים לי תסביכים המיטוכונדריה ו- III, בהתאמה, מוחלים להביא עיכוב סך של זרימת אלקטרונים. סדר החשיפה לסמים חיוני כי התרופות לחסום את תגובת שרשרת העברת אלקטרונים הספציפית, והשינויים הרציפים ניתן למדוד כדי לשקף את הפונקציה של המיטוכונדריה. שינויים ופתרון בעיות כדי להעריך תגובה המיטוכונדריה לגירויים בתאי CVE, מומלץ כי הגירויים מוחלים על תאים לאחר שהתאים הם דבקו לתחתית צלחת תרבית תאים (ראה ציר הזמןשמוצג באיור 1; זה בדרך כלל לוקח לפחות 6 שעות). כדי להשיג תוצאות לשכפול על ידי טיפולים, חשוב מאוד לשמור על צפיפות התאים עקבית. אם pretreatments נועד לפני זריעת תאים, צפיפות תאים לכל טיפול קדם צריכה להימדד בזהירות, למעט התאים המתים זריעה. אם transfection נכלל בתכנון הניסוי, עיין בפרוטוקול transfection של היצרן. הפגינו הנתונים המוצגים באיור 4, miR-34a היה transfected לתוך התאים CVE באמצעות ערכת transfection lipofectamine, המחייב בינוני תרבית תאים ללא אנטיביוטיקה מבחן מיטו מתחים כדי להעריך את השינויים בתפקוד מטבולי עם ביטוי יתר של miR-34a . המינונים של פלסמיד עשוי גם להיות מותאם, כפי שפורסם בעבר 13. שינוי נוסף שניתן לעשות לפרוטוקול משתנה הריכוזים של חומרים כימיים. עקומת טיטרציה של oligomycin, FCCP, ו / או rotenone ו Antimycin A יכול להיות משליםטד. בנוסף, אם assay זה משמש תפוקה גבוהה מנתח של תרופות שונות, הוא הציע לכלול assay במקביל למדוד כדאיויות תא ובחלוקה של תאים, אשר תוארה בפרסומים הקודמים שלנו 7,13. ערכי OCR מושפעים באופן מהותי מספר סלולארי (איורים 2 ו -3), ואת מבחני התפשטות כדאי תא לטובת הנורמליזציה של הנתונים. עם זאת, השלים מבחנים אלה מסורים לשיקול דעתו של כל מעבדת פרט. מגבלות של הטכניקה המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שאנחנו רק משמשים מודל התרבות תאים במבחנה במחקר. נכון לעכשיו, אין מודלי vivo לשעבר זמינים או במודלים של בעלי חיים שעשויות לפתור פונקצית המיטוכונדריה תא האנדותל. דגמים חדשים צפויים להיות שפותחו עבור ההערכה של תפקוד bioenergetic in vivo ו <em&gt; vivo לשעבר במחקרים עתידיים. מגבלה נוספת היא הרחבה של הערכות מחסום בעקבות צעדי bioenergetics. הניסויים לא יכול להתבצע בגלל, הראשון, לאחר השלמת המדידות bioenergetic, את הכדאיות התא היא פחתה בעקבות שיבוש מוחלט של שרשרת העברת אלקטרונים; שני, תרבית תאים ספציפיות צלחות מוסיפות נדרשות לזהות ערכי bioenergetics ואינן תואמים את מוסיף להערכות מכשול. לכן, אין מבחנים תפקודיים רבים שיכולים להסתיים לאחר assay bioenergetics. עם זאת, צפוי כי מכשירים מיוחדים ניתן לפתח כדי לבצע מבחנים פונקציונליים לפני assay bioenergetics. משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות טכניקות קודמות לאבחון תפקוד המיטוכונדריה חייבו את הבידוד של המיטוכונדריה מתא 18. ne זהטכניקת w באמצעות bioanalyzer מאפשרת מדידה של פעילות המיטוכונדריה בתאים שלמים, שומר יותר של הסביבה התאית מאשר הערכת המיטוכונדריה מבודד. יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו פרוטוקול זה נועד ופתח עבור הקו הסלולרי bEnd.3, אבל זה גם תואם עם האנדותל של כלי דם מוחיים עיקריים (pCVE) תאים 7 או האנדותל אחר, ואנחנו הוכחנו זאת בפרסום הקודם שלנו באמצעות תאי pCVE 7. כאשר סוגים אחרים של האנדותל משמשים, הציפוי של הצלחת תרבות השימוש של גורמי גדילה ייתכן שיידרשו. עם זאת, assay טיטרציה מומלץ עבור סוגי תאים אחרים גם כן. פרוטוקול זה מציע שיטה כללית להינקט בהערכת bioenergetics של תאי CVE, והוא עשוי להיות מיושם נוסף ללימודי מנגנון או תגובות טיפוליות בצורה זו.

זה זוכה להכרה רחבה כי מחסום דם-מוח (BBB) ​​שהוקמה על ידי האנדותל של כלי הדם המוחיים (CVE) תאים יש מאוד מובחנת וייחודית פונקציות עליונה לביולוגיה וסקולרית. תאי אנדותל אלה להשתמש המיטוכונדריה לייצר את רוב אספקת הסלולר של אדנוזין אדנוזין (ATP) כמקור אנרגיה כימית. בנוסף לאספקת ATP עבור התאים CVE, המיטוכונדריה לווסת תהליכים תאיים שונים בתאי האנדותל של כלי הדם, כגון הסלולר איתות 1-4, אפופטוזיס 5, ובקרה על מחזור התא וצמיחה 6 תאים. Dysregulation של הפונקציה bioenergetic המיטוכונדריה בתאים CVE עשוי להשפיע biogenesis המיטוכונדריה, המוביל פעילות האנדותל של כלי דם פגומה וכן להחמיר מחלות כלי דם במוח והפרעות ניווניות, כגון שבץ 7,8 ומחלת אלצהיימר (AD) 9. אנחנו הוכחנו כי עלבונות לתאי CVE בעקבות חשיפת lipopolysaccharide (LPS) לפגוע בתפקוד המיטוכונדריה בתאים CVE ולהחמיר שבץ ותוצאות 7. טרט-butylhydroquinone (TBHQ) מגביר תמותה משבץ ידי הפרעה זרחון חמצוני בתאים CVE 10. לכן, המודל הכמותי של פונקציה bioenergetic בתאים CVE לא רק טייסים סדרת מחקרים הקשורים מנגנון מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות, אלא גם מספק פריצת דרך ההקרנה סמים תרופות מיקוד במיטוכונדריה בביולוגיה וסקולרית. המיטוכונדריה מבודד שמש כדי למדוד את תפקוד bioenergetic. אנחנו 7 ואחרים 11 דיווחנו הערכות של bioenergetics הסלולר בתאי CVE שלמים באמצעות bioanalyzer שטף תאי. המנתח מספק את היתרון של ערכת bioenergetic הסלולר אנדוגני. assay רגיש ועקבי זה מודד את מטבוליזם במיטוכונדריה של תאים CVE וניתן להשתמש בו כדי להעריך ירידת ערך bioenergetic ידי stiמולי, לחקור את המנגנונים של מסלולי איתות המיטוכונדריה, וסמי מסך או טיפולים המשפיעים על תפקוד המיטוכונדריה בתאי CVE. שיעור צריכת החמצן (OCR) נרשם על ידי bioanalyzer באמצעות גישה פרופיל תרופתי על ידי שילוב השימוש ארבעה משבשים המיטוכונדריה: oligomycin, קרבוניל ציאניד-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), rotenone, וא antimycin בפרוטוקול זה, פרטו לנו גישת אופטימיזציה המאפשרת למדידה וחישוב פרמטרים תפקודיים המיטוכונדריה בתאי CVE, כוללים נשימה המיטוכונדריאלי בסיס, ייצור ATP, דליפת פרוטון, נשימה מקסימלי, וקיבולת נשימת חילוף, ב assay אחד.

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 קו תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 מעברים</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)</td> <td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S12450</td><td>10% ריכוז סופי</td></tr><tr><td>פניצילין/סטפטומיצין</td><td>היקלון</td><td>SV30010</td><td>1& פעמים; 100 גרב</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין, 0.03% תמיסת EDTA</td><td>קורנינג</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>קורנינג</td><td>25-000-CI</td><td>1.0 & מיקרו; M ריכוז סופי</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 מ"מ ריכוז סופי</td></tr><tr><td>אוליגומיצין</td><td>סיגמא</td><td>O4876</td><td>1.0 ומיקרו; M ריכוז סופי</td></tr><tr><td>קרבונילציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי) פנילהידרזון (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0.5 ומיקרו; M ריכוז סופי</td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא</td><td>R8875</td><td>1.0 ומיקרו; M ריכוז סופי</td></tr><tr><td>אנטימיצין A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 ומיקרו; M ריכוז סופי</td></tr><tr><td>תחנת שטיפת צלחות</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שטף חוץ-תאי bioanayzer&nbsp; &nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאי שטף חוץ-תאית</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית חיישן שטף חוץ-תאי</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת קליברנט שטף חוץ-תאי</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת שטף חוץ-תאית בינונית</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH מאגר לפני הבדיקה</td></tr></tbody></table>

הערכה של תפקוד bioenergetic בתאי האנדותל מוחות דם

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

היושרה של מחסום הדם-מוח-המכשול (BBB) ​​היא קריטית כדי למנוע פגיעה מוחית. האנדותל של כלי דם במוח (CVE) תאים הם אחד מסוגי התאים המרכיבים את BBB; יש תאים אלה דרישת אנרגיה גבוהה מאוד, מחייב במיטוכונדריה אופטימלי. במקרה של מחלה או פציעה, הפונקציה של המיטוכונדריה בתאים אלה ניתן לשנות, כאשר התוצאה היא מחלת או פתיחת BBB. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה למדידת תפקוד המיטוכונדריה בתאים CVE באמצעות כולו, תאים שלמים וכן bioanalyzer. Assay Mito-מתח משמש לקרוא תיגר על התאים שעברו מוטרד, או פיזי או כימי, ולהעריך פונקצית bioenergetic שלהם. בנוסף, שיטה זו גם מספקת דרך יעילה להקרין רפויים חדשים בעלי השפעות ישירות על תפקוד המיטוכונדריה. יש לנו אופטימיזציה צפיפות התאים הדרושה כדי להניב שיעורי צריכת חמצן המאפשרים החישוב של מגוון רחב של פסק המיטוכונדריהמטרים, כולל ייצור ATP, נשימה מקסימלי, ואת לקיבולת. אנחנו גם להראות את הרגישות של assay על ידי הוכחה כי כניסתה של microRNA, miR-34a, מוביל לירידה בולטת לזיהוי בפעילות המיטוכונדריה. בעוד הנתונים המוצגים במאמר זה הוא אופטימיזציה עבור הקו הסלולרי bEnd.3, יש לנו גם מותאם הפרוטוקול עבור תאי CVE עיקריים, דבר המחזק את התועלת במודלים פרה-קליניים וקליניים.

כדי להעריך את תפקוד bioenergetic של תאים CVE בתגובה סטרס חמצוני, בחרנו הקו הסלולרי endothelia murine המוח כלי הדם bEnd.3, המציג אותם מאפיינים מחסום ההשוואה ליום לתאי אנדותל כלי הדם במוח העיקרי 12. בהתחשב בכך קינטיקה ואת העוצמת יחסי של תגובה הן מגוונים בין סוגי התאים השונים, סדרת הניסויים הראשונה נועדו להשיג רמות OCR למדידה על ידי זיהוי המספר האופטימלי של תאי bEnd.3 להשתמש ב assay על פרופיל מטבולים, המוצג איור 2. בעקבות ההערכה, הנתונים הם לכמת והציגו באיור 3. נשימה בסל, נשימה מקסימלי, וקיבולת נשימת חילוף הראתה תגובה מידתית עם צפיפות תאים. עם זאת, ייצור ATP ירד כאשר 64 × 10 3 תאים לכל טוב נבחרו, דבר המצביע על כך תרבית תאים על-ומחוברות הואלא מתאים לניסוי זה. הצפיפויות האופטימליות התא להתרחש בין 8 - 32 × 10 3 תאים לכל טוב, מבוסס על בתגובת משבשים המיטוכונדריה. בניסויים הבאים, צפיפות זריעה של 16 × 10 3 תאים לכל גם שמשה כדי לאפשר זיהוי אופטימלי של שינויי OCR. באמצעות 16 × 10 3 תאים לכל טוב, צפינו את התגובות הצפויות OCR והוכיח כי-34a miR microRNA מפחית במיטוכונדריה בתאים CVE (איור 4). יש לנו דיווח בעבר כי miR-34a מופחת זרחון חמצוני בתאים אלה 13. הניסויים חוזרים גם הראו כי נשימה מקסימלי לקיבולת ירדו באופן משמעותי על ידי ביטוי היתר של miR-34a ב CVEs ב 24 שעות שלאחר transfection, למרות הנשימה הבסיסית, ייצור ATP, ו דליפת פרוטון לא שינויים משמעותיים (איור 4) . נתונים אלהלהגיע לרגישות של bioanalyzer כדי לזהות שינויים בתפקוד המיטוכונדריה CVEs. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> איור 1. תכנון אסטרטגי עבור הניסוי. ציר הזמן בצינוק, צלחת, והכנת מחסנית מותווה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> איור 2. נציגי קבצי נתונים של פונקצית Bioenergetic בתאי CVE עם צפיפות תאים שונה. שיעורי חמצן צריכה נמדדו בתאי CVE עם צפיפות תאים שונה. הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 5); OCR: שיעור צריכת חמצן; FCCP: קרבוניל ציאניד-4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone;<html> רוט / Anti-A: rotenone ו antimycin א ①, ②, ו ③ מצביעים נשימה בסיסית; ④, ⑤, ו ⑥ מצביע ATP קשור נשימה; ⑦, ⑧, ו ⑨ מצביע נשימה מקסימלית; ⑩, ⑪, ו ⑫ מצביע נשימה הלא המיטוכונדריה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> איור 3. נציגי תוצאות של פונקצית Bioenergetic בתאי CVE עם צפיפות תאים שונה. נשימה בסל, ייצור ATP, נשימה מקסימלי, ואת לקיבולת מחושבות מתוך הנתונים הגולמיים שהופקו על ידי bioenergetics assay התפקודית באיור 2 תוך שימוש בנוסחות מפורטת בסעיף 4 . הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 5); OCR: שיעור צריכת החמצן.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> איור 4: נציג תוצאות של פונקציה Bioenergetic מתחלש מיר-34a (א) נתונים גולמיים של פונקציה מיטוכונדריאלי הבאים ביטוי יתר של miR-34a ב 24 שעות שלאחר transfection.. (ב) נשימה בסל, ייצור ATP, הנשימה מקסימלי, ואת לקיבולת מחושבים מתוך הנתונים הגולמיים שהופקו על ידי bioenergetics assay תפקודית באיור 4 א; הפרמטרים מחושבים על ידי הנוסחות מצוינות התבטאות יתר סעיף 4.-34a miR מפחית במיטוכונדריה בתאי CVE ב 24 שעות שלאחר transfection. הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 5); OCR: שיעור צריכת החמצן. ****, P &lt;0.0001.קבצים / ftp_upload / 54,847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> טבלת 1. פרוטוקול ההפעלה Instrument.

המיטוכונדריה תא האנדותל היא קריטית כדי לשמור על שלמות דם-מוח-מכשול. אנחנו מציגים את פרוטוקול למדידת תפקוד bioenergetic בתאי האנדותל של כלי דם מוחיים.

הערכה של תפקוד Bioenergetic בתאי האנדותל מוחות דם

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

המטרות הכלליות של הליך זה הן להעריך כיצד שינויים בתפקוד המיטוכונדריאלי משפיעים על התפתחותן של הפרעות נוירולוגיות ולתכנן טיפולים תרופתיים בעלי השפעה ישירה על פתיחות מחסום הדם-מוח. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההפרעות הנוירולוגיות, כגון כיצד ניתן למזער את מות התאים הנוירונליים לאחר שבץ מוחי? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הערכה בזמן אמת של התפקוד המיטוכונדריאלי בתאים שלמים שלמים.לאחר גידול תאי אנדותל של כלי דם מוחיים במצע מלא, בבקבוק תרבית רקמה של T75 סמ"ר, בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide עד להגעה ל-80% confluency, יש לשפוך את מצע תרבית התאים ולשטוף את התאים עם trypsin EDTA. לאחר מכן, יש להוסיף לבקבוק 1 עד 2 mL של trypsin EDTA טרי ולנתק את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר וידוא תחת מיקרוסקופ הפוך כי התאים התנתקו, יש לעצור את התגובה על ידי הוספה עדינה של 10 mL של מצע תאים מלא וטרי, ולהעביר את התאים לפפיה קונית של 15 mL לצורך סנטריפוגה.שפכו את הנוזל העליון ושטפו את המשקע ב-10 milliliters של מצע גידול מלא וטרי לצורך צנטריפוגה נוספת. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע במצע גידול מלא בריכוז של 2×10⁵ תאים ל-milliliter לצורך תרבית משנית. לאחר מספר מתאים של תרביות משניות, זרעו 1.6×10⁴ תאים ב-80 µL של מצע מלא לכל באער, אל תוך פלטת תרבית תאים לניטור שטף חוץ-תאי בעלת 96 באערים, והכניסו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide.כאשר התאים נצמדו לפלטה, הוסיפו את הטיפול הרלוונטי לבארים המתאימות והחזירו את התאים לאינקובטור. ביום שלפני בדיקת הערכת התפקוד המיטוכונדריאלית, הידרו את מחסירת ה-extracellular flux censor באמצעות 150 µL של תמיסת כיול extracellular flux והדגירו את הפלטה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C ללא פחמן דו-חמצני. למחרת בבוקר, השתמשו בתחנת שטיפת הפלטות כדי להחליף את מצע תרבית התאים למצע extracellular flux assay ב-pH 7.0.לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C, ללא פחמן דו-חמצני, למשך 30 עד 60 דקות. לאחר שהתאים הגיעו לשיווי משקל, הכניסו את המחסנית ההידרטית ל-Bioanalyzer ולחצו על כפתור ה-Start כדי להתחיל את הכיול. בסיום הכיול, לחצו על ההודעה Unlock Cartridge כדי להסיר את לוחית התחתית של המחסנית ולהכניס את לוחית התאים.לאחר מכן, פתחו את קובץ הנתונים כדי להפיק את ערכי הקצב מה-Bioanalyzer לצורך ייצוא לקובץ הגיליון. מאחר שהקינטיקה והעוצמה היחסית של התגובות משתנות בין סוגי תאי האנדותל של כלי הדם המוחיים השונים, בניסויים אלו נעשה שימוש בסדרה של ריכוזי תאי bEnd. 3 כדי לזהות את מספר התאים האופטימלי למדידת רמות קצב צריכת החמצן בבדיקת פרופיל מטבולי.כפי שנראה, הנשימה הבסיסית והמקסימלית והקיבולת הנשימתית הרזרבית מראות תגובה פרופורציונלית לצפיפות התאים. עם זאת, ייצור ATP פוחת כאשר נעשה שימוש בריכוז התאים הגבוה ביותר לבאר, מה שמרמז שתרבית תאים בעודף התמסרות (over confluent) אינה מתאימה לניסוי. נראה כי צפיפויות התאים האופטימליות מופיעות בטווח הבינוני של מספר התאים לבאר.לפיכך, רמות קצב צריכת החמצן הצפויות נבדקו בניסוי מייצג זה תוך שימוש בריכוז תאים בטווח בינוני, מה שהוכיח כי מולקולות precursor mRNA שאינן מקודדות מפחיתות את התפקוד המיטוכונדריאלי בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים. ניסויים אלו מדגימים גם כי הנשימה המקסימלית והקיבולת הרזרבית (spare capacity) פוחתות באופן משמעותי כתוצאה מביטוי יתר של מולקולות אלו בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים 24 שעות לאחר הטרנספקציה, למרות שהנשימה הבסיסית, ייצור ה-ATP ודליפת הפרוטונים אינם מראים שינויים משמעותיים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך יומיים.החל מזריעת התאים ועד לבדיקת התפקוד המיטוכונדריאלי, אם הפעולה מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שקביעת צפיפות התאים האופטימלית היא קריטית לפני תחילת כל הליכים אחרים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון בדיקות חיוניות תאים (cell viability) או בדיקות גליקוליטיות, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי השינויים המתרחשים בתפקוד המיטוכונדריאלי כתוצאה מירידה בחיוניות התאים או משינויים במסלולים מטבוליים אחרים.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום התפקוד המיטוכונדריאלי לשימוש בתאים שלמים בתוך מיטוכונדריה מבודדת ובמגוון מחלות, כולל מחלות נוירולוגיות, סרטן או הפרעות מטבוליות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לבחון את התפקוד המיטוכונדריאלי בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים.

evaluation-bioenergetic-function-cerebral-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

סרטון זה מדגים את הערכת התפקוד המיטוכונדריאלי של תאי אנדותל כלי דם מוחיים (CVE) באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאי. תאי CVE מצופים בלוח תרבית תאי שטף חוץ-תאי. חיישני שטף חוץ-תאיים עוברים הידרציה לפני טעינה וכיול לתוך הביואנלייזר. הלוח המכיל תאים נטען לאחר מכן לניתוח.

הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי בתאי אנדותל כלי דם מוחיים

תפקוד לקוי של האנדותל קשור למצבי מחלה רבים והוא ניבוי של אירועי לב וכלי דם שליליים בבני אדם. הרחבת כלי דם בתיווך זרימה (FMD) היא שיטת אולטרסאונד לא פולשנית של הערכת תפקוד האנדותל. אפשרויות המתודולוגיות וניסיון מפעיל עשויות להשפיע על תוצאות. גישה שיטתית לFMD במחקרים בבני אדם נדונה כאן.

אולטראסאונד הערכה של האנדותל-Dependent זרימה בתיווך התרחבות של עורק הזרוע במחקר קליני

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

המאמר הנוכחי מתאר את השיקולים המתודולוגיים למספר הערכות לא פולשניות של תפקוד כלי הדם והמורפולוגיה המשמשות בדרך כלל במחקר רפואי להערכת שלבים שונים של טרשת עורקים.

גישה המתודולוגית להערכות לא פולשני של תפקוד כלי דם ומורפולוגיה

אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

פרוטוקול זה מתאר מודל אמין ויעיל במבחנה של מחסום הדם במוח. השיטה משתמשת בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים בעכבר bend.3 ומודדת התנגדות חשמלית טרנסממברנלית.

רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל

כאן אנו מדגימים את הטכניקה של שימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה: ECIS ו- cellZscope, למדידת חוזק מחסום אנדותל במוח. אנו מפרטים את ההכנה והטכניקה של הוספת גירויים שונים למודל in vitro של אנדותל המוח. אנו מודדים, רושמים ונותנים ניתוח מייצג של הממצאים.

מדידת שינויים בשלמות מחסום האנדותל במוח באמצעות שני חיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה בתגובה לתאים סרטניים וציטוקינים

חקור הערכת תפקוד מיטוכונדרי בתאי אנדותל מוחות דם לחקר מחלות נוירולוגיות ופיתוח טיפולים לשמירה על שלמות מחסום דם-מוח.

הערכה של תפקוד Bioenergetic בתאי האנדותל מוחות דם

גלה סרטונים נוספים