Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק מדריך שלב אחר שלב ליישום מודל עכברים עם cefoperazone להדבקה ב-Clostridium difficile, תוך דגש מיוחד על ניטור מחלה קלינית, ספירת חיידקים, ציטוטוקסיות של רעלים ושינויים היסטופתולוגיים לאחר ההדבקה. פרוטוקול מפורט זה יסייע לחוקרים לבצע במדויק מודל עכברים של הדבקה ב-Clostridium difficile, דבר החיוני לחקר הפתוגנזה של חיידק זה ולהערכת טיפולים חדשניים. היתרון העיקרי בשימוש במודל עכברים זה הוא שחשיפה לאנטיביוטיקה אחת למשך חמישה ימים הופכת את העכברים לרגישים לקולוניזציה של C.difficile ולמהלך קליני ממושך של זיהום המקביל למחלה בבני אדם.

כדי להתחיל, קחו את זן המאגר של ה-C.difficile הרלוונטי ובצעו ערבול ב-vortex. תחת מנדף זרימה למינרית, דללו את המאגר במים סטריליים בתוך מבחנה עם פקק הברגה לריכוז של עשרה בחזקת חמשה נבגים ל-25 מיקרוליטר. סמנו את התערובת כאינוקולום נבגים (spore inoculum) והניחו את המבחנה באמבט מים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

בשלב הבא, תחת מנדף זרימה למינרית, העבירו באמצעות פיפטה 50 מיקרוליטר מהאינוקולום של הנבגים המחומם אל מבחנה סטרילית למיקרוצנטריפוגה, והעבירו אותה אל התא האנאירובי עד לשימוש הבא. טענו את יתרת האינוקולום של הנבגים למזרק של מיליליטר אחד המחובר למחט סטרילית בעלת קצה בולב להזנה גסטרית (gastric gavage). תחת מנדף זרימה למינרית, קחו עכבר ניסוי וקבעו את ראשו על ידי החזקה עדינה של בעל החיים בעור הרפוי של הצוואר והגב.

בעזרת האצבע המורה, תוך וידוא שהבעל החיים אינו משמיע קולות או מראה סימני מצוקה, קבע את ראשו של בעל החיים בצורה יציבה יותר והארך את הוושט. החזק את העכבר במצב אנכי וזקוף, והחדר בעדינות את מחט ה-gavage לצד הפה. כוון את מחט ה-gavage לאורך חך הפה והחדר אותה באיטיות אל תוך הוושט.

כאשר המחט נמצאת בערך במחצית הדרך אל תוך הוושט, הזריק 25 מיקרוליטר של תמיסת נבגים (spore inoculum) ולאחר מכן הוצא את המחט בעדינות. החזר את בעל החיים לכלובו, ועקוב אחר סימנים לשיעול או למצוקה נשימתית שעלולים להעיד על מתן שגוי לתוך הקנה. לאחר מכן, קח את מנת תמיסת הנבגים שנשמרה קודם לכן בתא האנאירובי, וכל שארית של תמיסת נבגים שנותרה מהמתן ב-gavage, ובצע דילולים סדרתיים של 1:10 ב-180 מיקרוליטר של PBS בריכוז 1x.

בצעו ארבע עד חמש מהדלעות אלו. תוך שימוש בטכניקה אספטית, העבירו 100 µL מכל דלואציה סדרתית לצלחת TCCFA נפרדת. בכל פעם, השתמשו במפזר סטרילי חד בצורת L כדי לפזר באופן שווה את האינוקולום של הדלואציה על כל צלחת.

דגרו את הצלחות תחת תנאים אנאירוביים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לבסוף, ספרו את מושבות ה-C.difficile בכל צלחת דילול וחשבו את יחידות יוצרות המושבות (CFU) כדי לקבוע את המנה הזיהומית שהועברה לעכברים. כדי לאסוף דגימות צואה מהעכברים לצורך הערכה, ראשית רסנו קלות אך בחוזקה את העכבר הנבדק על ידי תפיסת העור הרפוי בצוואר ובגב, תוך וידוי שהבעל חיים אינו נמצא במצוקה.

בעזרת הזרת, הרימו בעדינות את זנבו של בעל החיים כדי לחשוף את פי הטבעת. החזיקו מבחנת מיקרוצנטריפוגה סטרילית בעלת משקל ידוע ישירות מתחת לפי הטבעת של בעל החיים, תוך וידוא שהמבחנה אינה נוגעת ישירות בעכבר. כאשר בעל החיים מקריא, אספו את גלגול הצואה לתוך המבחנה.

יש לאחסן את המבחנה בטמפרטורת החדר עד לאיסוף כל הדגימות הדרושות. שקלו את המבחנות המכילות צואה במאזניים אנליטיים ורשמו את המסה עד לארבע ספרות אחרי הנקודה. חשבו את משקל כדור הצואה על ידי חיסור משקל המבחנה.

בשלב הבא, חשבו דילול של 1:10 של התוכן ותלו אותו מחדש ב-1x PBS. השתמשו בקצה הפ pipette כדי לפרק בעדינות את תוצרי ההפרשה לתוך התמיסה. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי לאפשר לתוכן לשקוע.

תוך שמירה על התמיסות בתנאים אנרוביים, בצעו דילולות סדרתיות עבור כל דגימה ב-1x PBS. העבירו 100 µL מכל דילול סדרתי אל צלחות TCCFA. השתמשו במפזר סטרילי בצורת L ופזרו את החומר באופן שווה על הצלחות.

דגרו את הצלחות הפטריות בתנאים אנארוביים ב-37 °C למשך 24 שעות. לבסוף, ספרו את מושבות ה-C.difficile וחשבו את מספר היחידות יוצרות המושבות (CFU) לגרם של תוכן צואתי. איור זה מציג את משקל העכבר בימים שלאחר החשיפה ל-C.difficile R20291.

ביום אפס, משקל הבסיס נקבע ל-100. משקל גוף ממוצע של העכברים נמדד מדי יום לאחר מכן, למשך 14 ימים. נצפתה ירידה משמעותית במשקל בעכברים שעברו את האתגר ביום השני עד השביעי לאחר האתגר.

נראה כי העכברים החלימו והחזירו את משקלם לאחר נקודה זו. כאן מוצג עומס ה-C.difficile בצואה בימים שלאחר ההדבקה. 24 שעות לאחר ההדבקה, כל העכברים היו מקולונזים ב-10^7 CFUs לגרם צואה.

עומס זה פחת החל מהיום השביעי ואילך, אף ש-C.difficile עדיין היה נוכח. בדיקה היסטופתולוגית של העכברים לאורך השלב הזמני של הזיהום הראתה את השינויים הפתולוגיים המשמעותיים ביותר במעי העיוור (cecum). ציונים היסטולוגיים כוללים של המעי העיוור היו שונים באופן מובהק בין היום האפס לבין היום השני והרביעי לאחר החשיפה.

באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את מודל עכברים זה עלולים להיתקל בקשיים בחישוב ובהכנת תכשיר נבגי הספורים המשמש להדבקת העכברים, וכן בחישוב העומס החיידקי של C.difficile בצואה. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי שינויים במינון או בזן של נבגי C.difficile המוענקים לעכברים עשויים לשנות את תוצאות המודל.