Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי Clostridium difficile R20291 הזנים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק מדריך צעד אחר צעד ליישום מודל עכבר cefoperazone של זיהום Clostridium difficile, עם דגש מיוחד על ניטור מחלות קליניות, ספירת חיידקים, ציטוטוקסיות רעלנים ושינויים היסטופתולוגיים לאחר האתגר. פרוטוקול מפורט זה יעזור לחוקרים לבצע במדויק מודל עכבר של זיהום קלוסטרידיום דיפיצילה, החיוני לחקר הפתוגנזה של חיידק זה וגישה לטיפולים חדשים. היתרון העיקרי בשימוש במודל עכברי זה הוא שחשיפה לאנטיביוטיקה אחת למשך חמישה ימים הופכת את העכברים לרגישים להתיישבות של קלוסטרידיום דיפיצילה ולמהלך קליני ממושך של זיהום במקביל למחלה אנושית.

כדי להתחיל, קח את זן המניות של C.difficile של עניין ומערבולת. במכסה זרימה למינרית, יש לדלל את המלאי במים סטריליים בצינור מכסה בורג לריכוז של עשרה עד חמישי נבגים לכל 25 מיקרוליטר. סמנו את התערובת כחיסון נבגים והכניסו את השפופרת לאמבט מים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, במכסה הזרימה הלמינרית, פיפטה 50 מיקרוליטר של חיסון הנבגים המחומם לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי והעבירו אותו לתא האנאירובי עד לשימוש נוסף. טען את חיסון הנבגים הנותר למזרק מיליליטר אחד המחובר למחט קיבה סטרילית עם קצה נורה. במכסה מנוע זרימה למינרית, קח עכבר נושא ושתק את הראש על ידי ריסון החיה בעדינות על ידי העור הרפוי של הצוואר והגב.

שימוש באצבע המורה, והקפדה על כך שהחיה לא תשמיע קול או תראה סימני מצוקה, משתקים עוד יותר את ראש החיה ומאריכים את הוושט. שמור על העכבר במצב אנכי זקוף והעביר בעדינות את מחט הגאווג' לצד הפה. כוון את מחט הגאווג' לאורך גג הפה וקדם אותה לאט לאט לוושט.

ברגע שהמחט נמצאת בערך באמצע הדרך לוושט, הזריק 25 מיקרוליטר של חיסון נבגים ולאחר מכן משוך בעדינות את המחט. החזר את בעל החיים לכלוב שלו, וצפה בו לאיתור סימנים של שיעול או מצוקה נשימתית שעלולים להצביע על מתן קנה הנשימה בשוגג. לאחר מכן, קח את חיסון הנבגים המאוחסן בעבר בתא האנאירובי, ואת כל חיסון הנבגים שנותר, ובצע 1 עד 10 דילולים סדרתיים ב-180 מיקרוליטר של 1x PBS.

בצע ארבעה עד חמישה מהדילולים הללו. בטכניקה אספטית, העבירו 100 מיקרוליטר מכל דילול סדרתי לתוך צלחת TCCFA בודדת. לוקחים מפזר סטרילי חדש בצורת L בכל פעם, מחלקים באופן שווה את חיסון הדילול על כל צלחת.

דגרו את הצלחות בתנאים אנאירוביים למשך 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, ספרו את מושבות C.difficile על כל צלחת דילול וחשבו את היחידות היוצרות מושבה כדי לקבל את המינון הזיהומי הניתן לעכברים. כדי לאסוף דגימות צואה מעכברים להערכה, תחילה רסנו את העכבר הנבדק בקלילות אך בחוזקה על ידי העור הרפוי בצוואר ובגב, כדי לוודא שהחיה אינה במצוקה.

בעזרת האצבע הזרת, הרם בעדינות את זנב החיה, וחשוף את פי הטבעת. החזק צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי במשקל ידוע ישירות מתחת לפי הטבעת של החיה, וודא שהצינור אינו נוגע ישירות בעכבר. כאשר בעל החיים עושה את צרכיו, אסוף את גלולת הצואה בצינור.

אחסן את הצינור בטמפרטורת החדר עד לאיסוף כל הדגימות הדרושות. שקלו את הצינורות המכילים צואה בקנה מידה אנליטי ורשמו את המסה לארבעה מקומות עשרוניים. חשב את משקל הגלולה הצואתית על ידי הפחתת משקל הצינור.

לאחר מכן, חשב דילול של 1 עד 10 של התוכן והשהה מחדש ל-1x PBS. השתמש בקצה הפיפטה כדי לשבש בעדינות את החומר הצואתי לתמיסה. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואפשרו לתוכן להתייצב.

שמירה על התמיסות בצורה אנאירובית, בצע דילולים סדרתיים עבור כל דגימה ב-1x PBS. העבירו 100 מיקרוליטר מכל דילול סדרתי על לוחות TCCFA. השתמש במפזר סטרילי בצורת L ומרח את המדיה באופן שווה על הצלחות.

דגרו את הצלחות בתנאים אנאירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לבסוף, ספרו את מושבות C.difficile וחשבו את יחידת יצירת המושבה לגרם של תכולת צואה. איור זה מציג את משקל העכבר בימים שלאחר האתגר עם C.difficile R20291.

ביום האפס, המשקל הבסיסי מוגדר ל-100. משקל הגוף הממוצע של העכבר נמדד בכל יום לאחר מכן, במשך 14 ימים. ירידה משמעותית במשקל נצפתה בעכברים מאותגרים בימים השני עד השביעי לאחר האתגר.

נראה כי עכברים התאוששו ועלו במשקל לאחר נקודה זו. כאן, מוצג עומס C.difficile בצואה בימים שלאחר האתגר. ב-24 שעות לאחר האתגר, כל העכברים היו מיושבים עם 10 עד 7 CFUs לכל גרם צואה.

עומס זה ירד ביום השביעי ואילך, אם כי C.difficile עדיין קיים. בדיקה היסטופתולוגית של עכברים במהלך ההדבקה הראתה את השינויים הפתולוגיים המשמעותיים ביותר בצקום. הציונים ההיסטולוגיים הכוללים של הצקל היו שונים באופן מובהק בין יום האפס לימים השני והרביעי שלאחר האתגר.

בדרך כלל, אנשים חדשים במודל עכבר זה עשויים להיאבק בחישוב ובהכנה של חיסון הנבגים המשמש לאתגר העכברים ובחישוב העומס החיידקי הצואתי. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור ששינויים במינון או בזן של נבגי C.difficile הניתנים לעכברים עשויים לשנות את התוצאה של מודל זה.