Name: בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: חקור הרכבת פרוטאזום רקומביננטי באמצעות ביטוי משותף של תת-יחידות וערבוב לאחר פירוק תאים. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מוליכי ביניים בהרכבת המרכב החלבוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק קרנות לתשתיות למחקר (RSFG) מאוניברסיטת אינדיאנה-Purdue University, אינדיאנפוליס, ובחלקה על ידי בפרס של איגוד הלב האמריקאי 14GRNT20390154, כדי ARK

<ol><li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panorama+of+ancient+metazoan+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes.</a> Nature. 525, 339-344 (2015).</li>
<li>Marsh, J. A., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+dynamics%2C+assembly%2C+and+evolution+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).</li>
<li>Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+macromolecular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in macromolecular assembly.</a> Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).</li>
<li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li>
<li>Groll, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+20S+proteasome+from+yeast+at+2.4+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution.</a> Nature. 386, 463-471 (1997).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+subunit+architecture+of+the+proteasome+regulatory+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle.</a> Nature. 482, 186-191 (2012).</li>
<li>Lowe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+20S+proteasome+from+the+archaeon+T.+acidophilum+at+3.4+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution.</a> Science. 268, 533-539 (1995).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+proteasome+and+mechanism+of+inhibition+by+a+peptidyl+boronate%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate.</a> Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).</li>
<li>Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+elements+in+proteasome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical elements in proteasome assembly.</a> Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).</li>
<li>Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+the+maturation+and+regulation+of+archaebacterial+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes.</a> J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).</li>
<li>Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+denaturation+and+elevated+folding+temperatures+are+required+for+wild-type+activity+and+stability+of+recombinant+Methanococcus+jannaschii+20S+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome.</a> Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).</li>
<li>Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+the+20S+proteasome+from+the+methanoarchaeon+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila.</a> J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).</li>
<li>Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteasome+from+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila.</a> J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperonin-mediated+protein+folding%3A+GroES+binds+to+one+end+of+the+GroEL+cylinder%2C+which+accommodates+the+protein+substrate+within+its+central+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity.</a> EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+subunit+assembly+into+respiratory+chain+complexes+using+Blue+Native+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).</li>
<li>Tomko, R. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+the+Rpn12+subunit+couples+completion+of+proteasome+regulatory+particle+lid+assembly+to+lid-base+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining.</a> Mol Cell. 44, 907-917 (2011).</li>
<li>Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-ring+Independent+Assembly+of+the+20S+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome.</a> Sci Rep. 5, 13130(2015).</li>
<li>Zimmerman, S. B., Trach, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+macromolecule+concentrations+and+excluded+volume+effects+for+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).</li>
<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+20S+proteasome+assembly+factor+requires+a+C-terminal+HbYX+motif+for+proteasomal+precursor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Chen, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocatalytic+subunit+processing+couples+active+site+formation+in+the+20S+proteasome+to+completion+of+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly.</a> Cell. 86, 961-972 (1996).</li>
<li>Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li>
<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מדגימים את היתרון של גישה משולבת לניתוח הרכבה הפרוטאזום ידי nondenaturing עמוד באמצעות פרוטאזומים archaeal רקומביננטי. 9,11 השיטה הרגילה של Coexpression בקטריאלי של יחידות משנה הפרוטאזום מאפשר ניתוח מהיר אבל לא יכול לחשוף ביניים הרכבה מפתח. אנו מציעים שילוב Coexpression עם lysate ערבוב לפתח תמונה רחבה יותר של אירועי הרכבה. היתרון של גישה משולבת זו הוא שלמרות מחייב ביטוי נפרד של α ובטא יחידות משנה ע...

מתחמי multiprotein לבצע פעילות הסלולר קריטית רבה 1. עבור רבי קומפלקסים אלה, הרבה יותר ידוע על המבנה שלהם ותפקוד מאשר על ההרכבה שלהם 2,3. הפרוטאזום הוא מורכב אחד כזה והוא נמצא בכל תחומי החיים. אאוקריוטים, מכונה מולקולרית זה הוא הליבה של המערכת הפרוטסומית / יוביקוויטין (UPS) ומספק את המסלול העיקרי של פירוק חלבונים תאיים 4. הפרוטאזום איקריוטיים (המכונה הפרוטאזום 26s) מורכב משני מכלולים תת מרכזיים: א הפרוטאזום 20S, או חלקיקי Core (CP) 5, שניתן כתרים על קצוות אחד או שניהם על ידי חלקיק 19S תקין (RP) 6. הפרוטאזום 20S הוא פרוטאז מידור גדול. המבנה הרביעון שלה נשמר לחלוטין בכל תחומי חיים והוא מורכב ערימה של ארבע טבעות שבע membered המכיל שני סוגים של יחידות משנה הקשורות מבני, α; ובטא 5,7,8. אאוקריוטים, שתי הטבעות החיצוניות כל מונה שבע יחידות משנת α ברורות ואת שתי הטבעות פנימיות כל מונה שבע יחידות משנת β ברורות; פעילות פרוטאוליטים מתגוררת בתוך שלוש של יחידות מהשנה β. לעומת זאת, טבעות CP של קדומים וחיידקים הן בדרך כלל מורכבות רק סוג אחד של α וסוג אחד של למקטע β. פרוטאזומים Archaeal סיפקו מערכת מודל חשוב ללמוד הרכבה הפרוטאזום הן בשל פשטות ההלחנה שלהם ושיתוף שלהם מנגנון הרכבה משותף עם עמיתיהם איקריוטיים שלהם 9-13. בקיצור, יחידות משנה α להרכיב לטבעות α ראשונה, אשר לשמש פיגום שעליו בטא יחידות משנה להרכיב. וכתוצאה מכך חצי פרוטאזומים (α 7 β 7) dimerize, והוליד התאספו מלא CP (α 7 β 7 β 7 α 7). במהלך dimerization, את propeptides להציג על יחידות משנה בטאיוסרו autocatalytically, חשיפת threonines N-terminal קטליטי. השימוש פרוטאזומים archaeal מודל הרכבה לעתים קרובות מנצל את הייצור של חלבונים הפרוטאזום archaeal רקומביננטי coli Escherichia. זוהי גישה כדאית משום שהוא מאפשר יחידות משנה להיות מיוצר בצירופים שונים, כמו גם WT וגרסאות מוטציה, בתוך הפונדקאי כי אינו מייצר פרוטאזומים משלה. ניטור ההרכבה של קומפלקסי חלבונים רבים ביוכימית דורש סוג כלשהו של שיטת חלוקת המפריד מתחמים מורכבים במלואו מן ביניים ומבשרי הרכבה. בשל יכולת בפתרון מעולה, nondenaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד) הוכיח להיות שימושי במיוחד החלוקה של מתחמי multiprotein גדולים השונים 14-17. השילוב של ייצור הפרוטאזום archaeal רקומביננטי עמוד nondenaturing הפכה גישה חזקה ב dissectinהפרוטאזום גרם הרכבת 9,11,12,18. עם זאת, השיטה הרגילה על ידי איזו גישה זו מיושמת (כלומר. דרך Coexpression רקומביננטי של יחידות משנת α ו β) יש חסרון חשוב. תגובות עצרת מאורגנות על בסיס שיתופיות וריכוז-תלוי מאוד 3. בהתחשב בכך את ריכוז החלבון בתוך התאים הוא גבוה מאוד 19, בשל תופעות נפח נשלל, תגובות הרכבה להמשיך במהירות in vivo. מכאן אפשר לפספס ביניים הרכבה חשובים כאשר יחידות משנת α ו β הן coexpressed. כאן, אנו טוענים בגישה המשולבת במחקר של הרכבה הפרוטאזום באמצעות יחידות משנה הפרוטאזום archaeal רקומביננטי. לפי גישה זו, הן שיטות ערבוב Coexpression ו lysate מועסקים. הראשון מאפשר ניתוח מהיר של הרכבה כי Coexpression הוא פחות עבודה אינטנסיבית. זה האחרון תלוי ביטוי נפרד של תת-יחידות α ו β, ואחריו ערבוב. למרות requi זהמיל קצת יותר מאמץ מאשר Coexpression, זה בהחלט פיצו על ידי היכולת לזהות ביניים כי הם הפסידו במהלך Coexpression. יחד, שתי שיטות יכולות לספק תמונה שלמה יותר של הרכבה הפרוטאזום.

<table><tbody><tr><td>תמיסת אקרילאמיד (40%)</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>אקרילאמיד לא פולימרי הוא רעלן עצבי. ללבוש ציוד מגן מתאים</td></tr><tr><td>Amicon אולטרה 0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים</td><td>EMD UFC501024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת BCA</td><td>פירס</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ביסקרילאמיד (2%)</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 תאים מוכשרים</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>מגיב כתמים קולואידי לג'לים</td></tr><tr><td>מערכת Gel doc EZ</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>מערכת תיעוד ג'ל</td></tr><tr><td>משחררי ג'ל</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>פלסטיק בצורת טריז המשמש להפרדת לוחות ג'ל; שימושי לפיזור נוזלים.</td></tr><tr><td>מוט זכוכית</td><td>תרמו פישר</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>תרמו פישר</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>תרמו פישר</td><td>14-813-38</td><td>מזרק זכוכית להעמסת ג'לים</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ארה"ב ביולוגית</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW ערכת כיול מקורית</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>תקני חלבון במשקל מולקולרי גבוה</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>יצרנית שיפוע</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>לאינדוקציה של ביטוי חלבון</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<>sub2</td><td>Fluka אנליטי</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>מיני פרוטאן Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>מכשיר אלקטרופורזה ג'ל</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>מעכב פרוטאז</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>ביטוי פלסמיד</td></tr><tr><td>דיוק בתוספת כל תקן</td><td>כחול Biorad</td><td>1610373</td><td>תקן חלבון מולקולרי תקן עבור SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ערכת מוטגנזה Quickchange</td><td>טכנולוגיות Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>מצע פלואורוגני</td></tr><tr><td>שרף זיקה למתכת Talon</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>שרף זיקה קובלט משותק</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגש דגימת UV</td> 211699 <td>Biorad</td><td>1708271</td><td>להדמיית UV של ג'לים</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי archaeal הפרוטאזומים ועמוד nondenaturing: the case for גישה משולבת

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

הפרוטאזומים נמצאים בכל תחומי החיים. הם מספקים את המסלול העיקרי של פירוק חלבונים תאיים אאוקריוטים, אם כי הרכבה שלהם אינה מובנת לחלוטין. כל פרוטאזומים מכילים חלקיק הליבה נשמרת מבנית (CP), או הפרוטאזום 20S, המכיל שתי טבעות למקטע β heptameric דחוקה בין שתי טבעות למקטע α heptameric. פרוטאזומים 20S Archaeal פשוטים לעומת בעלי הרכב לעמיתיהם איקריוטיים שלהם, בעודם חולקים מנגנון הרכבה משותף. כתוצאה מכך, פרוטאזומים 20S archaeal להמשיך להיות מודל חשוב להרכבת הפרוטאזום איקריוטיים. באופן ספציפי, ביטוי רקומביננטי של פרוטאזומים 20S archaeal בשילוב עם ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide nondenaturing (עמוד) הניב תובנות חשובות רבות לתוך biogenesis הפרוטאזום. כאן, אנו דנים אמצעי לשפר את האסטרטגיה הרגילה של Coexpression של α הפרוטאזום archaeal ובטא יחידות משנה לפני nondenaturing עמוד. אנו מראים כי למרות מהירים ויעילים, גישת Coexpression לבדו יכולה לפספס ביניים הרכבת מפתח. במקרה של הפרוטאזום, Coexpression לא יכול לאפשר זיהוי של-הפרוטאזום וחצי, טבעת-α מלאה המכילה ביניים אחת β-טבעת אחד שלם. עם זאת, ביניים זו מזוהה בקלות באמצעות ערבוב lysate. אנו מציעים שילוב Coexpression עם ערבוב lysate מניב גישה יותר יסודית בניתוח הרכבה, עדיין נותר העבודה nonintensive. גישה זו עשויה להיות שימושית לחקר מתחמי multiprotein רקומביננטי אחרים.

הפרוטאזום הרכבה (איור 1) מתחילה כאשר יחידות משנת אלפא לשלב טבעות טופס 9. אפשר להדגים זאת כאשר יחידות משנה אלפא מן archaeon Methanococcus maripaludis S2 מבוטאים החיידק כמו C- סופני hexahistidine מתויג (מתויג שלו) נגזרים (טבלה 1). כאשר α-שלו רקומביננטי החלבון היה מטוהר על ידי קואליציית עיקר ונותח על ידי nondenaturing עמוד, שתי להקות נצפו (איור 2 א &#39;, מסלול 1). אנחנו הוכחנו בעבר כי אלה מתאימים טבעות α...

פרוטוקול זה משתמש בשני Coexpression למקטע ו למקטע postlysis ערבוב לבדיקה יסודית יותר של הרכבת הפרוטאזום רקומביננטי.

בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לנתח הרכבה של קומפלקס רב-חלבוני כגון הפרוטאוזום, באמצעות תתי-יחידות רקומביננטיות ואלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד שאינה דנטוריבית, או PAGE. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום הפרוטאוזום, כגון אילו מינים ביניים נתקלים לאורך נתיב ההרכבה של קומפלקס חלבון זה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת סריקה מהירה של ההרכבה באמצעות שתי גישות מקבילות, המאפשרות זיהוי של תוצרי ביניים שנמצאים על נתיב ההרכבה או מחוץ לו. הליך זה מתחיל בביטוי חיידקי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לביצוע ליזיס של החיידקים, הפשירו על קרח במשך חמש דקות את משקע התאים המושרים המבטאים יחד את השילוב הרצוי של תתי-יחידות הפרוטאוזום. לאחר ההפשרה, השעיקו מחדש את המשקע ב-600 µL של Lysis Buffer. דגרו את התרחיף ב-30

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת צבירת חלבונים מבוססת תאים באמצעות מעכבי פרוטאזום, אשר חוסמים את פעילות הפרוטאזום, ומונעים מחלבונים מוטנטיים שאינם מקופלים כהלכה, מאוחים לתווית פלואורסצנטית, לעבור פירוק פרוטאזומלי תלוי יוביקוויטין, המוביל להצטברותם בתוך הציטופלסמה של התא. לאחר מכן מדמיינים את צברי החלבונים ומכמתים אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

שיטה זו מתאר את שיבוט, הביטוי, ואת טיהור של Nsa1 רקומביננטי לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), והוא רלוונטי לניתוח המבני היברידית של חלבונים אחרים שניהם הורו, מגרה תחומים.

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הכנת קומפלקסים נוקלאוזומליים באמצעות שתי שיטות להכנת דגימה להקפאת רשתות TEM.

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

חקור הרכבת פרוטאזום רקומביננטי באמצעות ביטוי משותף של תת-יחידות וערבוב לאחר פירוק תאים. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מוליכי ביניים בהרכבת המרכב החלבוני.

בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת

גלה סרטונים נוספים