Name: גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: למד כיצד ליישם כרומטוגרפיית גודל ויון-חליפין מקוונות ב-SAXS לשיפור איכות נתונים במחקר ביולוגיה מבנית. שיטות אלו מפחיתות עיכובים בין הכנת דגימות למדידה ומונעות דנטורציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים על התמיכה הכספית בפרויקט מהמענק הצרפתי REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 ועל ידי מענקי מחקר מהשירות לבריאות הצבא וה-Délégation Générale pour l'Armement. אנו אסירי תודה ל-ESRF על זמן האלומה של SAXS. אנו מודים לאנדרו מקארתי, גורדון לאונרד, וים בורמייסטר וגאי שון על התמיכה הכספית והמדעית.

<ol><li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+%28SAXS+and+WAXS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li>
<li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li>
<li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+%28SAXS%29+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li>
<li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biostructural+changes%2C+dynamics%2C+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li>
<li>David, G., Pérez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography%3A+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li>
<li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Pipeline+for+Purification%2C+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22ACA+Trans%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li>
<li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li>
<li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li>
<li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li>
<li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li>
<li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li>
<li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li>
<li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins%3A+structural+insights+and+new+members%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li>
<li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li>
<li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSAXS+Sample+Changer%3A+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li>
<li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB+for+BioSAXS%2C+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li>
<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li>
<li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li>
<li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+Map%2C+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li>
<li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%2C+Version+1.8%22">The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8</a>. , (2015).</li>
<li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li>
<li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

לקבלת מקרומולקולות רבות, צעד טיהור סופי באמצעות כרומטוגרפיה נדרש לפני איסוף נתוני SAXS להשיג ערכת נתונים באיכות טובה. עם זאת, לא כל הדגימות להישאר יציבות; הם עשויים להיות מועדים צבירה או מחדש איזון כדי תערובת של מדינות oligomerization. לכן, צעד טיהור באינטרנט סופי על beamline נדרש לצמצם את הזמן בין הטיהור ואיסוף נתונים על מנת לקבל את נתוני SAXS הטוב ביותר באיכות. בהתאם מאפייני biophysical של החלבון של עניין, SEC-SAXS או IEC-SAXS יכול להיבחר להשיג איכות המדגם אופטימלי. כאן, על מבנה חלבון נגזר helicase / primase D5, שתי הטכניקות מוסברות דנו. רכישת נתוני SEC-SAXS אהיה יותר ויותר סטנדרטית נגישה beamlines BioSAXS רב. ניתוח נתונים, במיוחד רקע חיסור, הוא יחסית פשוט וקל. עם זאת, אות חיץ יציבהוההפרדה מספיק של מיני macromolecular נשארת חיונית. לכן, חשוב להזמין מספיק זמן כדי לאזן את העמודה ביסודיות. אי של שיטה זו יכולה להיות עקב מזהמים מתמשכים בסדר גודל דומה לחלבון של עניין, בריכוזים נמוכים, או מאגר רגיש-קרינה. בפועל, בתחילה, SEC-SAXS עשויה לשמש שיטת הבחירה של רוב הדגימות macromolecular. ובכל זאת, פרוטוקולי טיהור רבים דורשים צעד IEC לפני בשל נוכחותם של מזהמים או צבירה. בהינתן שכל צעד ריכוז כרומטוגרפיה קשור פסדים של מדגם (המוערך בכ 30-50%) וזמן, IEC-SAXS הישיר הוא יתרון. לקבלת דוגמיות כי לא יכול להיות מטוהרת על ידי ה- SEC, יהיה זה בשל נוכחותם של בגודל הדומה &quot;מזהמים&quot; או משום שהם המצרפי קשים בריכוזים הצורכים, IEC-SAXS תמיד יהיה הגישה הטובה יותר מתאימה. כמו כן, הספיקה הגבוהה נתמכתבעיני רבים עמודות IEC יכול לעזור להפחית את זמן המעבר בין טיהור ומדידה. בדוגמא המוצגת כאן, IEC שמש עם elution צעד, המאפשר הפרדה של הפסגות הקרובות של D5 323-785 מפני מזהמים בקפידה על ידי בחירת הצעדים ריכוז מלח. באופן עקרוני, את מספר הצעדים הוא בלתי מוגבל, אבל באופן מעשי, לפחות 1 צעד לכל שיא נדרש, ולא יותר מדי צריך להיבחר. לקבלת שיטת חיסור רקע המתוארת לעיל, חשוב לאמוד את מספר גבוה יחסי של יצירות חיץ שונות כדי למצוא את אחד התואם. חסרון משותף של שני הטכניקות הוא חוסר מידע ריכוז חלבון מדויק. בגלל זה, קביעת המסה המדויקת מבוסס על פיזור קדימה אינה אפשרית. עבור חלבונים כדוריים כגון D5 323-785, היקף Porod מספק אלטרנטיבה, אם כי הערכה מדויקת, המוני פחות, אבל עבור חלבונים גמישים או מופרעים מאודגישה, זה לא תהיה תקפה. וריאציה של שיטת IEC-SAXS שיפוע צעד חכם המוצגת כאן היא השימוש שיפוע ליניארית במקום. למרות זאת, ניתן לעבוד עם כצעדים רבים ככל רצוי לבודדים-פסגות תת באמצעות elution צעד חכם, בגישת השיפוע ליניארית, היא נדרשת כדי לייעל את תנאי השיפוע בקפידה על מנת להפריד בין הפסגות לחלוטין לפני תחילת SAXS לְנַסוֹת. רקע חיסור בגישה זו יכול להיעשות מסגרת-חכם יכול להיות מאומת על ידי ההשוואה של המסגרות הנפרדות, אבל זה דורש טיפול נתונים מתקדם יותר, וכן תוכנה ייעודית אינה קיימת עדיין. הבחירה של טור מתאים הוא קריטי עבור שתי הטכניקות, כפי שהוא קובע את הפרדת המינים macromolecular. גודל הדרת עמודות נבדלות קיבולת טעינה, בטווח הגודל של מקרומולקולות להפרדה, ופתרון, תוך עמודות חילוף יונים להשתנות מן הסוג ואת הצפיפותשל החיובים המשותקים שלהם. בעוד הפרוטוקול המובא כאן הוא ספציפי beamline ESRF BM29, הסתגלות לכל beamline SAXS השני הוא, באופן עקרוני, פשוט. הדרישות העיקריות הן שטף רנטגן גבוה מספיק וגלאי מתאים (רצוי פוטון יחידה-יד נטויה), לרכוש נתוני אות לרעש סבירים בטווח של שניות או פחות, ומערכת כרומטוגרפיה נוזלית מקוונת מסוגל לייצר הדרגתי. היישום המדויק היה, כמובן, תלוי בסביבת beamline המקומית. התוצאות שהתקבלו על D5 323-785 באמצעות שתי שיטות שונות במקצת. הרדיוס של הסתובבות הוא מעט קטן עבור נתוני IEC מאשר נתוני SEC, ואת והמינימום המקומי של עקומת הפיזור מועבר וקטורי פיזור מעט גדולים. משמעות הדבר היא כי D5 323-785 נמדד עם IEC-SAXS הוא מעט יותר קומפקטי מאשר D5 323-785 נמדד עם SEC-SAXS. זה עלול bדואר בשל הבדלי הכנת המדגם, בזמן בין הטיהור ומדידה (IEC הוא מהיר יותר), או, פחות סבירים, כדי מזהם במדגם המטוהר SEC. המודלים החרוזים שהושגו באופן עצמאי לחלוטין עם שני השיטות ניתן להשוואה (איור 1H). D5 323-785 מציג את המבנה החלול, hexameric הצפוי 18. לסיכום, חילופי יונים מקוונים כרומטוגרפיה בגודל הדרה באינטרנט שיטות טיהור ביוכימיים חשובים שיכולים להיות מצמידים ישירות SAXS 6,7,9-12,25,26. חיסור רקע נתוני IEC-SAXS הוא מעט יותר קשה ומעורפלת מאשר SEC-SAXS, אבל זה בכל זאת אפשרי. בהתאם מאפייני biophysical של החלבון של עניין, הן SEC ו- IEC-SAXS לאפשר אופטימיזציה של הפרדת מינים עם יתרונות גלומים. מתן שצעדי האימות (כמתואר) הם נצפו כראוי, את הנתונים המתקבלים שנינות ניתן לנתחאמון h, ומודלים ניתן לקבוע באמצעות הכלים הסטנדרטיים הזמינים בתוך הקהילה. יחד, הן טכניקות לאפשר הפרדה באינטרנט עבור מגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות, מניב נתונים לא נגיש באמצעות מדידות סטטיות רגילות.

BioSAXS הוא כלי רב עוצמה כדי לקבוע את הצורה של אובייקטים בגודל ננו 1-4. הפיזור של קרני X על ידי תמיסה המכילה מולקולות, בגודל בטווח ננומטר, נרשם בזוויות מאוד נמוכה. מגוון זוויתי זה מכיל מידע על פרמטרים גלובליים: רדיוס הסתובבות; מרחק intraparticle הגדול; צורת החלקיקים; והמידה מתקפלים, denaturation, או הפרעה. הטכניקה אינה דורשת גבישים, ואת מקרומולקולה נשאר בתמיסה ובכך יכול להישמר בתנאים מחקו פרמטרים חשובים מסוימים של התא, כגון כוח יוני, pH ועוד ידע של גורמים אלה עשויים לסייע לקבוע, למשל, מדינת oligomeric הרלוונטית מבחינה הפיזיולוגית של חלבון של עניין או כדי לאמת את מודל מוצע של קומפלקס. האפיון של אינטראקציות בין חלבונים בתנאי חיץ שונים, יצירת מודלים של תחומים חסרים, העידון של מודלי הומולוגיה, ואת דהסיום המדינות מקופלות בדידות פרש יכול להתבצע במהירות ובקלות 5. כמו עם כל הטכניקה, יש BioSAXS חולשות פנימי: דגימות מצטברים או מפוגל, תערובות של חלקיקים, דגימות הטרוגניות, נזקי קרינה, ואת חוסר התאמה חיץ עלול לגרום להצגת נתונים בלתי וניתנת לפרשנות. עבור שיטות ניתוח רבות, ההנחה היא במרומז כי המדגם הוא monodisperse, דרישה כי היא לעתים קרובות קשה להשיג בפועל. במקרים רבים, את ההשפלה של המדגם הוא עדין ולא ניתן לאתר את הנתונים בפני עצמה, וכל ניסיון לפרש את הנתונים נותן תוצאות לא מדויקות או אפילו מטעה. כדי להתגבר על המכשולים הללו, השילוב של כרומטוגרפיה בגודל הדרה (SEC) ו SAXS יושם על beamlines רב על מנת להבטיח את איכות נתונים ולעשות את הטכניקה הזו לנגישה יותר עבור דגימות קשות יותר ויותר 6-11. לאחרונה, הוספנו שיטה חדשה לרפרטואר ידי פיתוח-חילוף יונים באינטרנטכרומטוגרפיה (IEC) -coupled 12 SAXS. טכניקות הן פותחות SAXS למגוון רחב של חלקיקים ביולוגיים לשעבר בלתי אפשרי לנתח. הבחירה של איזו שיטה להשתמש תלוי מאפייני biophysical של חלקיקים של עניין. SEC מפריד מקרומולקולות על ידי גודלם, לפיה לפחות הבדל של 10% מסה מולקולרית לכאורה דרוש ההפרדה. מגבלות פיזיות של הטור המאפיינים הפיזיולוגיים של דגימות, כמו משטחים הידרופובי, גמישות, וחוסר יציבות, גם לסבך איסוף נתונים, ניתוח, ופרשנות. יון-חילופי כרומטוגרפיה, המפריד מולקולות מבוססות על התשלום שלהם, ומכאן, הזיקה המחייבת שלהם לעמודת IEC, ניתן להשתמש במקום או בנוסף ל- SEC. המטען הכולל ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי ה- pH, או תשנה את ריכוז המלח של למאגר, מתן שיטה פשוטה יחסית עבור המבוקרת אלution של מולקולות מהעמודה IEC. באמצעות תשלום, הפרדת סוגים דומים וגדלים של מולקולות, אשר שאחרת קשה להפריד, ניתן לבצע באופן שגרתי עם חברת החשמל. בנוסף, IEC יש את היתרון של להיות מסוגל להתמודד עם דגימות מדוללות, המאפשר אחד כדי למנוע את צעדי הריכוז, אשר נושאים את הסיכון הפוטנציאלי של denaturing החלבון. למרבה הצער, כפי המטענים מאוד מדגם תלויים, IEC דורש אופטימיזציה לגבי pH ועל ריכוזי מלח 13,14. עבור חלבונים רבים שקשה לבטא, לטהר, או שניהם, רק בכמויות קטנות של מדגם זמינות ללמוד. חשוב להיות יעיל כדי למזער את מספר צעדי טיהור, ולכן ההפסדים. מסיבה זו, צעד הטיהור האחרון מחובר מוקדם אל רכישת נתוני SAXS, על מנת להגדיל את הסבירות של איסוף ערכת נתונים טובה. כאן, אנו מציגים ולהשוות SEC-SAXS ו- IEC-SAXS באינטרנט. שתי הטכניקות יושמו על beamline BioSAXS BM29 במתקן קרינה Synchrotron האירופי (ESRF) גרנובל, 15 בצרפת. כמקרה מבחן, השתמשנו תחום D5N ו helicase של החלבון וירוס vaccinia D5, שהיה די קשה לנתח בשיטות אחרות מבנית. הווירוס vaccinia הוא חבר של המשפחה Poxviridae והוא 98% זהה לנגיף אֲבַעבּוּעוֹת, הגורם אבעבועות קטנות. השימוש במערכת vaccinia, אנחנו לומדים את מכונות שכפול, התמקדות כאן על D5 helicase-primase חיוני. D5 הוא חלבון 95-kDa עם N-terminal Archeo-איקריוטיים primase (AEP) מושלם 16 ואחריו באזור אשכול ציסטאין (מיל. 240-345) 16. בהמשך לכיוון הסופית- C מגיע מושלם D5N (מיל. 340-460), אשר מזוהה תמיד עם helicases D5-סוג, ולבסוף superfamily 3 (SF3) תחום helicase (מיל. 460-785) 17 (Figurדואר 1A). תחום helicase של D5 בונה מבנה טבעת hexameric מה שדרוש חזק מחייב ל- DNA. בזכות מחקרי SAXS וא&quot;מ האחרונים, את המבנים ברזולוציה הנמוכה של primase ובתחומי helicase כיום ידועים 18. כאן, אנו מראים כיצד להשתמש בטכניקות כרומטוגרפיה באינטרנט מיושם על beamline BioSAXS BM29 בבית ESRF כדי לקבל תובנות לתוך המבנה של שבר בטרמינל C-(שאריות 323-785) של D5.

<table><tbody><tr><td>1,4-דיתיותרייטול [DTT]</td> <td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX ג'ל חלבון טרומי</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית VWR</td><td>כימיקלים (BDH Prolabo)</td> <td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 מסננים צנטריפוגליים Ultracel -30K</td><td>Millipore בע"מ</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין נתרן מלח</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG עמוד התפלה</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>VWR כימיקלים (BDH Prolabo)</td> <td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinity ג'ל</td><td>סיגמא</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td><td>VWR כימיקלים (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק מילר</td><td>פלוקה אנליטי</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR כימיקלים (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp;</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb וקטור&nbsp;</td><td>אדג'ין</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>פריימר</td><td>&nbsp; Eurofins mwg אופרון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין ערכת Miniprep</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ג'ל מיצוי ערכת</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR טיהור ילד</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל DNA בטוח</td><td>טכנולוגיית חיים Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>תוצרת בית</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>טכנולוגיית חיים Invitrogen</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R column&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beamline control software BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>פיתוח מקומי</td></tr><tr><td>תוכנת שרת מצלמה</td><td>Dectris</td><td>n.a.detector</td> <td>בקרת תוכנה</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td></td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html תוכנית ליישור מודלים ראשוניים&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio תוכנית שחזור מודל</td></tr><tr><td>תוכנית HPLC Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC program LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>פיתוח מקומי</td></tr><tr>תוכנית <td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>, המבצעת את המניפולציה באמצעות SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td> <td>תוכנה להדמיה</td></tr><tr><td>תוכנית http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td></td><td>להצבת מבנים תלת מימדיים</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic BioLogic Fraction אספן</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC מערכת</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim BBI8535108</td><td></td><td></td> ביוטק</tr></tbody></table>

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline saxs

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

רנטגן פיזור זווית קטנה ביולוגית (BioSAXS) היא טכניקה רבת עוצמה בביולוגיה מולקולרית מבניים המשמשים לקביעת מבנה פתרון, גודל החלקיקים וצורה, קרקע-נפח יחס של מקרומולקולות. הטכניקה ישימה מגוון מאוד רחב של מצבי פתרון פורשים מגוון רחב של ריכוזים, ערכי ה- pH, עוצמות יוניות, טמפרטורות, תוספות וכו &#39;, אבל המדגם הוא נדרש להיות monodisperse. אזהרה זו הובילה ליישום מערכות כרומטוגרפיה נוזלית על beamlines SAXS. כאן אנו מתארים את השילוב במעלה הזרם של הדרת גודל (SEC) ואת היון-חילופי כרומטוגרפיה (IEC) על beamline, שיטות שונות עבור חיסור רקע אופטימלי, והפחתת נתונים. כדוגמא, אנו מתארים כיצד אנו משתמשים SEC- ו- IEC-SAXS על שבר של D5 vaccinia וירוס החלבון החיוני, מורכב תחום helicase D5N. אנו קובעים צורה הכללית שלה ועל משקל מולקולרי, המתאר את מבנה hexameric של החלבון ה.

התוצאות של ניתוח משתנה ללא מודל מפורטים בטבלה 1. האנליזה של נתוני D5 323-785 SEC-SAXS הראתה הערכת מסה מולקולרית (מניתוח Porod) של 345 kDa לעומת 338 kDa, ציין באמצעות IEC-SAXS. שניהם תמימי דעים עם המוני צפוי של 6 פעמים 53.5 kDa (321 KDA) עבור hexamer. הדוגמנות מדעיקרא של שתי קבוצות הנתונים בוצע ללא סימטריה שהוטלו (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) ושימוש סימטריה C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). כמו ההתקפים הכוללים את נתוני פיזור עבור השחזורים הם דומים בשני המקרים (האיור 1D ו- E), סימטרית C6 ניתן להניח. לפיכך, המודל המתאים למבנה חרוט דמוי משושה עם ערוץ מרכזי, המופיע חסום חלקית (SEC: איור 1F; IEC: <str>איור 1H). בחינת דגמים בודדים לפני המיצוע מראה כי חסימה זו עשויה להיות פועל יוצא של תהליך המיצוע. </str><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> איור 1: ניתוח נתוני SAXS והשוואה של D5 323 -785 (איור מותאם הפניות 12 ו -18). א) מבנה תחום סכמטי של חלבון D5 ו D5 323-785. B) מנותק יון-חילופי הכרומתוגרמה עם ציון של שלוש פסגות. עקומת אורנג ': ספיגה ב 280 ננומטר (au), עקומה כחולה: אחוז החיץ ב האחוזים של חיץ B על הפסגות מסומנות. C) chromatogram באינטרנט יון-חליפין. מפתח צבעים כמו ב בנוסף, עוצמת הנמדד הוא מסומנת בירוק. א העקומה הפיזור הניסיוןnd מחושב שהקו של המודל מתקבל על ידי ה- SEC-SAXS D) וחברת החשמל E) ניתוח נתונים של D5 323-785. F) מודל חרוז של D5 323-785 מבוסס על נתוני SEC ו- G) נתוני IEC. H) כיסוי של דגמי SEC וחברת החשמל. הפנלים ב F) ל H) נוצרו באמצעות תוכנה להדמיה מולקולרית 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פרמטרי נתונים אוספים </td><td></td></tr><tr><td> כלי: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> אורך גל (א) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-טווח (א -1) </td><td> 0,0032 - 0.49 </td></tr><tr><td> לדוגמא אל גלאי מרחק </td><td> 2.864 מ ' </td></tr><tr><td> זמן חשיפה (sec) </td><td> 1 לכל מסגרת </td></tr><tr><td> טווח הריכוז </td><td> נה </td></tr><tr><td> טמפרטורה (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> גַלַאִי </td><td> פילאטוס 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (פוטונים / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Beam גודל (מיקרומטר 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> פרמטרים מבניים עבור D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (-1 ס"מ) [מן Guinier] </td><td> .0237 </td></tr><tr><td> Rg (א) [מן Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q דקות g R - q מקסימום R g המשמש Guinier </td><td> 0.77 - 1.24 </td></tr><tr><td> D מקס (א) [מ- p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-טווח המשמש p (r) (א -1)</td><td> 0.02 - 0.17 </td></tr><tr><td> Porod נפח V p (א 3) [מן פיזור] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> R מסה M מולקולרית (KDA) [מ V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> מחושב monomeric מר מתוך רצף (KDA) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> פרמטרים מבניים עבור D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (-1 ס"מ) [מן Guinier] </td><td> .386 </td></tr><tr><td> Rg (א) [מן Guinier] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> q דקות g R - q מקסימום R g המשמש Guinier </td><td> 0.44 - 1.29 </td></tr><tr><td> D מקס (א) [מ- p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-טווח המשמש p (r) (א -1) </td><td> 0.03 - 0.18 </td></tr><tr><td> נפח V p Porod (&amp; #197; 3) [מן הפיזור] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> R מסה M מולקולרית (KDA) [מ V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> מחושב hexameric מר מתוך רצף (KDA) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: פרמטרי נתוני SAXS. הטבלה מסכמת את הפרמטרים של רכישת נתונים SAXS וניתוח.

קביעת מבנה פתרון של חלבון על ידי פיזור קטן זווית קרני רנטגן (SAXS) דורש דגימות monodisperse. כאן, אנו מציגים שתי אפשרויות על מנת להבטיח עיכובים מינימאליים בין הכנת מדגם ורכישת נתונים: כרומטוגרפיה בגודל הדרה מקוון (SEC) כרומטוגרפיה היון-Exchange Online (IEC).

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

המטרה הכוללת של יישום כרומטוגרפיה מקוונת של אי הכללת גודל וחילופי יונים על קווי אלומת פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה היא להשיג נתוני מודל ברזולוציה נמוכה באיכות טובה יותר על ידי הבטחת עיכובים מינימליים בין הכנת הדגימה לרכישת הנתונים. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית. כמו פעולת הרדיוס, המרחק התוך-מסוים הגדול ביותר, צורת החלקיק, מידת הקיפול או אי הסדר.SAXS דורש דגימות מפוזרות טוחנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהזמן בין הטיהור למדידה קצר, מה שמסייע במניעת דנטורציה או אדוויקציה של דגימה. לפני היציאה למתקן קו האלומה, הכינו דגימה מרוכזת בשיטות שפורסמו בעבר ובצעו ריצות בדיקה של SEC.במתקן קו האלומה, הנח מיליליטר אחד של מאגר סינון ג'ל בצינור תגובה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, חבר את בקבוק מאגר סינון הג'ל למערכת HPLC בהתאם לנימים הזורמים של מערך SAXS. הגדר את קצב הזרימה, לחץ העמודה המרבי וזמן הרכישה.שימו לב ללחץ האחורי ללא העמוד. נקה את הקווים ולאחר מכן חבר ואזן את עמודת הכרומוטוגרפיה של אי הכללת הגודל. טען את דגימת המאגר של מיליליטר אחד לתוך מחליף הדגימה.צא ואבטח או נעל את הצריף הניסיוני, ולאחר מכן היכנס לתוכנת בקרת קו האלומה במצב מחליף דגימה. שלח את דגימת המאגר במחליף הדגימה ישירות דרך נימי הזרימה של SAXS. בצע בדיקת SAXS קצרה ובדוק שעוצמת פיזור קרני הרנטגן של הקול אינה מראה סימנים לנזק לקרינה.העבר את מערכת בקרת קו האלומה למצב HPLC ובצע בדיקת SAXS של מאגר באמצעות מערכת HPLC SAXS המלאה. אם הנתונים אינם תואמים למדידה הראשונה, יש לאזן מחדש ולבצע ריצת בדיקה נוספת. לאחר מכן, במעבדה, צנטריפוגה את דגימת החלבון ב-13,000 פעמים G למשך 10 דקות כדי להסיר אגרגטים.העבירו את ה-supernatant לבקבוקון זכוכית תואם HPLC. טען את הבקבוקון לתוך הדגימה האוטומטית, תוך ציון מיקום הדגימה. נעל את הצריף וצור תיקיה לנתוני הניסוי במערכת בקרת קו האלומה.לאחר מכן, בתוכנת HPLC, לחץ על אצווה מהירה. הגדר את נתיב הקובץ והפעל המרת ascii אוטומטית של נתוני UV Vis. הזן את נפח ההזרקה ואת מיקום הדגימה בדגימה האוטומטית.לחץ על start' כדי להוסיף את ההפעלה לתור. הזן את שם הקובץ, אך אל תלחץ על שמור'עדיין. בתוכנת בקרת קו האלומה, הגדר את מספר מסגרות הנתונים כך שזמן איסוף הנתונים של SAXS יהיה מעט ארוך יותר מזמן רכישת ה-HPLC.פתח את תריס קו האלומה והתחל באיסוף נתוני SAXS. עבור לתוכנת HPLC ולחץ על שמור כדי להזריק את הדגימה. שימו לב למספר המסגרת בתחילת רכישת נתוני UV Vis, ועקוב אחר העוצמה המסוכמת לאורך זמן.במהלך הכנת הדגימה, בצע ריצת בדיקה של חברת החשמל עם שיפוע נתרן כלורי ליניארי מ-25 מילי-מולר לטוחנת אחת. עבור כל שיא עניין, קבע את הכמות המתאימה של מאגר מלח גבוה B בשלב הנייד. כדי להתחיל בניסוי IEC SAXS, הניחו בצד דגימות מיליליטר אחת של מאגרים A ו-B, ולאחר מכן חברו את המאגרים למערכת HPLC.הגדר את פרמטרי ה-HPLC ולאחר מכן נקה את המערכת ושטוף את הקווים עם מאגר מלח נמוך A.חבר ואזן את עמודת חילופי היונים עם מאגר A.טען את דגימות המיליליטר של מאגרים A ו-B לתוך מחליף הדגימה. נעל את הצריף ובצע ריצת בדיקת SAXS קצרה עבור כל דגימת מאגר במצב מחליף דגימה כדי לבדוק את רגישות המאגר לנזקי קרינה. לאחר מכן, עבור למצב HPLC ובצע ריצת בדיקת SAXS נוספת עבור מאגר A.השווה את דפוסי הפיזור לאלה שהתקבלו מהפעלת הבדיקה של מחליף הדגימה.לאחר מכן, צור תיקיה עבור נתוני הניסוי. לאחר מכן, תכנן שיפוע HPLC צעד שמתחיל באפס אחוז מלח גבוה B, ועולה בחמישה אחוזים במרווחים של שני נפחי עמודות כדי להגיע למאגר 100 אחוז B. הגדר ריצת שיפוע בודדת שבה לא מוזרקת דגימה. פתח את תריס קו האלומה, התחל באיסוף נתוני SAXS והתחל את ריצת ה-HPLC.שים לב למספר הפריימים שחלפו כאשר איסוף נתוני UV Vis מתחיל. לאחר איסוף הנתונים, בדוק שהעוצמה המסוכמת נשארה קבועה למשך 100 פריימים לפחות, ותואמת את הערכים המתקבלים מדגימות המאגרים A ו-B.לאחר מכן, בצע שיטת HPLC שיפוע נוספת מבחינת צעד, החל ממאגר אפס אחוז B.צור שלב עבור כל ערך אחוז B שנקבע בבדיקת השיפוע של IEC במצב לא מקוון. הוסיפו צעדי מעבר צבע בנקודת אחוז אחת מתחת לכל אחד מהערכים הללו, ו-1.5 נקודות מעל כל אחד מהערכים הללו.הגדר כל מרווח שלב ל-2.5 נפחי עמודות, ואת השלב האחרון בשיפוע ל-100 אחוז B.לדלל את הסופרנטנט לפי הצורך כדי להשיג את הרכב המאגר A.עצור את משאבות ה-HPLC, נתק את צינורות העמודה מהגלאים והנח את קצה הקו למיכל כדי לאסוף את זרימת העמודה. לאחר מכן, העבירו את קו המאגר A לתוך הדגימה המדוללת, וודאו שלא נלכדו בועות אוויר בצינור. הפעל את המשאבות כדי למשוך את הדגימה לעמודה.ברגע שמיכל הדגימה כמעט ריק, עצרו את המשאבות והחזירו את בקבוק המאגר A לקו. הפעל את המשאבות והפעל את מאגר A דרך העמודה עבור שני נפחי עמודות, ולאחר מכן עצור את המשאבות וחבר מחדש את העמודה לגלאים. באמצעות השיטה החדשה מבחינת צעדים, הגדר הפעלת HPLC אחת ללא הזרקת דגימה אוטומטית.פתח את תריס קו האלומה וקבל את נתוני ה-SAXS וה-UV Vis. עקוב אחר העוצמה המסוכמת לאורך זמן. לאחר מכן, השתמש בתוכנת עיבוד לאחר כדי להמיר את נתוני HPLC לפורמט ascii.באמצעות מנהל נתונים מקוון, זהה את מסגרות ה-SAXS המתאימות לשיא הפליטה של הדגימה. ודא שרדיוס הג'ירציה יציב לאורך כל השיא. ייבא את מסגרות השיא לתוכנית עיבוד נתונים SAXS, וצור עקומת פיזור ממוצעת שאינה מתוקנת.עבור SCC SAXS, אשר שאזור ה-Q הגבוה של המאגר הממוצע, לא רק עקומת הפיזור הלא מתוקנת. טען ושנה את קנה המידה של המסגרות המופחתות אוטומטית מהשיא, ובדוק שאין הבדלים שיטתיים. ממוצע של כל העקומות כדי לקבל את עקומת ה-SAXS הסופית.עבור IEC SAXS, ממוצע של 50 פריימים מכל שלב שיפוע. השווה ממוצעים אלה לעקומה הלא מתוקנת, ובחר את צעד השיפוע עם התאמת Q הגבוהה הטובה ביותר. הפחיתו את הממוצע שנבחר מהעקומה הלא מתוקנת כדי ליצור את עקומת SAXS הסופית.לבסוף, קבע את התפלגות מרחק הזוגות ובצע מודלים ראשוניים כדי לקבוע את המודל המייצג ביותר של החלבון. פרמטרי הנתונים המבניים שהתקבלו מ-SEC ו-IEC SAXS של חלבון D5 היו דומים מאוד. הערכות המסה המולקולרית היו תואמות את המסה החזויה.מידול Ab initio בוצע ללא סימטריה כפויה, ועם סימטריה C6. שני המודלים תואמים לנתוני הניסוי, מה שמצביע על כך שלמבנה החלבון יש סימטריה C6. מודלים מולקולאריים מניבים מבנה דמוי פירמידה הקסוגונלית עם תעלה מרכזית חסומה חלקית.המודלים הממוצעים של SEC ו-IEC היו דומים מאוד. לאחר בחינת מודלים בודדים, נמצא כי חסימות הערוץ הן ככל הנראה תוצר של תהליך הממוצע. SAXS הופך לסטנדרטי סביר יותר, אך עבור טיהור וחילופי יונים רבים יש צורך בצעדים כדי להיפטר מאגרגטים או מזהמים.בפרוטוקול זה הצגנו את שתי הטכניקות, כרומוטוגרפיה מקוונת של אי הכללת גודל וכרומוטוגרפיה מקוונת של חילופי יונים על קו אלומה ביולוגי SAXS. אזהרה של שתי הטכניקות היא שריכוז החלבון המדויק אינו ידוע, ולכן איננו יכולים לקבוע את פיזור המסה המולקולרית. עם זאת, עבור חלבונים כדוריים, אנו עדיין יכולים להעריך את נפח המסה.ניתן להחיל שיפוע ליניארי במקום שיפוע חכם צעד בו השתמשנו כאן בכרומוטוגרפיה של חילופי יונים, אם כי זה דורש אופטימיזציה של תנאי החיץ להפרדה אופטימלית של הפסגות. טכניקות אלה מאפשרות לנו לאסוף נתוני SAXS באיכות טובה, אפילו במערכות מורכבות.

online-size-exclusion-ion-exchange-chromatography-on-saxs

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של חילופי קטיונים לבידוד חלבון רקומביננטי מחלבון תא החרק ליזט.

כרומטוגרפיית חילופי קטיונים: טכניקה לבידוד חלבון רקומביננטי מטרה מליזט תאי חרקים בהתבסס על מטען פני שטח נטו

סרטון וידאו זה מתאר את SEC-MALS, הממנף את היכולות של כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) ופיזור אור רב-זוויתי (MALS). ב-SEC-MALS, ה-SEC מפריד חלבונים או קומפלקסים חלבוניים בהתבסס על גודלם, וגלאי MALS קובע את המשקל המולקולרי הממוצע על ידי מדידת עוצמת האור המפוזר על ידי המולקולה בזוויות שונות.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם פיזור אור רב-זוויתי עבור אוליגומרים חלבונים

שיטה לניתוח spectrometric המוני של פפטידים אנדוגני האנושי נוזל מוחי שדרתי (CSF) מוצג. על ידי העסקת משקל מולקולרי ניתוק סינון, fractionation קדם כרומטוגרפי, המוני spectrometric ניתוח ושילוב עוקבות של פפטיד זיהוי אסטרטגיות, ניתן היה להרחיב את peptidome CSF ידוע כמעט כוחנו לעומת על מחקרים קודמים.

הכנת הדוגמא לניתוח Endopeptidomic ב אנושי נוזל מוחי שדרתי

כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

פרוטוקול זה מתאר השימוש כרומטוגרפיה גבוהה-ירידה לפרטים-יונים עם פיזור אור רב זווית נחישות המוני טוחנת מדויק של חלבונים, חלבונים מתחמי פפטידים במדגם הטרוגנית. שיטה זו היא ערך להערכת איכות, כמו גם באשר אפיון oligomers מקורית, מטען גרסאות ודוגמאות מעורב-חלבון.

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

הפרוטוקול BN-MS רב-תכליתי באמצעות מיקרוטומה מוצג ברזולוציה גבוהה complexome פרופיל.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

מדידות SEC-BioSAXS של מקרומולקולות ביולוגיות הן גישה סטנדרטית לקביעת מבנה הפתרון של מקרומולקולות והמתסבינים שלהן. כאן, אנו מנתחים נתוני SEC-BioSAXS משני סוגים של עקבות SEC בדרך כלל - כרומטוגרמות עם פסגות שנפתרו במלואן ונפתרו חלקית. אנו מדגימים את הניתוח ואת ההתפוררות באמצעות פיזור ו- BioXTAS RAW.

ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת מדגם קריוגני והעברת גבישים לתוך תחנת הקצה ואקום על קו קרן I23 במקור אור יהלום, לניסויים קריסטלוגרפיה באורך גל ארוך רנטגן מקרומולקולרי.

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

למד כיצד ליישם כרומטוגרפיית גודל ויון-חליפין מקוונות ב-SAXS לשיפור איכות נתונים במחקר ביולוגיה מבנית. שיטות אלו מפחיתות עיכובים בין הכנת דגימות למדידה ומונעות דנטורציה.

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

גלה סרטונים נוספים