Immunostaining סעיפים Biocytin מלא ומעובד מרקרים הנוירוכימיים
31 בדצמבר 2016
פרוטוקול זה מציג שיטה ההתאוששות מורפולוגי של נוירונים תוקנו במהלך הקלטות אלקטרו באמצעות מילוי biocytin ו postprocessing immunohistochemical שלאחר מכן. אנו מראים כי חלקים עבים המלאה biocytin כי היו מוכתמות coverslipped ניתן restained עם ימים או חודשי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן.
מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה יעילה לזיהוי נוירונים שהוטלאו במהלך רישומים אלקטרופיזיולוגיים באמצעות ביוציטין ואימונוסטינינג לשחזור מורפולוגיה לפני צביעה מחדש עם נוגדנים ספציפיים לקביעת זהות נוירוכימית. לכן שיטה זו מתארת צעד חשוב הדרוש לחקר הגיוון במבנה ובתפקוד של תאי עצב. זה חיוני כדי להבין את תפקידם ברשתות המוח.
היתרון העיקרי בשימוש בטכניקות עיבוד רציף, הוא בכך שהוא מבטל את אובדן הנתונים בגלל חוסר יכולת לשחזר מורפולוגיה. אז זה עוזר גם להנחות את הסמנים הנוירוכימיים שייבדקו בתאים האלה. למרות ששיטה זו מתוארת להתאוששות מורפולוגית של תאים בחתכים עבים, ניתן ליישם אותה גם על קטעים דקים ועל דגימות שהוכתמו והורכבו בעבר.
בדרך כלל נייטרלים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות לאטום מחדש את הסומה תוך כדי ניתוק מהתא, ועלולים לא לאפשר זמן מספיק למילוי מוצלח. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שנדרשות טכניקות ספציפיות למילוי ביוציטין יעיל של תאים על מנת לשחזר את המורפולוגיה המלאה. כדי להתחיל בהליך זה, בתצורת מהדק מתח החל צעדי מתח קצרים קטנים באמצעות פונקציית בדיקת הממברנה במצב אמבטיה תוך כדי התקרבות לתא.
יש להדביק על התא על ידי הפעלת יניקה. לאחר מכן, החזק את התא ב-70 מילי-וולט שלילי. שימו לב לפיתוח של חותם ג'יגה-אום.
פצה על ארעיות קיבוליות ולאחר מכן הפעל יניקה מבוקרת עם מזרק או דרך הפה כדי להשיג תצורת תא שלם. הערך את קיבול התא כולו והתנגדות הסדרה, ועצור את פעימות בדיקת הממברנה. התנגדות סדרתית של פחות מ -10 מגה אוהם היא אופטימלית.
זה יבטיח הקמת תנאי רישום תאים שלמים כדי לאפשר מילוי ביוציטין. עם השלמת ההקלטות הפיזיולוגיות, קבע מחדש את תצורת מהדק התיקון על ידי הזזה איטית של פיפטת ההקלטה בצעדים קטנים, לסירוגין כלפי מעלה והחוצה במצב מהדק מתח. השלב הקריטי ביותר בהשגת התאוששות מורפולוגית של תאים, הוא להבטיח איטום מחדש של הסומה העצבית תוך ניתוק פיפטת ההקלטה מהתא.
באמצעות פונקציית בדיקת הממברנה, דמיין את אובדן הארעיות הקיבוליות ואת קריסת תגובות הזרם לקו ישר, מה שמעיד על איטום מחדש של התא והקמת טלאי חיצוני בקצה הפיפטה. בינתיים, החזקת התא בפוטנציאל דה-פולריזציה תקל על תהליך האיטום מחדש. לאחר ניתוק הפיפטה מהתא, שמור את הפרוסה בתא ההקלטה למשך שלוש עד חמש דקות כדי להבטיח שהצבע יועבר לתהליכים הדנדריטיים והאקסונליים הדיסטליים.
לאחר מכן, העבירו את הפרוסה לצלחת של 24 בארות המכילה 4% PFA לקיבוע. 24 עד 48 שעות לאחר קיבוע PFA, העבירו את כל הפרוסות הקבועות לנקודת אפס PBS טוחנת אחת לאחסון לפני צביעה חיסונית. בהליך זה, שטפו את הרקמות שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת בנקודת אפס PBS טוחנת אחת.
לאחר מכן, חסמו את הרקמות עם סרום חוסם של 10 אחוז למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את החלקים בנוגדנים ראשוניים CB1R בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי לזהות ביטוי קולטן קנבינואידים מסוג 1. לאחר מכן, שטפו את חלקי המוח שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב-0.1 PBS מולארי.
סטרפטווידין ונוגדנים משניים לנוגדנים ראשוניים ראשוניים מתווספים שניהם לצלחת הבאר ונשמרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו את החלקים בצבע אדום סטרפטווידין מצומדים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה בחושך כדי לחשוף את הביוציטין. לאחר מכן, שטפו את חלקי המוח שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב-0.1 PBS מולארי.
כדי להגן על הפריחה ולהקל על צביעה מחדש בעתיד, הרכיב את החלקים במדיום הרכבה מרווח באותה מידה. אטום את שולי החלקות הכיסוי עם לק שקוף. בשלב זה, הסירו את הלק ממגלשת הזכוכית בעזרת צמר גפן של אצטון.
הסר את החלקת הכיסוי בזהירות באמצעות מלקחיים עדינים והניח כמה טיפות של 0.1 PBS מולארי על החלקים. זה קריטי לא לפגוע ברקמת התהליך בזמן פירוק הרקמה ממדיום ההרכבה הימי. הסר בזהירות את החלקים מהמגלשה בעזרת מברשת צבע עדינה ושטוף אותם ב-0.1 טוחנת PBS למשך 24 עד 48 שעות על שייקר, והרחק מאור בארבע מעלות צלזיוס.
כדי להבטיח הסרה מוחלטת של אמצעי ההרכבה, שטפו את החלקים פעם עד פעמיים למחרת ב-0.1 PBS מולארי למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו על החלקים עם נוגדן ראשוני שני כולציסטוקינין למשך יום אחד. שטפו את חלקי המוח שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב-0.1 PBS מולארי.
לאחר מכן, צבעו את החלקים עם נוגדן משני מצומד פלואורופור נגד עכברים. לוודא שספקטרום פליטת העירור של הנוגדן המשני אינו חופף לסטרפטווידין ולכתמים אימונופלואורסצנטיים קודמים. לאחר מכן, הרכיב את החלקים במדיום הרכבה מימי.
אטמו את שולי החלקת הכיסוי עם לק שקוף. לאחר מילוי מוצלח של ביוציטין ותהליך הצביעה החיסונית הראשון, ניתן לדמיין ולדמיין את המבנה העצבי כפי שמוצג בתמונה הקונפוקלית המתקבלת בהגדלה של פי 60. הקטע היה גם צבוע חיסוני עבור CB1R יחד עם ביוציטין, והצביעה החיסונית CB1R בביוציטין המבטא סומה עצבית מסומנת על ידי ראש החץ.
אותו קטע עובד עבור תגובתיות חיסונית של CCK לאחר שבוע אחד, והתמונה מציגה התאוששות מוצלחת של תיוג חיסוני CCK במספר נוירונים המסומנים על ידי הכוכבית. שימו לב שהתא המסומן בביוציטין המסומן על ידי ראש החץ לא ביטא CCK. תמונה ממוזגת של לוחות A, B ו-C מראה שכל שלושת התוויות מוצגות בצורה חזקה, ושכבת העל בין ביוציטין ל-CB1R ניכרת.
התמונה מראה שתהליך הצביעה החיסונית השני אינו פוגע באות מתהליך הצביעה הקודם. מורפולוגיה של התא המלא בביוציטין התקבלה מהתמונות הקונפוקליות לפני צביעה חיסונית זו של CCK. באופן מכריע, בנוסף לסומה ולדנדריט, ניתן לדמיין אקסונים, ונצפה תיוג משותף של תהליכים אקסונליים המסומנים ב-CB1R ובביוציטין.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להתמקד בתאים בריאים הממוקמים מתחת לפני השטח של הפרוסה כדי להימנע מתאי עצב עם תהליכים קטועים. וזה עלול לסכן את התאוששות המורפולוגיה. לאחר השליטה, ניתן להשיג התאוששות מורפולוגית של תאים מלאים בביוציטין באופן אמין במהלך הקלטת מהדק התיקון.
יישום מוצלח של טכניקת צביעה חיסונית סדרתית ישפר את יעילות שחזור הנתונים ויקל על אפיון עצבי במהלך הקלטות מהדק תיקון סטנדרטיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ביעילות בתאים מלאים בביוציטין כדי לשחזר מורפולוגיה עצבית ולקבוע סמנים נוירוכימיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לשחזור המורפולוגיה של נוירונים שנוקבו במהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מילוי בביוציטין וצביעה אימונוהיסטוכימית. טכניקה זו מאפשרת זיהוי של סמנים נוירוכימיים בנוירונים, ובכך משפרת את ההבנה של המגוון המבני והתפקודי שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- הבנת המורפולוגיה הנוירונלית היא חיונית לחקר רשתות מוחיות.
- אובדן נתונים במהלך השחזור המורפולוגי עלול לעכב את המחקר.
- שיטה זו נותנת מענה לאתגר של שחזור מורפולוגיה של נוירונים.
- ניתן ליישם את השיטה הן על חתכים עבים והן על חתכים דקים של דגימות נוירונליות.
מטרת המחקר
- להציג שיטה מהימנה לשחזור מורפולוגי של נוירונים.
- להקל על זיהוי זהויות נוירוכימיות בנוירונים שעברו patched.
- למזער את אובדן הנתונים במחקרי אלקטרופיזיולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מילוי של נוירונים שעברו פאטץ' (patch) בביוציטין.
- טכניקות של צביעה אימונוהיסטוכימית לשחזור מורפולוגי.
- עיבוד רציף המאפשר צביעה חוזרת עם נוגדנים ספציפיים.
- יישום הן על חתכים עבים והן על חתכים דקים של דגימות שנצבעו בעבר.
תוצאות עיקריות
- השגה מוצלחת של שחזור מורפולוגי של נוירונים באמצעות biocytin.
- יכולת לצבוע מחדש חתכים עבים ימים או חודשים לאחר מכן.
- זיהוי משופר של סממנים נוירוכימיים בנוירונים.
- הפחתת אובדן נתונים במחקרי נוירונים.
מסקנות
- שיטה זו יעילה לחקר המבנה והתפקוד הנוירונליים.
- היא מספקת כלי בעל ערך לחוקרים בתחום מדעי העצבים.
- היא מסייעת להבנה טובה יותר של השונות הנוירונלית ברשתות מוחיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בגילוי תרופות למדעי העצבים, קישור בין פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים לזהויות מולקולריות הוא קריטי לתיקוף מטרות (target validation) ולהפחתת סיכונים מכניסטיים. פרוטוקול זה מאפשר שחזור של המורפולוגיה העצבית לפני ביצוע פרופיל נוירוכימי, ובכך הוא מפחית אובדן נתונים ומכוון בחירה יעילה של סמנים בתהליכי עבודה של patch-clamp. הוא תומך בביטחון חיזוי במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) על ידי הבטחה שנתונים מבניים וכימיים רשומים במקביל מאותו תא שהוקלט.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קורלציה בין דפוסי פעילות חשמלית לבין התאוששות מורפולוגית לפני ביצוע סריקה נוירוכימית.
- ערך תפעולי: מונע אובדן של נתונים אלקטרופיזיולוגיים בעלי ערך עקב התאוששות מורפולוגית כושלת בחתכי רקמה עבים.
- ערך ניבוי: תומך במיון מטרות על ידי מתן אפשרות לחוקרים לתעדף סמנים נוירוכימיים על בסיס מורפולוגיה תאית מאושרת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מבנים עצביים שעברו תיקוף לבדיקות אימונו-צביעה בהמשך, להבטחת מוכנות הבדיקה לצורך פנוטיפיקה נוירוכימית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי השחזור, המשפרת את השחזוריות בפרוסות עבות ודקות עבור קמפיינים של סריקה במדרג רחב.
- מוכנות הבדיקה: מאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות על ידי שימור שלמות הרקמה לצורך צביעה סדרתית בנוגדנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על הקישור בין התפקוד האלקטרופיזיולוגי לבין הזהות הנוירוכימית, החל משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מפחיתה עמימות באפיון המטרה על ידי אישור קו-לוקליזציה של מורפולוגיה מלאה בביוסיטין עם ביטוי של רצפטור ספציפי.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת בסיס להחלטות go/no-go באמצעות מתן תיקוף מבני וכימי מאותה דגימה נוירונלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מהקלטה אלקטרופיזיולוגית ועד לזיהוי מובילי פגיעה (lead identification), ובכך היא תומכת בבדיקת השערות ובצמצום סיכונים ביולוגיים לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי כך שמאפשר שחזור של מורפולוגיית דנדריטים ואקסונים כדי להבהיר את מיקוד המעגלים הנוירונליים.
- סריקה: מבטיח את מוכנות הבדיקה באמצעות שלבי קיבוע, חסימה וצביעה סטנדרטיים המשמרים את הרקמה לצביעה חוזרת.
- אנליטיקה: מייצר תוצאות כמותיות של קולוקליזציה (למשל, biocytin עם CB1R או CCK) המסייעות לצומי מחקר להשוות פנוטיפים נוירוכימיים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שחזור מורפולוגי לרציפות פרה-קלינית על ידי שימור תהליכים אקסונליים ודנדריטיים לצורך התאמה למסמני ביולוגיים (biomarkers).
- שימוש חוזר בארגון: מבסס יכולת ניתנת לשימוש חוזר לצביעה אימונוהיסטוכימית סריאלית, המאפשרת יישום של מספר גששים של נוגדנים על אותה מורפולוגיה משוחזרת לאורך זמן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכנית בסיווג נוירונלי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה ואת השחזור של השחזור המורפולוגי על פני עוביים משתנים של חתכים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מזעור חזרות של הרצות אלקטרופיזיולוגיות עקב אובדן נתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות נוירוכימיות מותאם סיכון, המבוסס על מועמדים שעברו תיקוף מורפולוגי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה ובטכניקה מיקרו-כירורגית כדי לאטום מחדש את הסומה במהלך נסיגת הפ pipette.
- תלוי בתשתית פבסיה וקיבוע אמינה (למשל, 4% PFA, שטיפות PBS) לשמירה על האנטיגנים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של חסימה ואינקובציית נוגדנים כדי למזער את הרקע בצביעות עוקבות.
- כולל טיפול זהיר במהלך הסרת כיסוי הזכוכית ושחזור הנגדים כדי לשמר תהליכים דנדריטיים ואקסונליים.
- מוגבל על ידי הצורך בזמן הובלה מספיק של הצבע לאחר הניתוק כדי להבטיח סימון מורפולוגי מלא.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Biocytin-filling during Electrophysiology
3:31
Staining of the First Primary Antibody and Biocytin
4:58
Staining of the Second Primary Antibody
6:32
Results: Successful CCK Staining 1 Week Following the Recovery of Biocytin Staining and CB1R Labeling
7:56
Conclusion
