ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian ⁺ T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא למנות ולאפיין אוכלוסיות תאי T חיוביים CD8 ספציפיים לנגיף הכשל החיסוני של סימיאן שנוצרו על ידי חיסון או זיהום ראשוני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה של תאי T, כגון מהי התדירות של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן המושרים על ידי חיסון או זיהום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לכמת תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בדגימות ביולוגיות המתקבלות ישירות מחוץ לגוף ללא צורך בגירוי מחדש במבחנה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הערכת תאי CD8 T ספציפיים לחתך בקוף מקוק רזוס, ולחקר תגובות תאי T CDB במצבי מחלה מרובים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הידע החלקי הזמין לגנטיקה של MHC מקוק רזוס, ומכיוון שצביעת הזרימה הציטומטרית דורשת יישום נוגדנים מדויק. התחל בהשעיה מחדש של רזוס PBMC במדיום R10.

הוסף 1.6 כפול 10 לתאים השביעיים לריכוז מיליליטר. יש להקצות 50 מיקרוליטר של תאים למספר המתאים של צינורות ציטומטריית זרימה, ולהוסיף 50 מיקרוליטר של מעכב חלבון קינאז לכל צינור. מערבל כל צינור ודוגר על הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

יש לדלל את הכמות הנכונה של טטרמר MHC פפטיד טיטר בתערובת מאסטר מספקת כדי להכתים את כל צינורות הניסוי. לכן, חשוב להכין עודף של 15% מתערובת המאסטר, כדי לקחת בחשבון שגיאות פיפטינג. בזמן הדגירה, גלולה את אגרגטי החלבון בתמיסת הטטרמר על ידי צנטריפוגה, כדי למזער את צביעת הרקע.

לאחר מכן, יש לדלל את הטטרמרים במאגר כתמים מספיק, כך שניתן יהיה להוסיף 25 מיקרוליטר מתערובת מאסטר הטטרמר לכל צינור ציטומטריית זרימה. לאחר מכן מערבל את צינורות הדגימה ודוגר על תמיסות הטטרמר PBMC בחושך, בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. בתום הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת מאסטר מכתים לצינורות הדגימה המתאימים.

ומערבבים את הצינורות למערבולת. לאחר 25 דקות בחושך בטמפרטורת החדר, שטפו את התאים עם מאגר כביסה, גלולו את התאים על ידי צנטריפוגה, ושפכו בזהירות את הסופרנטנטים מבלי להפריע לכדורים. מערבל את התאים במאגר השאריות בכל צינור, וקבע את הדגימות עם 250 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד לכל צינור.

מערבולת מיד ודגירת הצינורות בחושך, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות יש לשטוף את התאים במאגר כביסה טרי. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, ושפכה את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.

השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר חדירה, מערבולת ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך. ואז לשטוף ולגלול את התאים. לאחר מכן שפכו את הסופרנטנטים כפי שתואר קודם לכן.

המשך להוסיף 50 מיקרוליטר של תערובת מאסטר כתמים תוך תאית לצינורות המתאימים. מערבלים כל דגימה, ודוגרים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. לאחר סיום הדגירה יש לשטוף ולגלול את התאים.

הדגימות מוכנות כעת לרכישה בציטומטר זרימה. טטרמרים של Mamu-B017.01 מניבים בדרך כלל צביעה עמומה, אותה ניתן לשפר באופן משמעותי על ידי טיפול מקדים בתאים, עם מעכב חלבון קינאז. כדי למנוע כתמי רקע, יש לתייג תאים תואמים מסוג MHC מסוג 1 המכילים או לא מכילים את אוכלוסיית תאי ה-T החיוביים CD8 הספציפיים לאנטיגן, עם הטטרמר הרלוונטי ודילולים מרובים, כדי לקבוע את הכמות האופטימלית המביאה להפרדה הטובה ביותר בין תאי T חיוביים ל-CD8 חיוביים לשליליים.

בגרפים אלה, מוצגת אסטרטגיית השער המשמשת לניתוח הגודל ופנוטיפ הזיכרון של תגובות תאי T חיוביים CD8 ספציפיים ל-Gag CM9 המושרים על ידי חיסון בקוף מקוק רזוס חיובי Mamu-A 01. שימו לב שאוכלוסיית תאי ה-T החיוביים לטטרמר CD8, מופרדת היטב עם צביעת רקע מינימלית. ועם תת-קבוצות הזיכרון המתוארות בבירור על ידי ביטוי CD28, CCR7 ו-Granzyme B שלהם בתוך שער הטטרמר.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את הריאגנטים הנכונים לכל תערובת נוגדנים או טטרמר, ולעבוד עם צינורות הניסוי בכל פעם כפי שהודגם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את הספציפיות והפנוטיפ של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר צביעת טטרמר MHC מסוג 1 בבדיקה של מודל מקוק רזוס של מחקר איידס HIV-1 אנושי. אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות מקופי מקוק רזוס דורשת אמצעי זהירות מיוחדים כמו לבישת ציוד המגן האישי המתאים במהלך עיבוד הדגימה.