מדידת הפצת החלקיקים גודל פתרונות דלוחים ידי Dynamic Light פיזור מיקרוסקופי
9 בינואר 2017
פרוטוקול עבור המדידה הישירה של התפלגות גודל חלקיקי תמיסות מרוכזות באמצעות מיקרוסקופ פיזור אור דינאמי מוצג.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להדגים שניתן להשתמש בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי למדוד את התפלגות גודל החלקיקים בתמיסות עכורות ללא דילול. זוהי ההגדרה למיקרוסקופ פיזור האור הדינמי. יש לו לייזר מצב מוצק המסוגל לפעולת גל רציפה של 30 מיליוואט ב-488 ננומטר.
יש גם פוטו-דיודה מפולת, מתאם אוטומטי המחובר למחשב למדידות. למיקרוסקופ ההפוך בהתקנה יש שלב עם ווסת טמפרטורה. הקופסה מכילה את שאר האלמנטים האופטיים הנדרשים לניסוי.
סכימה זו מספקת תצוגה מלאה יותר של הפריסה עבור ההתקנה. לאחר עיצוב פרופיל האלומה, הקרן מוכנסת למיקרוסקופ. פיזור האור מתקבל עם גיאומטריית פיזור אחורית ומונחה לגלאי.
מראת שיגור מאפשרת לצפות בחלק מהאור המוחזר באמצעות מצלמת CCD. יש להכין את הדגימות לניסוי יום מראש. הכנת הדגימה דורשת 20 מיליליטר של מים נטולי גז, נטולי יונים וכן NIPA מטוהרים.
בנוסף, הוא דורש כמויות קטנות של TMEDA ואמוניום פרסולפט. שלבי ההכנה עושים שימוש גם באמבט מי קרח על בוחש, שני כלי תגובה, רדיד אלומיניום ומקור לזרימת גז ארגון. התחל במדידת 9.5 מיליליטר של מים נטולי גזים ונטולי יונים לתוך כלי תגובה.
מוסיפים את ה-NIPA למים. לאחר מכן, העבירו את כלי התגובה לאמבט מי הקרח על המערבל, והוסיפו את מוט הערבוב. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את האמבטיה ואת הכלי כדי להגן על התגובה מפני אור.
השתמש בקצה פיפט המחובר למקור הארגון כדי לארגן זרימת ארגון מתונה לתמיסה. הפעל את המערבל כדי לערבב בעדינות את התמיסה למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפט כדי למדוד 11.9 מיקרוליטר של TMEDA.
בקצרה, משוך את נייר הכסף לאחור כדי להוסיף את ה-TMEDA לתמיסה ולאחר מכן המשך לערבב תחת גז ארגון למשך דקה נוספת. בזמן ערבוב הדגימה, עבדו עם כלי התגובה השני. הכניסו 4 מיליגרם אמוניום פרסולפט לכלי.
לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר מים נטולי גז ונטולי יונים. כאשר האמוניום פרסולפט התמוסס, הוסף את התמיסה לתמיסת הדגימה והמשיך לערבב במשך 30 שניות תחת זרימת ארגון. לאחר 30 שניות, הסר את כלי התגובה מאמבט הקרח והמערבל.
לקראת האחסון מכסים את הכלי בנייר אלומיניום, מעבירים את התמיסה למקרר לאחסון בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני השימוש בו. לאחר אחזור תמיסת הדגימה, הכינו אותה לשימוש עם המיקרוסקופ. הכינו שתי שקופיות חלל, שני כיסויי זכוכית עגולים ודבק מתאים, על מנת ליצור דגימה ושקופית התייחסות סטנדרטית.
עבור שקופית הדגימה, מדוד 60 מיקרוליטר מתמיסת הדגימה. הניחו את התמיסה באחת ממגלשות החלל. מכסים את התמיסה בכיסוי עגול, נזהרים לא ללכוד בועות אוויר.
הסר עודפי תמיסה בעזרת מיקרופיט ומגבוני מעבדה. לאחר מכן, מרחו דבק על היקף הכיסוי על מנת לאטום את שקופית הפתרון. לאחר מכן, צור הפניה סטנדרטית.
לשם כך, השתמש בתמיסת לטקס פוליסטירן 0.1 אחוז משקל. בשקופית החלל השנייה, הוסיפו 60 מיקרוליטר מתמיסת הלטקס מפוליסטירן, כסו אותה בכיסוי זכוכית וודאו שלא נלכדו בועות. לאחר הסרת כל תמיסה עודפת, יש למרוח דבק כדי לאטום את התמיסה בשקופית.
עבור שתי השקופיות, הניחו לדבק להתייבש בטמפרטורת החדר. בשלב זה, קח את שקופית הייחוס למיקרוסקופ ההפוך המצויד בעדשה אובייקטיבית פי 10, והנח אותה על במת המיקרוסקופ. זכוכית הכיסוי צריכה להיות פונה כלפי מטה.
המשך על ידי הנחת קרן דampמול הגלאי. לאחר מכן, החל את קרן הלייזר על הדגימה דרך עדשת האובייקטיב. עברו לעבודה עם עדשת האובייקטיב.
התאם את גובה העדשה כדי להגדיר את נקודת המוקד. במבט עם ה-CCD, כאשר המטרה עולה ממיקומה הנמוך ביותר, התמונה המשתקפת תתמקד תחילה במשטח זכוכית הכיסוי. לאחר מכן הוא יתמקד בממשק בין זכוכית הכיסוי לדגימה.
הוא יתמקד בפעם השלישית בממשק בין המדגם לזכוכית השקופיות. הגדר את נקודת המוקד בין ממשק דוגמת הכיסוי לממשק השקופיות לדוגמה. להחליש את האור המפוזר על ידי הפחתת עוצמת הלייזר.
לאחר מכן, הסר את בלוק האלומה כדי להכניס אור מפוזר לגלאי. כשהוא מוכן, התחל מדידת מתאם זמן של 30 שניות באמצעות מחשב הבקרה. לאחר מכן, כוונן את נקודת המוקד של המיקרוסקופ לפני שתחזור על המדידה.
השתמש במספר מוקדים כדי להשיג טווח רחב עבור המשרעת הראשונית של פונקציית מתאם הזמן. לאחר שנאספו מספיק נתונים, הנח בולם קרן מול הגלאי. במיקרוסקופ, הסר את שקופית הייחוס הסטנדרטית.
התחל את תהליך מדידת הדגימה עם שלב מיקרוסקופ ריק והגדר את הטמפרטורה ל-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הנח את שקופית הדגימה המוכנה על הבמה כשצד הכיסוי כלפי מטה. התאם את גובה עדשת המטרה כדי לזהות ממשק מדגם כיסוי.
התאם אותו עוד יותר כדי למצוא את ממשק השקופיות לדוגמה. לצורך המדידה, הגדר את נקודת המוקד בין שני המיקומים הללו. הסר את הקורה דampמלפני הגלאי.
במחשב, בצע מדידת מתאם זמן של 30 שניות. לאחר מכן, הגדר את טמפרטורת הבמה ל -35 מעלות צלזיוס. מכיוון שממוזג זה נמצא מעל טמפרטורת התמיסה הקריטית הנמוכה יותר, התמיסה תעבור משקוף לעכור.
בצע מדידה נוספת של פונקציית מתאם הזמן. להלן פונקציות מתאם הזמן עבור תקן מתלי לטקס פוליסטירן בשני מוקדים שונים. העקומה האדומה תואמת לפונקציית מתאם זמן שהמשרעת ההתחלתית שלה היא בערך אחת.
העקומה הכחולה מתאימה למשרעת התחלתית של כ-0.2. זוהי התפלגות הגודל המתקבלת על ידי התמרת לפלס הפוכה של הנתונים עם משרעת התחלתית של 0.2. החישוב לוקח בחשבון את ההשפעה של הטרודיניזציה חלקית.
רדיוס החלקיקים הנומינלי הוא 50 ננומטר. פונקציות מתאם זמן אלו מיועדות לפולי (NIPA) מתחת ומעל לטמפרטורת תמיסה קריטית נמוכה יותר. העקומה השחורה תואמת למדידה ב-25 מעלות צלזיוס.
העקומה האדומה מתאימה למדידה ב-35 מעלות צלזיוס, ומיד לאחר שהתמיסה הפכה לעכורה. העקומה הכחולה מיועדת למדידה ב-35 מעלות צלזיוס, 20 דקות לאחר שהתמיסה הפכה עכורה. להלן התפלגות הגודל המשויכת לכל אחד מתנאי המדידה.
מתחת לטמפרטורת התמיסה הקריטית הנמוכה יותר, הרדיוס ההידרודינמי הממוצע הוא כמה עשיריות ננומטר. מעל הטמפרטורה הקריטית, הגודל הוא כמיקרומטר אחד. השינוי בעקומות עם ממוזג וזמן מרמז על צמיחת הצבירה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למדידת התפלגות גודל חלקיקים בתמיסות מרוכזות באמצעות מיקרוסקופיית פיזור אור דינמי. השיטה מאפשרת ניתוח של תמיסות עכורות ללא צורך בדילול.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- פיזור אור דינמי הוא טכניקה המשמשת למדידת גודלן של חלקיקים בתמיסה.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית משפרת את המדידה על ידי אספקת דימוי מפורט.
- שיטה זו מועילה במיוחד עבור תמיסות מרוכזות ועכורות.
- הכנת הדגימה היא קריטית למדידות מדויקות.
מטרת המחקר
- להדגים את היעילות של פיזור אור דינמי בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- לספק פרוטוקול מפורט להנחיית חוקרים.
- לאפשר מדידות ללא דילול של הדגימות, תוך שמירה על ריכוזן המקורי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות באמצעות מים דה-יוניים מנווננים וריאגנטים ספציפיים.
- שימוש במערך מיקרוסקופ לפיזור אור דינמי (Dynamic Light Scattering) עם לייזר מצב מוצק.
- מדידה של פונקציות קורלציה של זמן לניתוח התפלגות גודל החלקיקים.
- ביצוע התאמות של נקודות מוקד וטמפרטורה במהלך המדידות להערכת שינויים בעכירות.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של התפלגות גודל חלקיקים בתמיסות עכורות.
- הדגמה של האופן שבו הטמפרטורה משפיעה על הצלילות והפיזור של התמיסה.
- הנתונים שנאספו הראו אמפליטודות ראשוניות משתנות התואמות לגדלי חלקיקים שונים.
- טרנספורמציה הפוכה של לפלס (Inverse Laplace transform) שימשה לחישוב התפלגויות הגודל מנתוני המתאם הזמני.
מסקנות
- הפרוטוקול מודד ביעילות את התפלגות גודל החלקיקים ללא דילול.
- פיזור אור דינמי בשילוב עם מיקרוסקופיה מספק שיטה חסונה לניתוח תמיסות מרוכזות.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול תחומים שונים שבהם ניתוח גודל החלקיקים הוא קריטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
מיקרוסקופיה של פיזור אור דינמי מאפשרת ניתוח ישיר של גודל חלקיקים בתמיסות עכורות ומרוכזות ללא דילול, ובכך משמרת את התנאים הטבעיים של הדגימה. יכולת זו תומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים על ידי אספקת נתוני התפלגות גודל כמותיים עבור מערכות פולימריות או קולואידליות הרלוונטיות להולכת תרופות ולפיתוח פורמולציות. השיטה מפחיתה את השונות הניסויית הנובעת מדילול, ובכך משפרת את מהימנות הנתונים לצורך קבלת החלטות של go/no-go בבחירת מועמדים בשלב הפרה-קלייני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מעברים תרמודינמיים בפולימרים המגיבים לטמפרטורה, ובכך תומך בהבנה מכניסטית של התנהגות הפרדה של פאזות.
- ערך תפעולי: מספק מדידת גודל ללא סימון ולא הרסנית בתנאים טבעיים, ובכך מפחית ארטיפקטים הנובעים מהכנת הדגימה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק מדידות כמותיות של רדיוס הידרודינמי לאורך מדרגי טמפרטורה, דבר המאפשר קישור בין שינויים בגודל לבין עכירות התמיסה.
- ערך תפעולי: מאפשר ביצוע בדיקות מדידת גודל סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור ננו-חלקיקים פולימריים או הידרוגלים ללא שלבי דילול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בהערכה של נשאי תרופות תגובתיים תרמית על ידי מעקב אחר התפתחות הגודל מעל ומתחת לטמפרטורות מעבר קריטיות.
- ערך תפעולי: מאפשר ניטור ארוך טווח של קינטיקת אגרגציה בפורמולציות עכורות, המעניק מידע לצורך הערכות יציבות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם גודל החלקיקים ומצב האגרגציה נותנים מידע על מעורבות המטרה והיתכנות הניסוח, במיוחד עבור מערכות הולכה המגיבות לגירויים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על שינויים בקונופורמציה של פולימרים ומנגנוני אגרגציה באמצעות מדידה ישירה של גודל.
- סריקה: מאפשר קבלת תוצאות מדידת גודל הדירות וניתנות לשחזור עבור מערכות קולואידליות תחת תנאים סביבתיים משתנים.
- אנליטיקה: מייצר נתוני קורלציה של זמן והתפלגויות גודל באמצעות טרנספורמציית לפלס הפוכה, ובכך מספק פלטים כמותיים לניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין נתוני מעבר גודל לבין ביצועי הפורמולציה, ובכך תומך בקידום מועמדים תגובתיים תרמית תוך התאמה לסיכון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לניתוח גודל במגוון פרויקטים הכוללים דגימות עכורות או ריכוזיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהתנהגות פולימרים על ידי ביטול ארטיפקטים הנגרמים מדילול ולכידה של דינמיקה במצב טבעי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות ואת התפוקה על ידי שילוב של מדידת גודל והדמיה במערך יחיד התואם למיקרופלואידיקה.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון בשלבי הפורמולציה המאוחרים על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של אגרגציה או הפרדה פאזית במועמדים מובילים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מבוסס סיכונים של מערכות הובלה פולימריות באמצעות נתוני גודל אובייקטיביים השומרים על הריכוז.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכיול אופטי, בטיחות לייזר וספקטרוסקופיית קורלציה לצורך רכישת נתונים מדויקת.
- תלוי במקורי לייזר יציבים, גלאי פוטון בודד ובבמות בבקרה טמפרטורית לקבלת מדידות עקביות.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לאטימה של הדגימות כדי למנוע התאיידות או זיהום במהלך מדידות ממושכות.
- התאמה למקדמי שבירה או לפרופילי בליעה שונים עשויה לדרוש התאמות כיול לצורך קביעת גודל מדויקת.
- דיוק המדידה תלוי במיזעור השפעות של פיזור מרובה באמצעות שער קונפוקאלי מותאם, כפי שנתמך בשיטת המקור.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:36
Overview of the Dynamic Light Scattering Microscope
1:30
Sample Preparation: Temperature-responsive Polymer Solution
3:32
Preparation of the Sample Mounts
4:47
Optimization of the Instrument
6:19
Sample Measurement
7:13
Results: Size Distributions for Poly(Nisopropylacrylamide) (PNIPA) and a Polystyrene Latex Suspension
8:41
Conclusion
