שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל
January 6th, 2017
אנו מתארים מסגרת המשלבת ניתוח ביוכימי וחישובי פשוט כדי להנחות את האפיון וההתגבשות של תחומי סליל מפותלים גדולים. ניתן להתאים מסגרת זו לחלבונים כדוריים או להרחיב אותה כדי לשלב מגוון טכניקות בעלות תפוקה גבוהה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ולבדוק במהירות גבולות תחום אפשריים בתוך חלבוני סליל סליל גדולים כדי לשפר את הסבירות למציאת שבר פנימי שיתגבש. שיטה זו יכולה לעזור לחוקרים לייעל את תהליך ההתגבשות של חלבוני סליל סליל גדולים, שיכולים להיות קשים מאוד להתגבש. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא משלבת שיטות ניסיוניות וחישוביות כדי לזהות ולסנן במהירות מועמדים פוטנציאליים להתגבשות, ובכך לשפר את סיכויי ההצלחה שלהם.
ידגימו את הטכניקה הזו ג'נה זלבסקי, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי, וקית' אוקונור, חוקר לתואר ראשון במעבדה שלי. כדי להתחיל, שלב פלט מכלים מבוססי אינטרנט מבוססים כדי ליצור תחזיות של גבולות תחום סליל מפותל אפשריים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר יצירת פלסמידים לביטוי ובדיקת רמות הביטוי שלהם כמפורט בטקסט, התחל בטיהור של כל זן שביטא בהצלחה חלבון מתויג רובי.
כדי ליז את התאים, תחילה יש להשעות מחדש כל כדור תא מופשר ב-1.5 מיליליטר של מאגר ליזה שנוסף עם מעכבי פרוטאז. הוסף 30 מיקרוליטר ליזוזים בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר ודגר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן סוניקט, בהתאם להוראות המכשיר בו נעשה שימוש. צנטריפוגה את הדגימה בצנטריפוגה שולחנית למשך 30 דקות ב-14,000 פעמים G כדי לגלול חומר בלתי מסיס או תאים לא ליזים.
שמור גם את הסופרנטנט וגם את הגלולה לניתוח הבא באמצעות SDS-PAGE. כדי לבצע טיהור זיקה לניקל, דגרו תחילה 100 מיקרוליטר מחרוזי הניקל NTA, שנשטפו מראש במאגר ליזה עם הליזאט המסיס למשך חמש עד 10 דקות. הפוך את המתלה מספר פעמים כדי לערבב את החרוזים.
צנטריפוגה את הדגימה ב-800 פעמים G למשך 30 שניות בצנטריפוגה שולחנית כדי לגלול את החרוזים. עקוב אחר כך על ידי שטיפת הגלולה שלוש עד חמש פעמים עם מאגר ליזה כדי לנקות מזהמים לא ספציפיים. לבסוף, הסירו את חלבון ההיתוך רובי מהחרוזים עם חיץ ליזה, בתוספת אימידזול טוחנת אחת.
השתמש בספקטרופוטומטר המוגדר ל-280 ננומטר כדי למדוד את ריכוז חלבון ההיתוך של רובי, ולאחר מכן העריך את ההומוגניות של הדגימה על ידי העמסת 1 עד 5 מיקרוגרם של חלבון היתוך על ג'ל PAGE מקורי. הפעל את ג'ל ה-PAGE המקורי של 10% בארבע מעלות צלזיוס למשך 140 דקות ב-175 וולט. דמיין את ה-PAGE המקורי באמצעות הדמיה המצוידת להמחשת הקרינה, תוך התבוננות לאן ההיתוך המתויג Ruby נודד בבדיקה זו.
בצע פרוטאוליזה מוגבלת לזיהוי תחומים מקופלים ביציבות על ידי דגירה ראשונה של 95 מיקרוליטר של היתוך Ruby-Shroom SD2 עם חמישה מיקרוליטר של 0.025 Subtilisin A.דגימת התגובה בנקודות זמן של אפס, 0.5, שתיים, חמש, 15, 60 ו-120 דקות, הסרת 10 מיקרוליטר מהתגובה עבור כל נקודת זמן והדמיית התקדמות התגובה באמצעות SDS-PAGE באמצעות ג'ל אקרילאמיד 15%. צבעו את הג'ל בכחול Coomassie כדי להעריך אם ניתן לזהות מין עמיד לפרוטאז. שלב את הנתונים מיעילות הטיהור, ההתנהגות ב-PAGE מקורי ופרוטאוליזה מוגבלת על חלבוני ההיתוך mRuby2-Shroom המטוהרים חלקית להערכה מקיפה של ההתנהגות הכוללת של חלבונים אלה בתמיסה.
בצע ביטויים בקנה מידה גדול עם תרביות של שני ליטר של mRuby2-Shroom SD2 במטרה להשיג חמישה עד 20 מיליגרם של דגימה מטוהרת לחלוטין. לאחר צמיחת התאים, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 8,000 פעמים G למשך 10 דקות. ניתן לאחסן את כדור התא המתקבל במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לצורך.
לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה בכשמונה מיליליטר של מאגר ליזה לכל גרם של כדור תאים קפואים. ליז את התאים התלויים מחדש באמצעות הומוגנייזר. לאחר ליזה של תאים, גלולה את הפסולת הסלולרית באמצעות צנטריפוגה ב-30,000 פעמים G למשך 30 דקות.
לאחר מכן, אצווה קושרת את השבר המסיס באמצעות 10 מיליליטר של שרף ניקל NTA שטוף מראש. יוצקים את תרחיף החרוזים לתוך עמוד כבידה מתאים ומאפשרים לחלבונים לא קשורים להתנקז, ואז שוטפים את השרף שלוש עד חמש פעמים עם 40 מיליליטר של מאגר ליזה, ולאחר מכן שטיפה עם מאגר ליזה בתוספת נתרן כלורי מולרי אחד. בצע שטיפה סופית של השרף עם 40 מיליליטר של מאגר ליזה בתוספת 80 מילי-מולרי אימידזול.
יש לסלק את חלבון ההיתוך Ruby-Shroom עם 40 מיליליטר של מאגר ליזה המכיל אימידזול מולארי אחד. חלקו ידנית את החלבון המופרש לארבעה עד 10 שברים של מיליליטר. אשר שברים המכילים חלבון היתוך Ruby-Shroom באמצעות ג'ל 10%SDS-PAGE.
הוסף מיליגרם אחד של פרוטאז TEV על כל 25 עד 50 מיליגרם של חלבון היתוך כדי להסיר את תג ה-Ruby. לאחר מכן, דיאליזה של השברים המתאימים למאגר מחשוף TEV באמצעות צינורות דיאליזה במשקל מולקולרי של שישה עד שמונה קילו-דלטון. דיאליזה של החלבון למשך הלילה בטמפרטורת החדר תוך ערבוב איטי.
לאחר דיאליזה, חזור על שלבי טיהור זיקת הניקל. תחום Shroom-SD2 אמור לזרום לתוך השבר הלא קשור בעוד תג Ruby נשאר קשור לשרף. באמצעות רכז ספין, רכז את שברי השיא לכ-10 מיליגרם למיליליטר, ולאחר מכן בצע כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל המנתחת שברי שיא באמצעות ג'ל SDS-PAGE של 12%.
לאחר איגום שברי השיא, דיאליזה של התמיסה למאגר התגבשות, ולאחר מכן רכז את החלבון הדיאליזה ל-10 מיליגרם למיליליטר לפני ההתגבשות. סנן מערך קטן של 12 תנאים כדי לזהות ריכוז חלבון אופטימלי לניסויי התגבשות באמצעות 24 מגשי התגבשות טיפות יושבים היטב. לבצע ניסויי התגבשות בשיטת דיפוזיה של אדים.
ראשית, צינור 500 מיקרוליטר מכל אחד מ -12 התנאים לבארות נפרדות. על כל הדום, הכינו טיפות המכילות מיקרוליטר אחד של תמיסת באר ומיקרוליטר אחד של דגימת חלבון. אטום במהירות את המגש עם סרט שקוף, ולאחר מכן העבר את המגש לסביבה מבוקרת טמפרטורה מתאימה ונטולת רעידות.
בחנו את הטיפות במגשים במהלך שלושת הימים הקרובים באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה של עד פי 100. בתום תקופת שלושת הימים, ציין כל טיפה כאילו אינה מכילה משקעים, משקעים קלים, משקעים כבדים או גבישים. ריכוז חלבון מתאים צריך להכיל לא יותר משישה משקעים כבדים.
באמצעות ריכוז החלבון שנקבע, יש לסנן מגוון רחב של מסכי התגבשות הזמינים מסחרית. השימוש ברובוט לטיפול בנוזלים או התגבשות מזרז מאוד את התהליך הזה תוך מזעור שגיאות בטיפות. זה דורש הרבה פחות חלבון, מה שמאפשר למשתמש לסנן יותר תנאים עם דגימה אחת.
שפר את התנאים ההתחלתיים שזוהו ממסכים רחבים על ידי שינוי שיטתי של כל אחד מהמשתנים בתוך ירידת ההתגבשות באמצעות 24 מגשי מסך בארות, כמו קודם. פרוטאוליזה מוגבלת משמשת לזיהוי אזורים בחלבון שעשויים להיות גמישים או נגישים יותר לפרוטאז. מוצג כאן דפוס השפלה עבור תחום SD2 שהוא רגיש מבחינה פרוטאוליטית, ואחר שהוא יציב למדי.
פרוטאוליזה מוגבלת בוצעה בהקשר של חלבוני היתוך רובי. במקרה זה, רצף המקשר בין רובי לתחום SD2 נחתך במהירות, כצפוי, אך שברי הרובי וה-SD2 שנוצרו נותרו יציבים ברובם. ניתוח על ידי PAGE מקורי יכול לחשוף במהירות מועמדים טובים להתגבשות.
ארבעה קומפלקסים של שרום-רוק עם סוללות חלבון שונות הופעלו על ג'לים מקוריים של PAGE. הקומפלקס שהכיל את סלע 834 עד 913 היה בעל ההתנהגות הטובה ביותר והתגבש בקלות, בעוד שהאחרים התגבשו רק בהשפלה או לא הצליחו להתגבש לחלוטין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח קבוצה של גבולות תחום פוטנציאליים עבור חלבון הסליל המפותל הגדול שלך וכיצד להשתמש במערכת Ruby כדי לזהות במהירות ובמהירות את המועמדים הטובים ביותר להתגבשות.
בעוד שקריסטלוגרפיה נותרה מאמץ גוזל זמן, שימוש בטכניקה זו ימקד את החיפוש שלך אחר חלבונים שיתגבשו באמצעות מבחנים פשוטים כדי להסיר מועמדים גרועים, מה שיאפשר לך להשקיע יותר זמן במועמדים עם סיכויי הצלחה טובים יותר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול מידע רב ככל האפשר בעת בחירת גבולות הדומיין האפשריים שלך. המידע שתבחר לבחור בעת שימוש בהליך זה ישתנה עבור כל חלבון.
במידת האפשר, יש לבצע שיטות אחרות, כמו בדיקות מבוססות תאים או ביוכימיות, כדי להבטיח שחלקי החלבון המדוברים עדיין מכילים את הפונקציה של העניין הביולוגי. למרות ששיטה זו מתמקדת בחלבוני סליל מפותלים, ניתן להתאים בקלות את המסגרת הכוללת כמעט לכל חלבון. אל תשכח שעבודה עם מכשור מסוים וריאגנטים ביולוגיים עלולה להיות מסוכנת, ויש להקפיד תמיד על אמצעי זהירות, כגון שימוש בכפפות או הרכבת משקפי מגן, בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג מסגרת המשלבת ניתוח ביוכימי וחישובי כדי לשפר את האפיון והגיבוש של תחומים גדולים של סלילי-על. השיטה שואפת לייעל את תהליך הגיבוש עבור חלבונים מאתגרים אלו.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מבנית
- גיבוש חלבונים
רקע
- חלבונים גדולים של סלילי-על קשים לגיבוש.
- זיהוי גבולות תחום הוא קריטי להצלחת הגיבוש.
- שילוב שיטות ניסיוניות וחישובי יכול לשפר את שיעורי ההצלחה.
- מסגרת זו ניתנת להתאמה לסוגי חלבונים שונים.
מטרת המחקר
- לזהות במהירות גבולות תחום פוטנציאליים בחלבונים של סלילי-על.
- לשפר את הסבירות לגיבוש שברי חלבון אינטרינזיים.
- לשלב שיטות ניסיוניות וחישובי לתוצאות טובות יותר.
שיטות ששימשו
- שימוש בכלים מבוססי אינטרנט לחיזוי גבולות תחום של סלילי-על.
- ייצור פלסמידים להבעה לבדיקת רמות ביטוי חלבוניות.
- טיהור של חלבונים שהובאו בהצלחה לניסיונות גיבוש.
- הדגמה של הטכניקה על ידי חוקרי מעבדה.
תוצאות עיקריות
- המסגרת מזהה ביעילות מועמדים מבטיחים לגיבוש.
- שילוב של שיטות משפר את היעילות של תהליך הגיבוש.
- הדגמה מוצלחת של הטכניקה על ידי חוקרים לתואר שני ולתואר ראשון.
- פוטנציאל להתאמה לסוגי חלבונים אחרים מעבר לסלילי-על.
מסקנות
- המסגרת המוצעת מסייעת משמעותית בגיבוש חלבונים גדולים של סלילי-על.
- שילוב של חיזויים חישוביים עם אימות ניסיוני משפר את שיעורי ההצלחה.
- גישה זו יכולה להיות כלי חשוב לחוקרים בביולוגיה מבנית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Crystallizing large coiled-coil proteins remains a significant bottleneck in structural biology and target validation, often consuming substantial resources with low success rates. This integrated wet and dry lab approach enables rapid identification of crystallizable protein fragments, reducing wasted effort on non-viable candidates. By improving hit rates in early-stage structural screening, the method supports more efficient lead identification and de-risks downstream structural and functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of domain boundaries to isolate stably folded fragments for structural characterization.
- Operational Value: Uses fluorescent tagging (mRuby2) for rapid visualization and quantification under standard imaging conditions.
- Strategic Value: Filters out aggregation-prone or unstable constructs early, focusing resources on high-potential targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Combines computational domain prediction with empirical validation via native PAGE and limited proteolysis.
- Operational Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts for protein concentration and homogeneity assessment.
- Strategic Value: Creates a reusable screening cascade adaptable to high-throughput expression and robotic crystallization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms structural integrity of purified domains through protease resistance and native gel mobility.
- Operational Value: Enables iterative refinement using data from initial screening to improve construct design.
- Strategic Value: Increases confidence in selecting fragments that retain functional relevance for downstream assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking computational target selection to empirical validation and structural screening, thereby informing go/no-go decisions before significant investment in crystallization campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of domain boundaries through combined bioinformatics and experimental validation.
- Screening: Delivers assay-ready, fluorescently tagged protein samples with quantified concentration and homogeneity metrics.
- Analytics: Provides native PAGE and proteolysis data to assess structural stability and domain integrity.
- Translational Research: Ensures selected fragments maintain structural fidelity, supporting continuity into functional and structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable framework applicable across diverse protein targets beyond coiled-coils.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target suitability by reducing mechanistic ambiguity in protein behavior.
- Operational Value: Increases reproducibility through standardized lysis, purification, and quantification steps.
- Strategic Value: Reduces time and reagent expenditure on low-probability constructs, improving capital efficiency in structural projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on empirical crystallizability metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein purification, and fluorescence-based detection.
- Dependent on access to spectrophotometry, native and SDS-PAGE systems, and fluorescence imaging equipment.
- Necessitates cross-team alignment on construct design, tagging strategies, and data interpretation between computational and experimental groups.
- Adaptation to non-fluorescent or non-tagged systems may require alternative detection methods.
- Success depends on accurate domain boundary prediction and careful interpretation of proteolysis and gel shift data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
Express and Purify Proteins with Identified Domain Boundaries
2:38
Characterize Protein Sample to Identify Those with Advantageous Properties
4:16
Producing High Quality Crystals of the Coiled-coil SD2 Domain from Shroom
8:43
Results: Evaluation of Expression, Purification, Characterization, and Crystallization of Candidate Coiled-coil Proteins
9:49
Conclusion
