שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד תסיסנית התנהגות זחל זחילה
26 בנובמבר 2016
הזחל תסיסנית היא מערכת מודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות. פרסום זה מתאר את השימוש של ערוצי agarose ליניארי לעורר התקפים מתמשכים של זחילה ושיטות ליניארי לכמת את הדינמיקה של מבנים הזחל במהלך התנהגות זחילה חוזרת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בדרוזופילה בשלב הזחל זוחלת בערוץ אגרוז ליניארי כדי לחקור את התפתחות המעגלים העצביים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הנוירו-אתולוגיה והביולוגיה ההתפתחותית, כגון הבנת הקודים העצביים המייצרים דפוסים מוטוריים וזיהוי תהליכים גנטיים ותאיים מרכזיים הכוללים מעגלים עצביים לבקרת תנועה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מגבילה את רפרטואר התנהגות הזחלים כך שהחוקרים יכולים לחקור דפוס רב יחיד בפירוט.
מי שידגים את ההליך יהיה זריון מרשל, טכנאי מהמעבדה שלי. ראשית חשוב להעריך את בריאות הזחל. שלושה עד ארבעה ימים לפני ההקלטה, החלף את לוחית האיסוף של כלוב המבוגרים.
המשך לעשות זאת מדי יום ובאותה שעה ביום. ספרו את הביצים והזחלים שזה עתה בקעו בצלחת. מספר הביצים הצפוי הוא בין 500 ל-2,000.
התאם את מספר המבוגרים בכלוב לפי הצורך. אנו בוחנים את הצלחת 24 שעות לאחר מכן כדי לקבוע אם הזחלים בריאים. רוב הביצים היו צריכות לבקוע לזחלים, והזחלים היו צריכים לזחול לתוך משחת השמרים.
סימנים לבריאות לקויה כוללים מספר רב של ביצים שלא בקעו, גופי זחלים מתים הרחק ממשחת השמרים, וזחלים עם כתמים כהים במיוחד בבטן המהווים אינדיקטור לתגובה חיסונית. אם הזחלים נראים לא בריאים, החליפו את הכלוב באמצעות צלחות טריות שהוכנו ובדקו את הגנוטיפ של הבוגרים. לצורך הניסוי אספו זחלי כוכב שני שזה עתה בקעו מצלחות בנות יום עד יומיים.
ניתן להשתמש בכל השלבים הללו בניתוח. עבור פרוטוקול זה, יש תבנית יציקת PDMS בערוץ ליניארי. נקו את תבנית היציקה עם אלכוהול איזופרופיל.
לאחר הייבוש, הניחו את התבנית במכסה של עשרה סנטימטרים או בכלי דומה. לאחר מכן ממלאים את התבנית בשלושה אחוז אגרוז מקורר ל -55 מעלות צלזיוס. יוצקים את האגרוז בזהירות כדי למנוע לכידת בועות אוויר בתבנית.
התבנית צריכה להיות מכוסה רק על ידי האגרוז. לאחר ההתמצקות, הוציאו את תעלות האגרוז מהתבנית. חתוך את שולי התעלות בצורת הדיסק ואז טבל את התעלות במים.
ניתן לאחסן אותם במים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שבעה ימים. לפני השימוש בערוצים, הניחו להם להתחמם לטמפרטורת החדר. בחרו ערוץ המתאים לרוחב הזחל.
רוחב התעלות נע בין 100 ל-300 מיקרון וכולן בעומק 150 מיקרון. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחתוך תעלה בודדת מהדיסק המוכן. בעזרת מלקחיים העבירו את התעלה לכיסוי זכוכית בגודל מתאים, החליקו או החליקו כשהצד המחורץ.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי להרים בעדינות זחל מבלי לסחוט אותו. גם מכחול בעל קצה דק עובד היטב. אם לוחצים אותם, רפלקסים של כאב כמו גלגול או גיבון עשויים לשלוט בהתנהגות הזחל בערוץ.
כעת שטפו את הזחל על ידי טבילתו קצרה במים, ולאחר מכן הניחו אותו בתעלה החתוכה תוך התגרות בעדינות במקומו. ברגע שנכנסים לתעלה, התאימו את כיוון הזחל כדי להקל על הדמיית המבנה המבוקש. לאחר מכן הניחו טיפת מים אחת או שתיים משני קצות התעלה כדי למלא את התעלה במים.
אם בועות אוויר כלשהן נלכדות, הרם בעדינות את דפנות התעלה כדי להסיר אותן. כדי להתאים עוד יותר את כיוון הזחל, דחפו בעדינות את התעלה כדי לגלגל את הזחל. הזחל מוכן כעת לצילום.
זחלים בערוצים ליניאריים מבצעים התקפים מתמשכים של זחילה קצבית. בדיקות פלואורסצנטיות נבדקות בקלות. לדוגמה, זחלים המבטאים GFP בתאי העצב שלהם מדוחף GAL4 מראים שינויים דינמיים בעוצמות פלואורסצנטיות הנובעות מחוט העצב במהלך מחזור הזחילה.
מערכת העצבים המרכזית נעה קדימה כמעט באותו זמן שבו ראש הזחל וזנבו כאשר גל של התכווצות שרירים עובר לאורך ציר הגוף, מערכת העצבים המרכזית נעה פנימה והחוצה ממישור המיקוד, מה שגורם לפלואורסצנטיות של חוט העצב להשתנות. השינויים בקרינה כומתו משלושה צעדי זחילה לשלושה זחלים. הדינמיקה של הקרינה של חוט העצב לאורך מחזור הצעדים עקבה אחר דפוס הניתן לשחזור שיכול לשמש לפנוטיפ.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין כיצד לאסוף זחלים להתנהגות, להכין תעלות אגרוז ולהעמיס את הזחלים לתעלות כדי לדמיין את התנהגות הזחילה הליניארית. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בזחלים בעדינות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה משתמש בזחלי Drosophila כמודל לבדיקת הבקרה העצבית של ההתנהגות באמצעות זחילה ליניארית בתעלות אגרוז. המתודולוגיה מאפשרת תצפית מפורטת על תנועת הזחלים ועל הדינמיקה של המעגלים העצביים המעורבים בבקרה מוטורית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירואתולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
- מדעי המוח
רקע
- לרובות Drosophila הן מודלים יעילים לחקר התנהגות.
- הבנת קודים עצביים היא קריטית ליצירת תבניות מוטוריות.
- זיהוי תהליכים גנטיים ותאיים מסייע במיפוי מעגלים נוירונליים.
- הגבלת ההתנהגות מאפשרת מחקר ממוקד של תבניות מוטוריות ספציפיות.
מטרת המחקר
- לתצפת על התנהגות זחילה של זחלים בסביבה מבוקרת.
- לחקור את התפתחותם של מעגלים עצביים המעורבים בתנועה.
- להשיב על שאלות מפתח בנוירו-אתולוגיה ובביולוגיה של ההתפתחות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בתעלות אגרוז ליניאריות לצפייה בזחילה.
- הערכת בריאות הזחלים לפני הניסויים.
- כימות הדינמיקה במהלך התנהגות זחילה חוזרת.
- הדגמת הפרוצדורה על ידי טכנאי מעבדה.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של פרקי זחילה ממושכים בזחלים.
- תצפית מפורטת על דינמיקת מבנה הזחל במהלך התנועה.
- תובנות לגבי המנגנונים העצביים השולטים בדפוסי תנועה.
- ביסוס שיטה מהימנה לחקר התנהגות זחלים.
מסקנות
- השיטה מספקת פלטפורמה למחקר מפורט של מעגלים עצביים.
- הממצאים תורמים להבנת בקרת התנועה ב-Drosophila.
- מחקרים עתידיים יכולים להתרחב מהטכניקה זו כדי לבחון שאלות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות תעלות אגרוז ליניאריות לזחלי Drosophila המטפסים מאפשרות ניתוח מדויק של תפקודי המעגלים העצביים העומדים בבסיס התנהגויות מוטוריות קצביות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ברמת ביטחון גבוהה ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבים המוקדמים ביותר של גילוי תרופות מונחה נוירוביולוגיה. השחזוריות של השיטה והפלטים הכמותיים שלה מציבים אותה כפלטפורמה לשימוש חוזר לסריקה פנוטיפית ומחקר תרגומי בלימודי התפתחות נוירונלית ובקרה מוטורית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה מפורטת של מנגנוני מעגלים עצביים השולטים בדפוסי תנועה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור הפרעות גנטיות לפנוטיפים התנהגותיים מדידים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי בידוד זחילה קצבית מהתנהגויות מבלבלות.
- מספק פלטפורמה לבדיקה מונחית-היפותזה של נתיבים התפתחותיים-עצביים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת בדיקות התנהגותיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהמשך התהליך.
- מייצרת מדדים כמותיים ברמת הסגמנט והשריר לצורך פנוטיפיקה חסונה.
- מאפשרת הכנה בקנה מידה רחב של מערכות הרלוונטיות למחלה עבור אנליזה בעלת תוכן גבוה.
- תומכת במוכנות של הבדיקה להערכת מודולטורים עצביים או שריריים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם אסטרטגיות של סממנים ביולוגיים תרגומיים (translational biomarkers) על ידי אפשור דימות in vivo של פעילות עצבית במהלך התנהגות.
- מספק רציפות מגילוי גנטי ועד לתיקוף פרה-קליני במודל ניתן לניהול.
- תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי קישור התערבויות מולקולריות לתוצאות תפקודיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים חזויה (predictive de-risking) עבור פורטפוליו של תרכובות נוירו-אקטיביות.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות מוקדמות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני של יעדים נוירו-התנהגותיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על תפקוד מעגלים עצביים ומיפוי מסלולים במערכת הניתנת למניפולציה גנטית.
- סריקה: מספק פלטים התנהגותיים כמותיים הניתנים לשחזור עבור פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של דינמיקת פלואורסצנציה ופרמטרים של מחזור צעידה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לניטור פעילות עצבית in vivo במהלך התנהגות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה גמישה, שאינה תלויה בגנוטיפ, הניתנת להתאמה לצרכי מחקר וסריקה מגוונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את ביטחון הניבוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נוירו-התנהגותיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות התנהגותיות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מחקר.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון באמצעות אספקת פנוטיפינג כמותי חסון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות והתערבויות נוירו-אקטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, בניתוח התנהגותי ובדימוי פלואורסצנטי.
- נדרשת גישה לתבניות יציקה, למערכות דימוי ולכלי ניתוח כמותי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של מימדי התעלות ושל פרוטוקולי הדימוי.
- ניתן להתאמה לגנוטיפים שונים ולגאומטריות של תעלות שתוכננו על ידי החוקר.
- מגבלות מעשיות כוללות טיפול זהיר בזחלים כדי למנוע ארטיפקטים הנגרמים ממתח.
