Name: שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד תסיסנית התנהגות זחל זחילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: חקור התנהגות זחילה לינארית של זחלי Drosophila באמצעות ערוצי אגרוז. שיטה זו מאפשרת לחקור מעגלים עצביים ודפוסי תנועה בבקרה מדויקת, ותורמת להבנת מנגנוני השליטה בתנועה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לכריס ורדן ומישל בלנד על ההערות על כתב היד ועל העזרה הטכנית.

1. הכנת הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע לפני הקלטת התנהגות, להגדיר צלב (מינימום של 25 בתולות ו -5 גברים). לשמור על כל הצלבים הצאצאים של 25 מעלות צלזיוס. הערה: הטמפרטורה של תנאי תרבות ניתן לשנות, אבל קו הזמן המתואר להלן היה צריך להיות מותאם חשבון לשינויים במהירות התפתחותית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 ימים לפני ההקלטה, דבר ראשון בבוקר, להציב הצלב לכלוב אוסף עם כובע אגר / מיץ טיפה (0.5-1 מ&quot;ל) של רסק שמרים במרכז הכובע אגר / מיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך כלוב אוסף, חורים לתוך עוז 6. פוליאתילן מרובע בקבוק תסיסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך אגר / כמוסות מיץ, לערבב 18 גרם של אגר עם מיליליטר מי 600 בבקבוק חרוטים. בתוך סוכרוז הבקבוק לערבב 20 גרם נפרד עם מיץ תפוחים 200 מ&quot;ל. מיקרוגל עד מוצקים הם מומסים. מערבבים ומערבבים, המאפשרים לתערובת להתקרר עד 60 ° C. הוסף 20 מ&quot;ל 10% מתיל-p-hydroxybenzoate באתנול 95%, ומערבבים. הוסף ~ 7מ&quot;ל החצי התחתון של צלחת פטרי עגול 10 מ&quot;מ 35 x. אפשר / מיץ אגר לגבש עבור שעה 1 ב RT. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך להדביק שמרים, מוסיף בחלקים שווים על ידי שמרים ומים יבשים נפח. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק את בריאותם של אוספי זחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, 4 ו -3 ימים לפני ההקלטה, להסיר את הכובע למקם כובע טרי על הכלוב. שנה את הכמוסות באותו הזמן בכל יום כדי להגיע אוסף 24 שעות של ביצי זחל שזה עתה בקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל כובע המוסר, לבחון את זה כדי לראות כמה ביצי הצלב היא נחת. צפו בין 500-2,000 ביצים. התאם את מספר המבוגרים, אם יש צורך בכך. הערה: כמה ביצים צריכות בוקעים רימות, ואת הזחלים שזה עתה בקעו יימצאו הרחק להדביק השמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיל כל כובע למשך 24 שעות. לבחון מחדש את הכובע כדי לקבוע אם הזחלים הם בריאים. הערה: ביצים רוב צריך בקעו רימות, ואת הזחלים צריכים זחל לתוך ye<html> הדבק אס &#39;. סימנים של בריאות לקויה כוללים מספר רב של ביצים שלא נולדו, גופי זחל מתו הרחק להדביק שמרים, וזחלים עם כתמים כהים משמעותיים בבטן, מה שמעיד על תגובה חיסונית. אם הזחלים אינם בריאים, לשנות את הכלוב, להפוך כמוסים טריים / שמרי רסק, ולבדוק את הגנוטיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הכובעים הישנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף זחלים להקלטות התנהגותי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשני היום 2 ו 1 לפני ההקלטה, להסיר את הכובע ולהחליף עם כובע טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל כל כובע סיר ולשמור על 25 מעלות צלזיוס. זה יהיה לייצר סדרה מבוימת של זחלים להקלטות התנהגותי. הזחלים מן-שזה עתה בקעו (posthatch hr 0-4) באמצעות instar השני (24-48 שעות posthatch) ניתן להשתמש בערוצים. שמור כמוסים להקלטות בימים עוקבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את כל הכמוסות לאחר 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, חזור על שלבי 1.4.1-1.4.3 עד 5 ד נוספים. אחרי זה פחות ביציות מופרות מיוצרים. </li></ol></li></ol>= &quot;Jove_title&quot;&gt; 2. הכנת ערוצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את PDMS ערוץ ליניארי (polydimethylsiloxane, אלסטומר סיליקון) הליהוק עובש (איור 1 א). PDMS תבניות יציקה זמין ממעבדת Heckscher לפי בקשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את עובש הליהוק עם אלכוהול איזופרופיל. אוויר יבש, טיפה יבשה עם מגבוני מעבדה, או להשתמש ואוויר דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית הליהוק לתוך מכסה צלחת 10 ס&quot;מ פטרי או מיכל אחר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן ויוצק פתרון agarose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון agarose 3% במים (3 גרם ב 100 מ&quot;ל) על ידי במיקרוגל עד להמסה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים 55 ° C, המאפשר בועות לעלות אל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת agarose לתוך צלחת פטרי שמכילה את עובש הליהוק כך העובש פשוט מכוסה. תן סט agarose עד הקרושה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ערוצי agarose מתבנית הליהוק. חתוך את הקצוות של הדיסק agarose עם סכין גילוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הערוץים בצלחת 10 ס&quot;מ פטרי שקוע במים. הם יכולים להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. </li></ol></li></ol> 3. העמסת זחל לתוך ערוץ להתנהגות שיא הערה: אם אחסון ערוצים ב 4 ° C, לאפשר ערוצים לבוא RT לפני השימוש להקלטה התנהגותי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח נקי לחתוך ערוץ אחד מאלה מוכנים בשלב 2 (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים להציב את מחורץ-בצד למעלה ערוץ על coverslip זכוכית (איור 2 ב). הגודל והעובי של coverslip תלוי בהיקף הספציפי המשמש הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בסדר לבחור זחל מן הכובע אגר / המיץ מוכן בשלב 1 ומקום לתוך תעלת החתך (איור 2 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תלחצו הזחל. תרימי אותו בעדינות עם קצה של שן מלקחיים. כמו כן ניתן לתפעל זחל עם מכחול עם נקודה בסדר. הערה: זה חשוב כמו זחלים הם מאוד sensitive לגעת. אם הם לא מטופלים בזהירות, תגובות nociceptive עלולות להשתלט התנהגותם במהלך השניות הראשונות של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הזחלים על ידי השריית אותם בקצרה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהניח את הזחל על הערוץ לחתוך, השתמש קצה חוד המלקחיים כדי להקניט את הזחל בעדינות לתוך חורשת הערוץ. הערה: עבור מרבית יישומי הרוחב של הזחל ואת הרוחב של הערוץ צריך להתאים. רוחבו הממוצע של הזחלים בשלבים שונים של פיתוח כדלקמן: 0 hr posthatch - 140 מיקרומטר, 24 שעות posthatch - 180 מיקרומטר, 48 שעות posthatch - 320 מיקרומטר, 72 שעות posthatch - 500 מיקרומטר, 96 שעות posthatch - 750 מיקרומטר 8. ערוצים לבוא הרוחביים הבא: 100, 150, 200, 250, ו -300 מיקרומטר, וכל הערוצים 150 מיקרומטר עמוקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו בקצה שן מלקחיים או מכחול כדי להתאים את המיקום של הזחל בתוך הערוץ. זה יכול להיות מכוון בכל כיוון: גחוןעד, גחון למטה, גחון לצד אחד, בהתאם למבנה מה הוא להיות צלם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להעיף את הערוץ בעדינות על כך הזחל הוא עכשיו על הזכוכית המכסה. מקום אחד או שתי טיפות מים בקצות הערוץ כך שהוא מתמלא מים (2D איור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות את צידי התעלה כדי להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את הכיוון של הזחל. לשם כך, בעדינות דחיפה בערוץ אבל לא כוס הכיסוי לגלגל את הזחל. אם זה לא משנה את הכיוון, להסיר את מכסה הזכוכית ולשנות את מיקום זחל. הזחל הוא מוכן להיות צלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הערוץ / coverslip על מיקרוסקופ הפוכה. אם הדמיה על מיקרוסקופ זקוף, פשוט להפוך את הערוץ / coverslip. </li></ol></li></ol> 4. מאפיין מדוד ענייני הקלטת התנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מבנה של עניין (למשל, זנב, CNS), למדוד תכונה של עניין (למשל, עוצמת הקרינה, מיקום) לאורך זמן. הערה: מבנים כגון הראש והזנב ניתן להוסיף הערות באופן ידני. לדוגמא, הראש ניתן לזהות כמכיל פי ווים כהים בצורת H, ואת הזנב ניתן לזהות כמכיל spiricles קנה נשימה האחורית. מאמר זה מתמקד חוט העצב. השתמש elav-GAL4 קו GAL4 העצבית לנהוג transgene כטב&quot;מ-MYR-GFP (elav&gt; GFP) 9,10 כדי fluorescently לתייג את מערכת העצבים המרכזית (CNS). מערכת העצבים המרכזית כוללת שתי האונות במוח הקדמי מחובר חוט העצב, אשר משתרע על האחורי (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עוצמת פיקסל של חוט העצב (f (NC)) בכל נקודת זמן (t). להלן מתאר גישת ביאור ידנית, אך צעד זה יכול להיות אוטומטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפיג&#39;י (או תוכנה דומה) בתפריט &#39;לנתח&#39; להשתמש &quot;מדידות הגדר ...&quot; תיבת דו שיח לדווח הערך אפור מרושע slicעמדת דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לצייר תיבה במרכז חוט העצב בפריים הראשון של הסרט (איור 3). צעד זה יכול גם להיות אוטומטי עם אלגוריתמי פילוח תמונה ורישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקודה &quot;מדוד&quot; בתפריט &#39;לנתח&#39; לדווח על עוצמת פיקסל הממוצע באזור עניין התאגרף. זה מייצר חלון &quot;תוצאות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפריים הבא, באופן ידני למקם את התיבה בלי שינוי גודל על ידי שימוש במקשי החיצים. השתמש בפקודה &quot;מדוד&quot; שוב. התוצאות מתעדכנות יוצגו בחלון &quot;תוצאות&quot;. חזור על שלב זה עבור כל מסגרת של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את &quot;תוצאות&quot; באמצעות &quot;שמירה בשם ...&quot; הפקודה מתוך תפריט קובץ. התוצאות תיוצאנה כקובץ .xls. </li></ol></li></ol> 5. ניתוח המדידות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל כל f (NC) ערך לערך בין 0 ל -1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיליון אלקטרוני (או תוכנה אחרת), לפתוח את קובץ Results.xls. קובץ זה יהיה שני עמודים מייצגים מספר מסגרת ועוצמת קרינה ממוצעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך עמודה חדשה ולהשתמש בנוסחה z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / מקס (f [NC]) -min (f [NC]) כדי ליצור ערך הקרינה מנורמל מתאים בכל נקודת זמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תקופת צעד עבור כל פסיעה בהקלטה. הערה: מחזור פסיעה הוא יחיד של תנועה בגוף כולו חוזרת עבור קדימה (הפוך) זוחל. לפי אמנה, ומתחיל לצעוד קדימה (ומסתיים) עם התנועה קדימה של הזנב, הראש, ואיברים פנימיים אחרים כגון במעיים או CNS 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לבדוק את ההקלטה התנהגותי ולהקליט את פעמי החניכה (i) של כל פסיעה (i (מחזור סטרייד [n])). הערה: בדוגמא הבאה, תנועה קדימהשל מערכת העצבים המרכזית כמו תחילתו של מחזור צעד שימש (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל פסיעה לחשב את התקופה: Δ t (מחזור סטרייד) = i (מחזור סטרייד [n + 1]) -i (מחזור סטרייד [n]). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוז מחזור צעד שחלף עבור כל נקודת זמן של ההקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן עמודה נוספת של קובץ הגיליון האלקטרוני מייצג הזמן שחלף מאז תחילת מחזור פסיעה (ג). זמן הגדר מאז התחלת לצעוד יתאפסו על תחילתו של כל פסיעה (ג (מחזור סטרייד [n]) = 0). התאם פעמים לאחר תחילת בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן עמודה נוספת של קובץ הגיליון האלקטרוני המייצג שחלף מחזור צעד אחוז (מחזור צעד%) מחלקי פעמים המתואם לפי תקופת צעד ולהתרבות על ידי 100 להמיר אחוז מחזור הפסיעה שעברה:. מחזור צעד% = (ג (מחזור סטרייד [n] )) / (Δ t (מחזור סטרייד) * 100). </li></ol></li></ol> 6. צור פולאר תאם מגרשים לייצג דינמיקה של מבנים של ריבית לאורך מחזור סריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב MATLAB, השתמש דיאלוג &#39;יבוא הנתונים&#39; בכרטיסיית הבית כדי לייבא את Results.xls המעודכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מערך חדש &quot;תטא&quot; ערכי מחזור צעד המכיל אחוז (מחזור צעד%). ( &quot;תטא = var1&quot; איפה var1 מייצג מחזור צעד%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מערך חדש &quot;רו&quot; מכיל ערכי קרינה מנורמלים (z (t)). ( &quot;רו = גרסה 2&quot; איפה גרסה 2 מייצג z (t)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקודת &#39;polarplot&#39; לחרוש מזימות לתאם קוטביות עם מחזור צעד האחוזים כמו הזווית, ואת הקרינה כמו הרדיוס ( &quot;polarplot (תטא, Rho)&quot;). </li></ol>

<ol><li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism%2C+segment%2C+and+somatic+body+wall+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li>
<li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+rev%22%5BJournal%5D)">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687(1996).</li>
<li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+control+of+swimming+behavior%3A+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li>
<li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li>
<li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Drosophila+motoneurons%3A+specification+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+cell+devl+bio%22%5BJournal%5D)">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li>
<li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-Skipped%28%2B%29+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li>
<li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Behav%22%5BJournal%5D)">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li>
<li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rover%2FSitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development%2C+Food-Patch+Quality%2C+and+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+%2F+MAPK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTufte%2C+ER+%22The+visual+display+of+quantitative+information%22">The visual display of quantitative information</a>. , Graphics Press. Cheshire, CT. (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מכשיר microfluidic נבנה כדי להפוך את ערוצי agarose ליניארי שיכול להכיל זחלים תסיסנית (איור 1). כאשר זחלים תסיסנית ממוקמים ערוצי agarose הליניאריות האלה הרפרטואר ההתנהגותי שלהם מוגבל זחילה, המאפשרת תצפית מפורטת של הדינמיקה של מבנים הזחל על פני מחזור הזחילה. הקלטה מוצלחת מתרחשת כאשר זחל לבצע שורה של צעדים קצובים (איור 3). אם זה לא קורה, לבדוק מכשולים כמו בועת אווי...

המטרה הכללית של שיטה זו היא ללמוד זחילת זחל תסיסנית בפירוט. ניסויים על תנועה שחקו תפקיד חשוב בפיתוח ובדיקת תאוריות על שליטה מוטורית 2. באופן מסורתי תנועת נחקרת בעלי חיים ימיים (למשל, עלוקה, צמד, ראשן) 3. האופי החוזר והנשנה של תנועה אצל בעלי חיים אלה אפשר לחקר rhythmogenesis, לניתוח של אירועי biophysical נהיגת תנועה, ולצורך מעקב את דפוסי הירי העצביים שמלווים תנועה. שימוש זחלים תסיסנית ללימודים של תנועה מציג שילוב ייחודי של יתרונות על פני מערכות מודל אחרות: גנטיקה קלילה, פיתוח היטב מאופיין, גוף ברור אופטי ב instars הראשון והשני, וכן שחזור מיקרוסקופי אלקטרוני שידור מתמשכים של כל מערכת העצבים 4-6. עם זאת, זחל תסיסנית לוקותנועה על משטחים שטוחים פתוחים מעט מורכבת כולל הפסקות, מסתובבת, המתפתל זוחל 7. פרסום זה מציג שיטה להשתמש בערוצי agarose ליניארי להנחות התנהגות של תנועת זחל תסיסנית כך זחלים מבצעים מתמשכים, ישר, התנהגות סריקה קצבית. לימוד התנהגות זחל תסיסנית בערוצי agarose, במקום התנהגות על משטחים פתוחים שטוחים, יש מספר יתרונות. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לבחור זוחל התנהגות במיוחד מתנועות רבות שהן חלק מהרפרטואר ההתנהגותי הזחל. שנית, על ידי התאמת הרוחב של הערוץ אל מול גודל גוף הזחל, מהירות זחילה יכולה להיות מותאמת. שלישית, ערוצי לאפשר הזחל כדי שיוצג מן הגב, הגחון, או צד לרוחב תלוי איך הזחל טעון אוריינטציה בתוך הערוץ. רבגוניות זו באורינטצית זחל מאפשרת לכל מבנה העניין להיות גלוי ללא הרף במהלך סריקה. רביעי,ערוצים ניתנים לשימוש עם מגוון רחב של מיקרוסקופים ויעדים. לדוגמא, ניתן להשתמש בערוצים ליניארית הדמיה ברזולוציה נמוכה על stereoscopes שדה בהיר ו / או הדמיה ברזולוציה גבוהה על מיקרוסקופי confocal-דיסק מסתובב 1. החמישית, בשיטה זו ניתן להשתמש בשילוב עם optogenetic / מניפולציות עצביות thermogenetic בכל רקע גנטי. לבסוף, כי הן גוף הזחל (ב instars הראשון והשני) וערוצי agarose ברורים אופטי, ערוצים ניתן להשתמש כאשר לומדים את התנועות הדינמיות, או שינויים בעוצמת פלורסנט מבנים הזחל שכותרתו ידי בדיקות ניאון גנטית בקידוד. השיטה המתוארת היא מתאימה ללימודי קינמטיקה מפורטים של instar הראשון ושני התנהגות תסיסנית זחל. פרסום זה מנתח את השינויים הדינמיים עוצמת פלורסנט של מערכת העצבים המרכזית במהלך זחילה הזחל קדימה כדי להדגים את השימוש של ערוצים כמבשר neuהדמית סידן רונאל.

<table><tbody><tr><td>6 גרם בקבוק דרוזופילה מרובע</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>סיגמא</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>מיץ</td><td></td><td></td> תפוחים <td>לא מתרכיז</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>methyl-p-hydroxybenzoate</td></tr><tr><td>35 x 10 מ"מ צלחת פטרי עגולה</td><td>פישר</td><td>351008</td><td></td></tr><tr>שמרי <td></td><td></td><td></td><td>אופה</td></tr><tr><td>תבנית יציקה PDMS</td><td>FlowJem</td><td></td><td>ניתן לבקש ממחברים</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>פישר</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני מעבדה</td><td>פישר</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>אוויר משומר</td><td>פישר</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 10 ס"מ</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>פישר</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>פישר</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 זכוכית כיסוי, #1.5</td><td>פישר</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י (גרסה 1.51d)</td> <td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

שימוש בערוצי agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

זחילה הזחל תסיסנית מתגלה כמודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות הסנסורית. עם זאת, התנהגות סריקה זחל על משטחים שטוחים פתוחים היא מורכבת, כולל: נעצר, מסתובב, ואת המתפתל. מורכבות זו ברפרטואר של התנועה מעכבת ניתוח מפורט של האירועים המתרחשים במהלך מחזור צעד לזחול יחיד. כדי להתגבר על מכשול זה, ערוצי agarose ליניארי נעשו מגבילי התנהגות זחל ישר, מתמשך, זחילה קצבית. באופן עקרוני, כי ערוצי agarose ואת גוף זחל תסיסנית הם ברורים אופטי, התנועה של מבנים הזחל שכותרתו ידי בדיקות ניאון-מקודדים גנטיים ניתן לנטר ללא פגע, זחלים-לנוע בחופשיות. בעבר, הזחלים הונחו ערוצים ליניאריים וזחילה ברמת האורגניזם השלם, לפלח שריר נותחו 1. בעתיד, זחלי זחילה בתעלות יכולים לשמש הדמית סידן לפקח נוירופעילות סופית. יתר על כן, שיטות אלה יכולים לשמש עם זחלים של כל גנוטיפ ועם כל ערוץ מעוצב חוקר. כך הפרוטוקול המובא להלן הוא ישים נרחבת ללימודים באמצעות זחל תסיסנית כמודל להבין שליטה מוטורית.

מאמר זה מתאר שיטת מנחת התנהגות זחל תסיסנית באמצעות ערוצי agarose ו למדידת הדינמיקה של מבנים הזחל על פני מחזור זחילה. זחלי ערוצים ליניאריים לבצע התקפים מתמשכים של זחילה קצבית (איור 3). מכיוון שגם זחלים וערוצי ברורים אופטיים, ניתן להשתמש בערוצים עם זחלים להביע בדיקות ניאון מבוטאות בכל מבנה של עניין. הקלטנו הזחלים להביע GFP בכל נוירונים (elav-Gal4 / +; כטב&quot;מ-MYR-GFP / +) וליווה את השינויים הדינמיים עוצמת הקרינה ...

הזחל תסיסנית היא מערכת מודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות. פרסום זה מתאר את השימוש של ערוצי agarose ליניארי לעורר התקפים מתמשכים של זחילה ושיטות ליניארי לכמת את הדינמיקה של מבנים הזחל במהלך התנהגות זחילה חוזרת.

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לצפות בזחלי דרוזופילה (*Drosophila*) נעים בתוך תעלה ליניארית של אגרוזה כדי לחקור את התפתחותם של מעגלים עצביים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הנוירו-אתולוגיה והביולוגיה ההתפתחותית, כגון הבנת הקודים העצביים המייצרים תבניות מוטוריות וזיהוי תהליכים גנטיים ותאיים מרכזיים המעצבים מעגלים עצביים לבקרת תנועה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מגבילה את רפרטואר ההתנהגות של הזחל, כך שהחוקרים יכולים לבחון תבנית רב-שלבית בודדת בפירוט.את הפרוצדורה יעגים זריון מרשל, טכנאי מהמעבדה שלי. ראשית, חשוב להעריך את בריאות הזחלים. שלושה עד ארבעה ימים לפני ההקלטה, החליפו את לוח האיסוף של כלוב הבוגרים.יש לבצע זאת מדי יום ובאותה השעה. ספרו את הביצים והלרוות שבקעו זה עתה על הפיתה. מספר הביצים הצפוי הוא בין 500 ל-2,000.התאימו את מספר הבוגרים בכל כלוב לפי הצורך. נבחן את הצלחת לאחר 24 שעות כדי לקבוע אם הזחלים בריאים. מרבית הביצים אמורות היו לבקוע לזחלים, והזחלים אמורים היו לזחול לתוך משחת השמרים.סימנים לבריאות לקויה כוללים מספר רב של ביצים שלא בקעו, גופות של זחלים רחוקות ממשחת השמרים, וזחלים עם כתמים כהים באופן חריג בבטן, המהווים אינדיקטור לתגובה חיסונית. אם הזחלים נראים לא בריאים, החליפו את הכלוב באמצעות צלחות שהוכנו לאחרונה, ובדקו את הגנוטיפ של הזבובים הבוגרים. עבור הניסוי, אספו זחלים בשלב שני (second instar) שבקעו לאחרונה מתוך צלחות בנות יום עד יומיים.ניתן להשתמש בכל השלבים הללו בניתוח. עבור פרוטוקול זה, השתמשו בתבנית יציקה של PDMS לערוץ ליניארי. נקו את תבנית היציקה באמצעות isopropyl alcohol.לאחר הייבוש, הניחו את התבנית בתוך מכסה של 10 cm או במכל דומה. לאחר מכן, מלאו את התבנית באגרוז בריכוז 3% שהקורר ל-55 °C. שפכו את האגרוז בזהירות כדי למנוע כליאת בועות אוויר בתבנית.התבנית צריכה להיות מכוסה בקושי באגרוז. לאחר ההתמצקות, הוציאו את תעלות האגרוז מהתבנית. קצצו את קצוות התעלות בעלות הצורה הדיסקוית, ולאחר מכן טבלו את התעלות במים.ניתן לאחסן אותם במים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלסיוס למשך עד שבעה ימים. לפני השימוש בתעלות, יש להמתין עד שיגיעו לטמפרטורת החדר. בחרו תעלה המתאימה לרוחב הלרבה.רוחב התעלות נע בין 100 ל-300 מיקרון, וכולן בעומק של 150 מיקרון. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער נקי כדי לחתוך תעלה אחת מהדיסק שהוכן. העבירו את התעלה בעזרת פינצטה לכיסוי זכוכית (cover slip) או לסרטית זכוכית בגודל מתאים, כאשר הצד החרוצים פונה כלפי מעלה.בשלב הבא, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להרים בעדינות זחלה מבלי ללחוץ עליה. מברשת עם קצה דק מתאימה אף היא. אם הזחלה תילחץ, רפלקסים של כאב, כגון התגלגלות או התכווצות, עלולים להשפיע על התנהגות הזחלה בתעלה.כעת שטפו את הזחל על ידי טבילה קצרה במים, ולאחר מכן הניחו אותו בתוך התעלה החתוכה תוך כדי דחיקה עדינה למקומו. לאחר הנחתו בתעלה, התאימו את כיוון הזחל כך שהמבנה המעניין יהיה קל לדגימה במיקרוסקופ. לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת או שתיים של מים בכל קצה של התעלה כדי למלא אותה במים.אם נלכדו בועות אוויר, הרימו בעדינות את דפנות התעלה כדי להסירן. כדי להתאים עוד יותר את כיוון הזחל, דחפו בעדינות את התעלה כדי לסובב את הזחל. הזחל מוכן כעת לצילום.זחלים בתעלות לינאריות מבצעים פרקי זמן ממושכים של זחילה קצבית. ניתן לבחון גששים פלואורסצנטיים בקלות. לדוגמה, זחלים המבטאים GFP בנוירונים שלהם באמצעות מניע GAL4 מראים שינויים דינמיים בעוצמות הפלואורסצנציה הבוקעות מהחוט העצבי במהלך מחזור הזחילה.מערכת העצבים המרכזית (CNS) נעה קדימה כמעט בו-זמנית עם ראש הזחל והזנב; בעוד גל של התכווצות שרירים עובר לאורך ציר הגוף, ה-CNS נעה פנימה והחוצה ממישור המיקוד, מה שגורם לשינוי בפלואורסצנציה של חוט העצבים. השינויים בפלואורסצנציה כוונתו מתוך שלושה צעדי זחילה עבור שלושה זחלים. הדינמיקה של פלואורסצנציית חוט העצבים לאורך מחזור הצעדה עקבה אחר דפוס הניתן לשחזור, שניתן להשתמש בו לצורך פנוטיפיקה.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה כיצד לאסוף זחלים לצורך ניתוח התנהגות, כיצד להכין תעלות אגרז וכיצד להטעין את הזחלים לתעלות כדי להמחיש את התנהגות הזחילה הליניארית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לטפל בזחלים בעדינות.

using-linear-agarose-channels-to-study-drosophila-larval-crawling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

פתחנו מערכת מיקרוסקופ מעקב וידאו שיעור שיכול להקליט...

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

סרטון זה מתאר כיצד לעקוב אחר זבובים ההולכים בחופשיות כדי להעריך את יכולת התנועה הכללית שלהם. הפרוטוקול המוצג מדגים את הגדרת הבדיקה וניתוח הנתונים באמצעות תוכנת מעקב וידאו.

מעקב אחר זבובים מהלכים בחופשיות: שיטה להערכת תנועה בדרוזופילה

סרטון זה מדגים מחקר על התנהגות הניווט של זחלי דרוזופילה בתגובה לגירוי אופטוגנטי של נוירונים חושי ריח (ORN). זחלי דרוזופילה טרנסגניים המבטאים תעלות יונים רגישות לאור ב-ORN ממוקמים על אגרוז בתוך זירת התנהגות. גירוי אופטוגנטי עם אור פותח את הערוצים, גורם לזרם קטיון שמפעיל את העברת האות למוח, והתנהגות הניווט נרשמת.

התנהגות ניווט של זחלי דרוזופילה בתגובה לגירוי אופטוגנטי של נוירוני חוש הריח

מעגל ההאכלה בזחלי melanogaster דרוזופילה משמש מודל פשוט אך רב עוצמה המאפשר שינויים בשער האכלה להיות מתואמים עם שינויים במעגלים העצביים stomatogastric. מעגל זה מורכב מתאי עצב סרוטונין המרכזיים ששולחים תחזיות לפי הווים כמו גם המעי הקדמי.

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה</i

כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכוש וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגרים תסיסנית ופנוטיפים מוטציה זחל מנקודת מבט לרוחב.

רכישת באיכות גבוהה וידאו דיגיטלי של דרוזופילה Behaviors הזחל ומבוגרים מנקודת מבט רוחבי

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבדיקת אורך נתיב חיפוש מזון של Drosophila melanogaster. אנו דנים בהכנה ובטיפול בחיות ניסוי, כיצד לבצע את הבדיקה ולנתח את הנתונים.

פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.

מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים

פרוטוקול זה מציג שיטה בעלת מקום קל לחקור התנהגות של דרוזוהילה זחל פוטוטקטיקה. בשיטה זו, נקודת אור נוצרת כגירוי קל, והתהליך של התחמקות מאור הזחל נרשם על-ידי מערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום.

שיטת האור המבוססת על ספוט לניתוח דרוזופילה זחל פוטומוניות

חקור התנהגות זחילה לינארית של זחלי Drosophila באמצעות ערוצי אגרוז. שיטה זו מאפשרת לחקור מעגלים עצביים ודפוסי תנועה בבקרה מדויקת, ותורמת להבנת מנגנוני השליטה בתנועה.

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד

גלה סרטונים נוספים