השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic
19 בפברואר 2017
עיצבנו מנגנון culturing רציפה לשימוש עם מערכות optogenetic להאיר תרבויות של חיידקים ותאים תמונה בקביעות הקולחים עם מיקרוסקופ הפוכה. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך תגובות דינמיות תאורה ניתן למדוד על פני כמה ימים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להרכיב כלי תרבית רציף, שבו ניתן למדוד את התגובה להארה של חיידקים אופטוגנטיים במיקרוסקופ באופן אוטומטי בזמן אמת ולאורך מספר ימים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה תאית ובהנדסה מטבולית, כגון כיצד ביטוי גנים דינמי יכול לעורר תגובות השונות מביטוי גנים סטטי. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שתרבית רציפה מאפשרת לאסוף מדידות במשך מספר ימים.
כדי להתחיל, הלחמו את קו הקרקע, קו הנתונים וקו המתח החיובי של המדחום הדיגיטלי ללוח המעגלים המודפסים. גזור סיכה אחת מראש נקבה עם שלושה פינים וחתוך את שני הפינים הנותרים. הלחמו זאת בצמד החורים המסומנים R2, וחברו את שני הפינים המולחמים על ידי הכנסת נגד של 4.7 קילו אוהם בכותרת הפין.
לאחר מכן, חבר את שאר הרכיבים ללוח המעגלים. שכב את המעגל על בקר המיקרו. הגדר את המארז חסין האור והתקן את כל התוכנות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
ראשית, הנח את הקצה הארוך של יציאת האלומיניום דרך האטם לתוך כלי התרבות והברג את המכסה. כסה שקע יציאת אלומיניום קצר אחד בצינורות סיליקון בקוטר בינוני. חבר את קצה הזיקוק על ידי הכנסת מנעול לואר נקבה, ולאחר מכן חיבור תקע נעילת לואר זכר.
שקע זה הוא משלים ולא ייעשה בו שימוש. חבר שני מקטעים קצרים של צינורות סיליקון בקוטר בינוני עם מנעולי לואר זכר ונקבה. לאחר מכן חבר קצה אחד לשקע יציאת אלומיניום קצר, וחבר את קצה הזיקוק.
הכלי יחוסן דרך צינור זה. לאחר מכן, חבר שני צינורות בינוניים לקצות הצינורות והמחברים הפריסטלטיים בקוטר בינוני. חבר קצה אחד ליציאת אלומיניום קצרה, וחבר את השני.
מאוחר יותר, זה יחובר לבקבוק המדיה. חבר צינור סיליקון בקוטר בינוני ליציאת האלומיניום הארוכה ביותר. הצינור צריך להיות ארוך מספיק כדי להגיע לבקבוק המדיה.
חבר קטע קצר נוסף באורך של כמה סנטימטרים עד הסוף, ולאחר מכן הכנס אותו לפקק הגומי בבקבוק המדיה. מהדק את הצינור. כאשר משחררים אותו מאוחר יותר, חיבור זה מאפשר לערבב את התרבית, לאוורר אותה ולשמור עליה בלחץ חיובי על ידי הבועות הנכנסות.
הכנס צינור בקוטר בינוני ארוך מספיק כדי להגיע לתחתית הבקבוק לפקק שדרכו תועבר המדיה. חבר צינור נוסף בקוטר בינוני לצינור זה, ואז צינור בקוטר רחב בקצה. חבר את קצה הזיקוק.
מלאו את החור השלישי בפקק בקטע קצר של צינורות בקוטר בינוני, המחובר לשני מקטעים אחרים של צינורות בקוטר בינוני, ומחובר בקצה הזיקוק. זה יחובר למשאבת ואקום, ובהמשך למשאבת אקווריום. הכנס מנעול לואר זכר לקטע של צינורות סיליקון בקוטר צר ולאחר מכן הכנס היטב צינורות PTFE.
לאחר מכן חבר מנעול לואר נקבה לצינור בקוטר בינוני. השחילו את המנעול הנשי לאורך צינור ה-PTFE כדי לחבר את המנעולים ואת השני ליציאת אלומיניום קצרה. ודא שצינור ה-PTFE בתוך כלי התרבות משתלשל מתחת לצינור האלומיניום השני הארוך ביותר, ומעל התחתית.
יש לקצץ לפי הצורך. המדיה תדגום מכאן לערוץ ההדמיה, והצינור הצר ממזער את נפח הביניים. לאחר מכן, חבר את צינור הסיליקון הצר החשוף לצינור הפריסטלטי הצר ולמחברים.
לכך חבר שלושה מקטעים של צינורות בקוטר צר ושני מקטעים של צינורות PTFE, לסירוגין. חבר את זה לבקבוק הקולחין, באמצעות צינורות בקוטר בינוני. לאחר מכן חבר קצה אחד של צינור סיליקון בקוטר בינוני לצינור השני הארוך ביותר של יציאת האלומיניום בקצה השני של בקבוק הקולחין.
צינור אלומיניום זה קובע את נפח התרבות, ועודף תרבית עולה על גדותיו לתוך מיכל הקולחין. עטפו את מכסי הבקבוק בנייר אלומיניום, ולאחר מכן חיטוי את המכלול למשך 30 דקות בחום של 121 מעלות צלזיוס ו -15 PSI. חבר את מסנן הוואקום לבקבוק של 100 מיליליטר.
הסר את מכסה הפטמה ולאחר מכן הסר את התקע הלבן מהפטמה של מסנן הוואקום בעזרת פינצטה סטרילית. חבר את צינור הסיליקון הרחב לפטמה, את הצינור החופשי השני של בקבוק המדיה למשאבת ואקום, וודא שהצינור השלישי המחבר את בקבוק המדיה לכלי התרבות סגור היטב. מלאו את המסנן במדיה, הפעילו את משאבת הוואקום ולאחר מכן סננו את שאר המדיה.
מהדק את צינור הסיליקון הבינוני המחובר לוואקום וכבה את משאבת הוואקום. הסר את הפתיונות מקטע הביניים של צינורות סיליקון בינוניים המחוברים למשאבת הוואקום והכנס את הקצה הכחול של מסנן אוויר מזרק סטרילי לתוך צינור זה. לאחר מכן מהדק את צינור הסיליקון הרחב ונתק ממנו את הפיתוי הגברי.
נתק את התקע מהלואר הנקבי של צינור כניסת המדיה של כלי הטיפוח. חבר את הלוהרים הללו כדי לאפשר שאיבת מדיה לתוך כלי הגידול. לאחר מכן, הסר את המסנן מבקבוק 100 מיליליטר והצמד את מכסה הבקבוק.
השתמש במדיה זו כדי להכין תרבית מתחילים. הגדר את מכלול התרבות הרציפה ליד מיקרוסקופ כאשר בקבוק המדיה גבוה מכלי הטיפוח, ובקבוק הקולחין נמוך מכלי התרבות כדי למנוע זרימה חוזרת. הדביקו היטב את פקקי הגומי על המדיה וצלוחיות הקולחין.
לאחר מכן, נתק את קצות צינור ה-PTFE מצינור הסיליקון הצר המחבר ביניהם וחבר את הקצוות הללו לכניסה ויציאה של מכשיר מיקרו-נוזלי מוכן. לאחר מכן דחף מדיה לתוך כלי הגידול, על ידי חיבור הקצה הלבן של מסנן האוויר המזרק למשאבת האקווריום. כאשר המדיה מגיעה לרמת יציאת הקולחין עוטפים את צינורות כניסת המדיה הבינונית והמחברים סביב המשאבה הפריסטלטית האיטית, ואת צינורות יציאת הדגימה הצרים והמחברים סביב המשאבה הפריסטלטית המהירה.
אוורר את המדיה על ידי שחרור צינור האוויר בין בקבוק המדיה לכלי התרבית. לאחר מכן, הדביקו את כרית החימום והמדחום לכלי הגידול כך שניתן יהיה לשלוט בטמפרטורה שלו. סליל את צינורות המדיה סביב כלי התרבות, כך שהמדיה הנכנסת תהיה באותה טמפרטורה כמו הכלי.
לאחר מכן הכנס את כלי הטיפוח לתוך מארז הקצף השחור מעל מטריצת ה-LED וודא שהצינורות אינם צבועים. השתמש בתוסף בקר הביוריאקטור כדי להפעיל את משאבת המדיה האיטית למשך עשירית מכל מרווח של 30 שניות. קצב הזרימה יהיה נמוך מאוד, אך גדול מקצב האידוי.
מהדק את צינור האוויר הנכנס בין בקבוק המדיה לכלי התרבות. השתמש בפיפטה כדי לחסן את כלי התרבות במיליליטר אחד מתרבית מתנע. לאחר מכן מהדקים את הקצה המזוקק של צינור זה, ושחררו את צינור האוויר.
תנו לתרבות לצמוח בן לילה. כסו את המארז כך שלא ייכנס אור. למחרת, השתמש בתוסף בקר הביוריאקטור כדי להגדיר את המשאבות הפריסטלטיות להסתובב לחלק גדול יותר של זמן, המתאים למדיה הרצויה ולקצב זרימת הדגימה.
תנו לצפיפות התרבות להתאזן בן לילה. למחרת מלאו את רשימת עמדות הבמה ואת מנהל המיקרו בקבוצה של עמדות לא חופפות בהן תאים שנשאבו לתוך התעלה המיקרופלואידית יהיו במישור המוקד. לאחר מכן פתח את תוסף בקר הכור הביולוגי.
בחר את מסלול הזמן הרצוי של מטריצת LED, ערוצי הדמיה והגדרות ניסיוניות אחרות מההנחיות, ולאחר מכן התחל לאסוף נתונים. מכשיר זה שימש לגירוי תרבית של saccharomyces cerevisiae, המבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב בתגובה לאור כחול באמצעות מערכת שעתוק אופטוגנטית הניתנת להשראה. נרכשו ניגודיות בסיס ותמונות פלואורסצנטיות של התעלה המיקרופלואידית.
קווי המתאר של התאים זוהו מתמונות ניגודיות הפאזה, מופו לתמונות הפלואורסצנטיות, והתמונות הפלואורסצנטיות תועדו בזמן אמת. מפת החום כאן מציגה את התפלגות הקרינה של תרבית עקב ייצור חלבון פלואורסצנטי צהוב עם הפעלת המערכת האופטוגנטית. הקרינה של כ-170,000 תאים נותחה מלמעלה מ-30,000 תמונות, שנרכשו מ-28 מיקומי שלב במשך 70 שעות.
במהלך מחקר זה, התרבית נחשפה לעוצמות משתנות של אור כחול במשך שש שעות, ולאחר מכן שש שעות של חושך מוחלט. תאים נחשפו לאור לפני המדידה הראשונה וזו הסיבה שעוצמת הקרינה שלו פוחתת במהלך תקופת החושך הראשונה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה שעות, במהלך שלושה ימים, אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד להשתמש בטכניקה סטרילית. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כמו בקרת משוב בזמן אמת, כדי לשלוט בריכוז החלבון. טכניקה זו תאפשר לחקור אורגניזמים בעלי מבנים אופטוגנטיים באופן דינמי, לאורך תקופות זמן ארוכות יותר, זמן רב יותר ממה שאפשרי באמצעות צלחות או תרבית אצווה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב מנגנון תרבות רציף, אור ומיקרוסקופ, כדי לעורר ולחקור חיידקים אופטוגנטיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מכשיר לגידול רצוף המיועד למערכות אופטוגנטיות, המאפשר את הקרנתן של תרבימי מיקרובים ודימוג אוטומטי של תאים לאורך מספר ימים. המערכת מאפשרת מדידה בזמן אמת של תגובות דינמיות לחשיפה לאור.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- הנדסה מטבולית
- אופטוגנטיקה
רקע
- הבנת ביטוי גנים דינמי היא קריטית בביולוגיה תאית.
- תגובות סטטיות של ביטוי גנים עשויות להיות שונות משמעותית מתגובות דינמיות.
- מערכות תרבית רציפה מאפשרות תצפית ממושכת על תגובות מיקרוביאליות.
- דימות אוטומטי משפר את יעילות איסוף הנתונים.
מטרת המחקר
- למדידת התגובה של מיקרובים אופטוגנטיים לתאורה.
- לבדיקת ההבדלים בין ביטוי גנים דינמי לסטטי.
- לפיתוח מערכת אוטומטית מלאה לתרבית ולדימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבה של כלי לתרבית רציפה.
- שילוב מד חום דיגיטלי לניטור הטמפרטורה.
- שימוש במיקרוסקופ הפוך לצורך דימוי.
- אוטומציה של תהליכי התרבית, הדגימה וניתוח התמונות.
תוצאות עיקריות
- המכשיר האיר בהצלחה את התרביות וביצע הדמיה אוטומטית של התאים.
- ניתן היה למדוד תגובות דינמיות להארה לאורך מספר ימים.
- הנתונים שנאספו סיפקו תובנות לגבי דינמיקה של ביטוי גנים.
- השיטה הדגימה יתרונות בחקר התנהגות מיקרוביאלית.
מסקנות
- מערכת הגידול הרציף יעילה למחקרים בזמן אמת.
- מערכות אוטומטיות יכולות לשפר את המחקר בביולוגיה של התא.
- שיטה זו פותחת נתיבים חדשים לחקר הנדסה מטבולית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
מערכת גידול אוטומטית זו מאפשרת ניטור ממושך ובזמן אמת של תגובות מיקרוביאליות אופטוגנטיות, ובכך היא נותנת מענה לאתגר מרכזי בהנדסה מטבולית: קישור בין ביטוי גנים דינמי לתוצאות פנוטיפיות לאורך תקופות זמן ממושכות. באמצעות שילוב של תאורה הניתנה לתכנות עם תרבית רציפה ודימיון (imaging) אוטומטי, הפלטפורמה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מבנים של ביולוגיה סינתטית לפני שלב ההגדלה (scale-up). היכולת לכמת פלואורסצנציה ומורפולוגיה באלפי תאים לאורך מספר ימים מגבירה את הביטחון החזוי בביצועי הזן תחת תנאים בעלי רלוונטיות תעשייתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור השראה אופטוגנטית לייצור חלבון דינמי בשמרים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מעקב פלורסצנציה כמותי ובזמן אמת אחרי דינמיקת ביטוי של גנים.
- ערך ניבוי: מודד כיצד דפוסים זמניים של הארה משפיעים על התוצר התאי, ובכך מספק מידע למידול תגובה למינון עבור מערכות הניתנות להשראה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות מיקרוביאליות עובדות לבדיקה ראשונית (screening) באמצעות ייצוב תנאי התרבית בפורמט של כימסטט (chemostat).
- פלט כמותי: מייצר נתוני פלואורסצנציה ומורפולוגיה סטנדרטיים עם רזולוציית זמן מדגימות של הש outflow (effluent) לצורך אופטימיזציה של הבדיקה.
- יכולת הרחבה: דגימה ודימוג אוטומטיים מאפשרים איסוף נתונים ברזולוציה גבוהה (high-content) ובצורה הדירה תחת תנאים מרובים ללא התערבות ידנית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש ב-Saccharomyces cerevisiae כמערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר מסלולי איתות אוקריוטיים שמורים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית באמצעות אספקת נתונים פנוטיפיים דינמיים, שאינם נגישים בבדיקות מבוססות פלטות או באצוות (batch assays).
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר כיצד ביטוי גנים דינמי לעומת סטטי משפיע על העומס המטבולי ועל תנובת המוצר, ובכך מפחית את חוסר הוודאות בבחירת הזן.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
המערכת משתלבת ברצף הפעולות מהגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, ותומכת בבדיקת השערות בשלבי הגילוי המוקדמים, בהכנת בדיקות (assays) לסריקה, ובתיקוף פנוטיפי במחקר תרגומי, וזאת באמצעות לכידת נתונים אורכיים בזמן אמת.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת להבהרה של מסלולים ביולוגיים על ידי קישור גרייה אופטוגנטית לשינויים זמניים בביטוי גנים ובמורפולוגיה תאית.
- סריקה: מבטיחה שחזור של הבדיקה באמצעות דגימה אוטומטית של תסריף ודימות סטנדרטי של תאים בערוצים מיקרופלואידיים.
- אנליזה: מאפשרת השוואה בין תנאים באמצעות מדידות כמותיות של עוצמת פלואורסצנציה מתוך למעלה מ-30,000 תמונות לאורך 70 שעות.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמת סממנים ביולוגיים על ידי קורלציה בין השראה אופטוגנטית לשינויים מדידים בביטוי YFP כמדד לפעילות המסלול.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקת מבנים אופטוגנטיים, פרומוטורים או מסלולים מטבוליים שונים תחת תנאים דינמיים מבוקרים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באופן שבו גירויים דינמיים משפיעים על מפעלים תאיים מיקרוביאליים.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות לחלוטין של גידול, דגימה וניתוח תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשכה או הפסקה (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של זנים עם פרופילי תגובה דינמיים מיטביים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהתקדמות מותאמת סיכונים על ידי אספקת נתונים אורכיים החוזים טוב יותר את הביצועים בתנאי תסיסה תעשייתית או בשיטת fed-batch.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול מיקרוביאלי, אופטוגנטיקה ושילוב מיקרופלואידיקה.
- נדרשת ציוד הכולל משאבות פריסטלטיות, מטריצת LED, מיקרוסקופ ותוכנה לבקרת ביו-ראקטור.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים להגדרה עקבית של משטרי חשיפה לאור ומרווחי דגימה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום המערכת על מאחים מיקרוביאליים שונים או כלים אופטוגנטיים שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בטכניקה סטרילית ותכנון קפדני של סידורי הצנרת כדי למנוע זיהום או זרימה לאחור.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:41
Electronics Setup and LED Calibration
1:23
Prepare the Culturing Vessel
2:25
Prepare the Media Flask
5:01
Media Flask Filling
6:16
Apparatus Assembly at the Microscope
7:55
Culture Vessel Inoculation and Microbe Imaging
9:05
Results: Optogenetic Activation of S. cerevisiae
3:30
Prepare the Effluent Flask
10:19
Conclusion
