השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic
February 19th, 2017
עיצבנו מנגנון culturing רציפה לשימוש עם מערכות optogenetic להאיר תרבויות של חיידקים ותאים תמונה בקביעות הקולחים עם מיקרוסקופ הפוכה. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך תגובות דינמיות תאורה ניתן למדוד על פני כמה ימים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להרכיב כלי תרבית רציף, שבו ניתן למדוד את התגובה להארה של חיידקים אופטוגנטיים במיקרוסקופ באופן אוטומטי בזמן אמת ולאורך מספר ימים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה תאית ובהנדסה מטבולית, כגון כיצד ביטוי גנים דינמי יכול לעורר תגובות השונות מביטוי גנים סטטי. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שתרבית רציפה מאפשרת לאסוף מדידות במשך מספר ימים.
כדי להתחיל, הלחמו את קו הקרקע, קו הנתונים וקו המתח החיובי של המדחום הדיגיטלי ללוח המעגלים המודפסים. גזור סיכה אחת מראש נקבה עם שלושה פינים וחתוך את שני הפינים הנותרים. הלחמו זאת בצמד החורים המסומנים R2, וחברו את שני הפינים המולחמים על ידי הכנסת נגד של 4.7 קילו אוהם בכותרת הפין.
לאחר מכן, חבר את שאר הרכיבים ללוח המעגלים. שכב את המעגל על בקר המיקרו. הגדר את המארז חסין האור והתקן את כל התוכנות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
ראשית, הנח את הקצה הארוך של יציאת האלומיניום דרך האטם לתוך כלי התרבות והברג את המכסה. כסה שקע יציאת אלומיניום קצר אחד בצינורות סיליקון בקוטר בינוני. חבר את קצה הזיקוק על ידי הכנסת מנעול לואר נקבה, ולאחר מכן חיבור תקע נעילת לואר זכר.
שקע זה הוא משלים ולא ייעשה בו שימוש. חבר שני מקטעים קצרים של צינורות סיליקון בקוטר בינוני עם מנעולי לואר זכר ונקבה. לאחר מכן חבר קצה אחד לשקע יציאת אלומיניום קצר, וחבר את קצה הזיקוק.
הכלי יחוסן דרך צינור זה. לאחר מכן, חבר שני צינורות בינוניים לקצות הצינורות והמחברים הפריסטלטיים בקוטר בינוני. חבר קצה אחד ליציאת אלומיניום קצרה, וחבר את השני.
מאוחר יותר, זה יחובר לבקבוק המדיה. חבר צינור סיליקון בקוטר בינוני ליציאת האלומיניום הארוכה ביותר. הצינור צריך להיות ארוך מספיק כדי להגיע לבקבוק המדיה.
חבר קטע קצר נוסף באורך של כמה סנטימטרים עד הסוף, ולאחר מכן הכנס אותו לפקק הגומי בבקבוק המדיה. מהדק את הצינור. כאשר משחררים אותו מאוחר יותר, חיבור זה מאפשר לערבב את התרבית, לאוורר אותה ולשמור עליה בלחץ חיובי על ידי הבועות הנכנסות.
הכנס צינור בקוטר בינוני ארוך מספיק כדי להגיע לתחתית הבקבוק לפקק שדרכו תועבר המדיה. חבר צינור נוסף בקוטר בינוני לצינור זה, ואז צינור בקוטר רחב בקצה. חבר את קצה הזיקוק.
מלאו את החור השלישי בפקק בקטע קצר של צינורות בקוטר בינוני, המחובר לשני מקטעים אחרים של צינורות בקוטר בינוני, ומחובר בקצה הזיקוק. זה יחובר למשאבת ואקום, ובהמשך למשאבת אקווריום. הכנס מנעול לואר זכר לקטע של צינורות סיליקון בקוטר צר ולאחר מכן הכנס היטב צינורות PTFE.
לאחר מכן חבר מנעול לואר נקבה לצינור בקוטר בינוני. השחילו את המנעול הנשי לאורך צינור ה-PTFE כדי לחבר את המנעולים ואת השני ליציאת אלומיניום קצרה. ודא שצינור ה-PTFE בתוך כלי התרבות משתלשל מתחת לצינור האלומיניום השני הארוך ביותר, ומעל התחתית.
יש לקצץ לפי הצורך. המדיה תדגום מכאן לערוץ ההדמיה, והצינור הצר ממזער את נפח הביניים. לאחר מכן, חבר את צינור הסיליקון הצר החשוף לצינור הפריסטלטי הצר ולמחברים.
לכך חבר שלושה מקטעים של צינורות בקוטר צר ושני מקטעים של צינורות PTFE, לסירוגין. חבר את זה לבקבוק הקולחין, באמצעות צינורות בקוטר בינוני. לאחר מכן חבר קצה אחד של צינור סיליקון בקוטר בינוני לצינור השני הארוך ביותר של יציאת האלומיניום בקצה השני של בקבוק הקולחין.
צינור אלומיניום זה קובע את נפח התרבות, ועודף תרבית עולה על גדותיו לתוך מיכל הקולחין. עטפו את מכסי הבקבוק בנייר אלומיניום, ולאחר מכן חיטוי את המכלול למשך 30 דקות בחום של 121 מעלות צלזיוס ו -15 PSI. חבר את מסנן הוואקום לבקבוק של 100 מיליליטר.
הסר את מכסה הפטמה ולאחר מכן הסר את התקע הלבן מהפטמה של מסנן הוואקום בעזרת פינצטה סטרילית. חבר את צינור הסיליקון הרחב לפטמה, את הצינור החופשי השני של בקבוק המדיה למשאבת ואקום, וודא שהצינור השלישי המחבר את בקבוק המדיה לכלי התרבות סגור היטב. מלאו את המסנן במדיה, הפעילו את משאבת הוואקום ולאחר מכן סננו את שאר המדיה.
מהדק את צינור הסיליקון הבינוני המחובר לוואקום וכבה את משאבת הוואקום. הסר את הפתיונות מקטע הביניים של צינורות סיליקון בינוניים המחוברים למשאבת הוואקום והכנס את הקצה הכחול של מסנן אוויר מזרק סטרילי לתוך צינור זה. לאחר מכן מהדק את צינור הסיליקון הרחב ונתק ממנו את הפיתוי הגברי.
נתק את התקע מהלואר הנקבי של צינור כניסת המדיה של כלי הטיפוח. חבר את הלוהרים הללו כדי לאפשר שאיבת מדיה לתוך כלי הגידול. לאחר מכן, הסר את המסנן מבקבוק 100 מיליליטר והצמד את מכסה הבקבוק.
השתמש במדיה זו כדי להכין תרבית מתחילים. הגדר את מכלול התרבות הרציפה ליד מיקרוסקופ כאשר בקבוק המדיה גבוה מכלי הטיפוח, ובקבוק הקולחין נמוך מכלי התרבות כדי למנוע זרימה חוזרת. הדביקו היטב את פקקי הגומי על המדיה וצלוחיות הקולחין.
לאחר מכן, נתק את קצות צינור ה-PTFE מצינור הסיליקון הצר המחבר ביניהם וחבר את הקצוות הללו לכניסה ויציאה של מכשיר מיקרו-נוזלי מוכן. לאחר מכן דחף מדיה לתוך כלי הגידול, על ידי חיבור הקצה הלבן של מסנן האוויר המזרק למשאבת האקווריום. כאשר המדיה מגיעה לרמת יציאת הקולחין עוטפים את צינורות כניסת המדיה הבינונית והמחברים סביב המשאבה הפריסטלטית האיטית, ואת צינורות יציאת הדגימה הצרים והמחברים סביב המשאבה הפריסטלטית המהירה.
אוורר את המדיה על ידי שחרור צינור האוויר בין בקבוק המדיה לכלי התרבית. לאחר מכן, הדביקו את כרית החימום והמדחום לכלי הגידול כך שניתן יהיה לשלוט בטמפרטורה שלו. סליל את צינורות המדיה סביב כלי התרבות, כך שהמדיה הנכנסת תהיה באותה טמפרטורה כמו הכלי.
לאחר מכן הכנס את כלי הטיפוח לתוך מארז הקצף השחור מעל מטריצת ה-LED וודא שהצינורות אינם צבועים. השתמש בתוסף בקר הביוריאקטור כדי להפעיל את משאבת המדיה האיטית למשך עשירית מכל מרווח של 30 שניות. קצב הזרימה יהיה נמוך מאוד, אך גדול מקצב האידוי.
מהדק את צינור האוויר הנכנס בין בקבוק המדיה לכלי התרבות. השתמש בפיפטה כדי לחסן את כלי התרבות במיליליטר אחד מתרבית מתנע. לאחר מכן מהדקים את הקצה המזוקק של צינור זה, ושחררו את צינור האוויר.
תנו לתרבות לצמוח בן לילה. כסו את המארז כך שלא ייכנס אור. למחרת, השתמש בתוסף בקר הביוריאקטור כדי להגדיר את המשאבות הפריסטלטיות להסתובב לחלק גדול יותר של זמן, המתאים למדיה הרצויה ולקצב זרימת הדגימה.
תנו לצפיפות התרבות להתאזן בן לילה. למחרת מלאו את רשימת עמדות הבמה ואת מנהל המיקרו בקבוצה של עמדות לא חופפות בהן תאים שנשאבו לתוך התעלה המיקרופלואידית יהיו במישור המוקד. לאחר מכן פתח את תוסף בקר הכור הביולוגי.
בחר את מסלול הזמן הרצוי של מטריצת LED, ערוצי הדמיה והגדרות ניסיוניות אחרות מההנחיות, ולאחר מכן התחל לאסוף נתונים. מכשיר זה שימש לגירוי תרבית של saccharomyces cerevisiae, המבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב בתגובה לאור כחול באמצעות מערכת שעתוק אופטוגנטית הניתנת להשראה. נרכשו ניגודיות בסיס ותמונות פלואורסצנטיות של התעלה המיקרופלואידית.
קווי המתאר של התאים זוהו מתמונות ניגודיות הפאזה, מופו לתמונות הפלואורסצנטיות, והתמונות הפלואורסצנטיות תועדו בזמן אמת. מפת החום כאן מציגה את התפלגות הקרינה של תרבית עקב ייצור חלבון פלואורסצנטי צהוב עם הפעלת המערכת האופטוגנטית. הקרינה של כ-170,000 תאים נותחה מלמעלה מ-30,000 תמונות, שנרכשו מ-28 מיקומי שלב במשך 70 שעות.
במהלך מחקר זה, התרבית נחשפה לעוצמות משתנות של אור כחול במשך שש שעות, ולאחר מכן שש שעות של חושך מוחלט. תאים נחשפו לאור לפני המדידה הראשונה וזו הסיבה שעוצמת הקרינה שלו פוחתת במהלך תקופת החושך הראשונה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה שעות, במהלך שלושה ימים, אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד להשתמש בטכניקה סטרילית. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כמו בקרת משוב בזמן אמת, כדי לשלוט בריכוז החלבון. טכניקה זו תאפשר לחקור אורגניזמים בעלי מבנים אופטוגנטיים באופן דינמי, לאורך תקופות זמן ארוכות יותר, זמן רב יותר ממה שאפשרי באמצעות צלחות או תרבית אצווה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב מנגנון תרבות רציף, אור ומיקרוסקופ, כדי לעורר ולחקור חיידקים אופטוגנטיים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מציג מנגנון תרבית רציף שתוכנן עבור מערכות אופטוגנטיות, המאפשר הארה של תרביות מיקרוביאליות והדמיה אוטומטית של תאים לאורך מספר ימים. המערכת מאפשרת מדידה בזמן אמת של תגובות דינמיות לחשיפה לאור.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- הנדסה מטבולית
- אופטוגנטיקה
רקע
- הבנת הביטוי הגנטי הדינמי היא חיונית בביולוגיה תאית.
- תגובות ביטוי גנים סטטיות יכולות להיות שונות מאוד מתגובות דינמיות.
- מערכות תרבית רציפות מאפשרות התבוננות ממושכת בתגובות מיקרוביאליות.
- הדמיה אוטומטית משפרת את היעילות של איסוף נתונים.
מטרת המחקר
- למדוד את תגובת המיקרובים האופטוגנטיים להארה.
- לחקור את ההבדלים בין ביטוי גנים דינמי וסטטי.
- לפתח מערכת אוטומטית לחלוטין לתרבית והדמיה.
שיטות ששימשו
- הרכבת כלי תרבית רציף.
- שילוב מדחום דיגיטלי לניטור טמפרטורה.
- שימוש במיקרוסקופ הפוך להדמיה.
- אוטומציה של תהליכי תרבית, דגימה וניתוח תמונות.
תוצאות עיקריות
- המנגנון הצליח להאיר תרביות ולדמות תאים באופן אוטומטי.
- תגובות דינמיות להארה ניתן היה למדוד לאורך מספר ימים.
- הנתונים שנאספו סיפקו תובנות לגבי דינמיקת הביטוי הגנטי.
- השיטה הפגינה יתרונות בחקר התנהגות מיקרוביאלית.
מסקנות
- מנגנון התרבית הרציף יעיל למחקרים בזמן אמת.
- מערכות אוטומטיות יכולות לשפר את המחקר בביולוגיה תאית.
- השיטה פותחת דרכים חדשות לחקר הנדסה מטבולית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This automated culturing system enables prolonged, real-time monitoring of optogenetic microbial responses, addressing a key challenge in metabolic engineering: linking dynamic gene expression to phenotypic outcomes over extended periods. By integrating programmable illumination with continuous culture and automated imaging, the platform supports mechanistic de-risking of synthetic biology constructs before scale-up. The ability to quantify fluorescence and morphology across thousands of cells over multiple days enhances predictive confidence in strain performance under industrially relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking optogenetic induction to dynamic protein production in yeast.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time, quantitative fluorescence tracking of gene expression dynamics.
- Predictive Value: Measures how temporal patterns of illumination affect cellular output, informing dose-response modeling for inducible systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated microbial systems for downstream screening by stabilizing culture conditions in a chemostat format.
- Quantitative Output: Generates standardized, time-resolved fluorescence and morphology data from effluent sampling for assay optimization.
- Scalability: Automated sampling and imaging enable high-content, reproducible data collection across multiple conditions without manual intervention.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses Saccharomyces cerevisiae as a disease-relevant system for studying conserved eukaryotic signaling pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing dynamic phenotypic data not accessible in batch or plate-based assays.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how dynamic versus static gene expression influences metabolic burden and product yield, reducing uncertainty in strain selection.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and phenotypic validation in translational research through real-time, longitudinal data capture.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking optogenetic stimulation to temporal changes in gene expression and cellular morphology.
- Screening: Ensures assay reproducibility through automated effluent sampling and standardized imaging of cells in microfluidic channels.
- Analytics: Enables comparison of conditions via quantitative fluorescence intensity measurements from over 30,000 images across 70 hours.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by correlating optogenetic induction with measurable changes in YFP expression as a proxy for pathway activity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for testing various optogenetic constructs, promoters, or metabolic pathways under controlled dynamic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how dynamic stimuli affect microbial cell factories.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through fully automated culturing, sampling, and image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early identification of strains with favorable dynamic response profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing longitudinal data that better predict performance in fed-batch or industrial fermentation settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culturing, optogenetics, and microfluidic integration.
- Needs instrumentation including peristaltic pumps, LED matrix, microscope, and bioreactor control software.
- Demands cross-team standardization for consistent setup of light exposure regimes and sampling intervals.
- Involves adaptation considerations when applying the system to different microbial hosts or optogenetic tools.
- Includes practical limitations such as the need for sterile technique and careful tubing configuration to prevent contamination or backflow.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:41
Electronics Setup and LED Calibration
1:23
Prepare the Culturing Vessel
2:25
Prepare the Media Flask
5:01
Media Flask Filling
6:16
Apparatus Assembly at the Microscope
7:55
Culture Vessel Inoculation and Microbe Imaging
9:05
Results: Optogenetic Activation of S. cerevisiae
3:30
Prepare the Effluent Flask
10:19
Conclusion
