בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

המטרה הכוללת של פרוטוקול התמיינות עצבית זה היא ליצור רשתות עצביות מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם הגדלים על מערכי מיקרואלקטרודות בצורה מהירה ומבוקרת. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחומי מדעי המוח. ניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנונים ביולוגיים העומדים בבסיס הפרעות נוירולוגיות, אך ניתן להשתמש בו גם כדי לטפל בשאלות נוירוביולוגיות בסיסיות יותר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא התמיינות מהירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לתאי עצב בצורה מבוקרת. ביום הראשון, יש לחמם DMEM/F12, CDS ו-E8 בינוני עם 1% סטרפטומיצין פניצילין לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף דוקסיציקלין למדיום E8 כדי ליצור ריכוז סופי של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר ולאחר מכן הוסף מעכב סלעים לתערובת.

שאפו את המדיום המושקע של RTTANGN2 ה-hiPSCs החיוביים והוסיפו CDS מיליליטר אחד לתאים. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך שלוש עד חמש דקות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס. תחת המיקרוסקופ, בדוק אם התאים מתנתקים זה מזה.

לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר DMEM/F12 לבאר. תלו בעדינות את התאים בעזרת פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, והעבירו אותם לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שבעה מיליליטר של DMEM/F12 לתרחיף התאים, וסובב את התאים ב-200 x g למשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, שאפו את הסופרנטנט והוסיפו שני מיליליטר ממדיום ה- E8 המוכן. נתק את ה-hiPSCs על ידי הנחת קצה של פיפטה של 1,000 מיקרוליטר לצד הצינור של 15 מיליליטר והשעיית התאים בעדינות. תחת המיקרוסקופ, בדוק אם התאים מנותקים.

לאחר מכן, קבע את מספר התאים למיליליטר באמצעות המוציטומטר. עבור שש הבארות MEAs, יש לדלל את התאים כדי לקבל תרחיף תאים של 7.5 כפול 10 עד החמישי תאים למיליליטר. עבור החלקות הכיסוי, יש לדלל את התאים לקבלת תרחיף תאים של ארבע פעמים 10 לתאים הרביעיים למיליליטר.

שאפו את הלמינין המדולל מהחלקות הכיסוי וששת הבאר MEAs. עבור שש הבארות MEAs, צלחת התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לאזור האלקטרודה הפעילה בכל באר. לאחר מכן צלחת את התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת 24 הבארות.

לאחר מכן, הניחו את ששת ה-MEAs או את צלחת 24 הבארות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, הוסף בזהירות 500 מיקרוליטר ממדיום E8 המוכן לכל באר משש הבאר MEAs. לאחר מכן, הנח את ששת הבאר MEAs למשך הלילה באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס.

ביום השלישי, יש לחמם 0.05% טריפסין-EDTA לטמפרטורת החדר. DPBS חם ו-DMEM/F12 עם 1% פטרפטומיצין פניצילין עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את המדיום המושקע של תרבות אסטרוציטים של חולדות.

שטפו את התרבית על ידי הוספת חמישה מיליליטר DPBS וסובבו אותה בעדינות. לאחר מכן, שאפו DPBS והוסיפו חמישה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA. סובב את הטריפסין-EDTA בעדינות.

לאחר מכן דגרו את התאים באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לבחון אם התאים מנותקים. נתק את התאים האחרונים על ידי פגיעה בבקבוק מספר פעמים.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של DMEM/F12 לבקבוק. נסה לדרג את התאים בעדינות בתוך הבקבוק בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר. לאחר מכן, אסוף את תרחיף התאים בצינור של 15 מיליליטר.

סובב את הצינור ב -200 x גרם למשך שמונה דקות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של DMEM/F12. קבע את מספר התאים למיליליטר באמצעות המוציטומטר.

לאחר מכן, הוסיפו 7.5 כפול 10 לאסטרוציטים הרביעיים לכל באר מתוך שש הבארות MEAs. והוסף פעמיים כפול 10 לאסטרוציטים הרביעיים לכל באר של צלחת 24 הבארות. דגרו את התאים למשך הלילה באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס.

רכוש את הנתונים בהגברה של פי 1, 200 ודגום את האות ב-10 קילו-הרץ באמצעות כרטיס רכישת הנתונים MCS. רשום 20 דקות של פעילות אלקטרופיזיולוגית של נוירונים שמקורם ב-hiPSC שגודלו ב-MEAs. במהלך ההקלטה, שמור על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, ומנע אידוי בינוני ושינויי pH על ידי אספקת זרימה איטית קבועה של גז לח ל-MEAs.

לאחר מכן, נתח את הנתונים באמצעות חבילת תוכנה מותאמת אישית. איור זה מציג את שינויי הביטוי של סמנים עצביים MAP2 בסינפסין במהלך תהליך ההתמיינות, המעיד על התבגרות עצבית. גרף זה מראה כי ביטוי סינפסין נמדד עבור תאים בודדים שגדלו במהלך תהליך ההתמיינות.

הסינפסין המתבטא בתאים לאחר שלושה שבועות של התמיינות התמקם במשותף עם PSD-95, מה שמעיד על נוכחות של סינפסות תפקודיות. כאן, מהדק תיקון תא שלם בוצע בנקודות זמן שונות במהלך תהליך ההתמיינות כדי למדוד את הפעילות האלקטרופיזיולוגית של התאים. התאים הצליחו לייצר פוטנציאל פעולה בנקודות הזמן השונות.

ואחוז התאים המזנקים שגדל עם הזמן מראה שרוב התאים מסוגלים לייצר פוטנציאל פעולה, אפילו בשלב המוקדם של ההתמיינות. מהדק טלאי שימש גם למדידת הזרמים הפוסט-סינפטיים המעוררים שהתקבלו על ידי התאים. מספר הכניסות שהתאים מקבלים גדל במהלך תהליך ההתמיינות.

גם התדירות וגם המשרעת של הזרמים הפוסט-סינפטיים המעוררים גדלו במהלך תהליך ההתמיינות. הפעילות האלקטרופיזיולוגית של התאים המומיינים על מערכי מיקרו-אלקטרודות נמדדה במהלך תהליך ההתמיינות. כאן, פעילות הרשת העצבית גדלה במהלך תהליך ההתמיינות, והראתה אירועים סינכרוניים לאחר 23 ימים.

לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לרשתות עצביות פונקציונליות תוך שלושה עד ארבעה שבועות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד סטרילי ולטפל בתאים בעדינות. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו בדיקות פרמקולוגיות כדי להציל את הפנוטיפ, שנצפה בשורות התאים של המטופלים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור באופן רשמי פגמים בפעילות הרשת בהפרעות נוירולוגיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתמיין, לגרום לתאי גזע פלוריפוטנטיים לתאי עצב בצורה מהירה ומבוקרת.