ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל C. elegans germline

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבחון רמות ERK פעילות in vivo בבלוטות המין של C.elegans. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות ה-ERK ותאי הנבט, כגון ההשפעות של טיפולים תרופתיים או הפרעות בגנים על מסלול RAS-ERK ובכך התפתחות תאי נבט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לכמת את דפוס ועוצמת אות ה-ERK in vivo.

בחר 100 עד 150 תולעים בשלב ההתפתחותי הרצוי ואסוף אותן בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר של מאגר M9. לאחר מכן, מלאו את צינור המיקרו-צנטריפוגה ב-900 מיקרוליטר נוספים של מאגר M9 וצנטריפוגה אותו ב-1000 פעמים גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר בעדינות 900 מיקרוליטר ממאגר M9.

לאחר מכן חזור על הכביסה פעמיים נוספות כדי להסיר את רוב החיידקים המצורפים. לאחר מכן, באמצעות קצה מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר עם קדח רחב, העבירו את התולעים ב-100 מיקרוליטר של מאגר M9 לכלי שעון זכוכית תחתון שטוח. לאחר מכן, הוסיפו לתבשיל אחד עד שלושה מיקרוליטר של 0.1 Levamisole מולארי וסובבו אותו בעדינות.

כעת, חבר שתי מחטים בגודל 25 לשני מזרקים כדי ליצור כלי ניתוח אחד לכל יד. תחת מיקרוסקופ מנתח, מקם כל מחט מתחת ומעל כל תולעת ובצע חתך דק על כל תולעת ליד נורת הלוע השנייה, באמצעות תנועה דמוית מספריים. חתכו את כל בעלי החיים לפחות פעם אחת, הכל תוך חמש דקות, כדי שה-Levamisole יישאר יעיל.

חשוב מאוד שניתוח בעלי החיים במנה יושלם תוך פחות מחמש דקות. במקרה שבלוטת מין מוחצנת אינה נראית לעין, פשוט דלג על החיה הזו. בלוטות מין מוחצנות נראות כאן.

לאחר השלמת הדיסקציה, מתחת למכסה אדים מוסיפים שני מיליליטר של 3% פרפורמלדהיד ישירות לצלחת השעון מזכוכית ומכסים אותה ב-Parafilm. לאחר מכן, המתן עשר דקות. לאחר מכן, בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית בגודל 9 אינץ', הוסף שלושה מיליליטר PBS-T לזכוכית השעון וערבב את התמיסה באמצעות הפיפטה.

לאחר מכן, בעזרת פיפטת זכוכית חדשה, שאבו את חמשת המיליליטר של הנוזל המכילים את התולעים והעבירו אותם לצינור חרוטי זכוכית טרי של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור למשך 30 שניות בצנטריפוגה קלינית ב-1000 גרם. כעת, תחת מיקרוסקופ מנתח, הסירו והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לרקמות המנותחות.

לאחר מכן, בעזרת חמישה מיליליטר של PBS-T, חזור על שלב הכביסה פעמיים נוספות וסיים עם התולעים בנפח קטן של תמיסה. לאחר מכן, בעזרת פיפטת זכוכית, מוסיפים שני מיליליטר של 100% מתנול ומערבבים בעדינות את הרקמות על ידי משיכתן למעלה ולמטה עם פיפטה פסטר טרייה. כעת, דגרו את הצינור בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.

לאחר הטיפול במתנול, בצע שלוש שטיפות PBS-T וסיים עם כ-500 מיקרוליטר PBS-T. כעת, באמצעות פיפטה פסטר טרייה, העבירו את הרקמות לצינור זכוכית חדש של מיליליטר אחד ואפשרו להן להתיישב על ידי כוח הכבידה. לאחר חמש עד 10 דקות, השתמש בפיפטה טרייה ובעזרת מיקרוסקופ כדי להסיר כמה שיותר מהשטיפה מהצינור מבלי להפריע לרקמות.

כדי להתחיל את החסימה, הוסף 100 מיקרוליטר של 30% סרום עיזים רגיל, שהוא המאגר החוסם. לאחר מכן, כסו את הצינור בפרפילם ותנו לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שעה, בעזרת מיקרוסקופ, הסר כמה שיותר נוזלים בעזרת פיפטה חדשה.

לאחר מכן, הכינו 100 מיקרוליטר של נוגדן MAPKYT מדולל באחד ל-400 ב-30% NGS והוסיפו אותו לרקמות. לאחר מכן, אטמו את הצינור עם Parafilm ודגרו אותו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, מחממים את הצינורות לטמפרטורת החדר ומוסיפים 800 מיקרוליטר PBS-T.

לאחר מכן, משוך את הדגימה לתוך פיפטת זכוכית טרייה ושחרר אותם בעדינות כדי ליצור תרחיף אחיד. לאחר שהטישו התייצב לתחתית, הסר בזהירות את הסופרנטנט וחזור על השטיפה בסך הכל שלוש פעמים, תמיד באמצעות פיפטה טרייה ולעולם לא באמצעות מערבולת. הנוגדן המשני מיושם בדיוק כמו הראשוני, רק שיקול נוסף ניתן לשמור על הרקמות בחושך מכאן והלאה עד שניתן יהיה לדמות אותן.

לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני, הוסף 800 מיקרוליטר מתמיסת ה-DAPI המדוללת לרקמות לאחר הסרת הכביסה האחרונה. מכסים את פי הצינור בפרפילם ודוגרים אותו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. מאוחר יותר, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר כמה שיותר מתמיסת ה- DAPI בעזרת פיפטה חדשה.

לאחר הסרת הכתם או הכביסה האחרונה, הוסף טיפה אחת של תמיסת הרכבה לצינורות. כעת, הכינו שקופית הרכבה עם כרית אגרוז. הוסף טיפה של 2% אגרוז מומס למגלשת זכוכית נקייה והנח במהירות שקופית נקייה שנייה בניצב ומעל האגרוז.

לבסוף, הסר בעדינות רבה את שקופית המיקרוסקופ העליונה. כעת, העבירו את החיות המנותחות למשטח והוציאו את כל הנוזלים העודפים מהרפידה בעזרת מיקרוסקופ. לבסוף, יש למרוח החלקת כיסוי בגודל 24 על 50 מילימטר מבלי ליצור בועות אוויר.

לאחר החלת החלקת הכיסוי, אל תפעיל לחץ נוסף. זה גורם לעתים קרובות לאובדן אות. תמונות מייצגות של בעלי חיים הרמפרודיטיים בוגרים מסוג בר חשפו שהצורה הפעילה של ERK דיפוספורילית מוצגת בדרך כלל באזור אמצע פצ'יטן, אזור 1, ובביציות הבוגרות ביותר באזור 2.

הפרעות בדפוס הפעלה זה משקפות שינויים במסלול האיתות. קווי נבט נקביים אינם מציינים זרע ולכן אינם מציגים הפעלה של ERK באזור 2, עם הפעלה חלשה בלבד באזור 1. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להימשך יומיים לכל היותר, כאשר היום הראשון לוקח את הזמן הרב ביותר, עם שעה, אם מבוצע כראוי.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו דגי RNA כדי לכמת דברים, כגון רמת תעתיק ה-RNA, בנוסף למידע על שפע החלבון. לאחר פיתוחה בשנת 1995, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התפתחות תאי הנבט לבחון את רמות שפע החלבון in vivo ולעקוב אחר מורפולוגיה של כרומוזומים ב-C.elegans.