Name: ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל C. elegans germline (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: חקור אימונופלואורסצנציה לזיהוי ERK פעיל בגונדה של C. elegans. שיטה זו מאפשרת כימות תבניות אותות ועוצמת אותות בחיים, ומסייעת להבנת פיתוח תאי גרעין ומסלולי איתות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדת ארור נתמכת על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות, NIHGM98200; מכון המחקר למניעת סרטן בטקסס, CPRIT RP160023; פרס חוקר האגודה האמריקאית לסרטן (ACS RSG014-044-DDC); ועל ידי קרנות אנה פולר.

<ol><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410, 37-40 (2001).</li>
<li>McKay, M. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+signals+from+RTKs+to+ERK%2FMAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK.</a> Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).</li>
<li>Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSundaram%2C+MV+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-38 (2013).</li>
<li>Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+apoptosis%3A+a+dysregulated+balance+in+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer.</a> Liver Int. 27, 155-162 (2007).</li>
<li>Hackett, A., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR1+Pfeiffer+syndrome+without+craniosynostosis%3A+an+additional+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dysmorphol%22%5BJournal%5D)">FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report.</a> Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).</li>
<li>Murphy, L. O., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+specificity%3A+the+right+place+at+the+right+time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">MAPK signal specificity: the right place at the right time.</a> Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).</li>
<li>Vogels, A., Fryns, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pfeiffer+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Pfeiffer syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 1, 19(2006).</li>
<li>Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+induces+survival+and+differentiation+through+two+distinct+signaling+cascades+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells.</a> Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).</li>
<li>Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling%3A+transient+versus+sustained+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation.</a> Cell. 80, 179-185 (1995).</li>
<li>Chang, C., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+vulval+development+as+a+model+system+to+study+the+cancer+biology+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling.</a> Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).</li>
<li>Lee, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+functions+and+dynamic+activation+of+MPK-1+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development.</a> Genetics. 177, 2039-2062 (2007).</li>
<li>Lopez, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAF-2+and+ERK+couple+nutrient+availability+to+meiotic+progression+during+Caenorhabditis+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis.</a> Dev Cell. 27, 227-240 (2013).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sperm+cytoskeletal+protein+that+signals+oocyte+meiotic+maturation+and+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation.</a> Science. 291, 2144-2147 (2001).</li>
<li>Ohmachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+ksr-1+and+ksr-2+have+both+unique+and+redundant+functions+and+are+required+for+MPK-1+ERK+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation.</a> Curr Biol. 12, 427-433 (2002).</li>
<li>Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+genes+of+the+MAP+kinase+cascade%2C+mek-2%2C+mpk-1%2Fsur-1+and+let-60+ras%2C+are+required+for+meiotic+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 121, 2525-2535 (1995).</li>
<li>Hubbard, E. J., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+a+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).</li>
<li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPK-1+ERK+controls+membrane+organization+in+C.+elegans+oogenesis+via+a+sex-determination+module%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module.</a> Dev Cell. 20, 677-688 (2011).</li>
<li>Arur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ERK+substrates+execute+single+biological+processes+in+Caenorhabditis+elegans+germ-line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).</li>
<li>Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transport+Model+for+Estimating+the+Time+Course+of+ERK+Activation+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline.</a> Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141, 1399-1406 (1995).</li>
<li>Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gld-1%2C+a+tumor+suppressor+gene+required+for+oocyte+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139, 579-606 (1995).</li>
<li>Seydoux, G., Dunn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally+repressed+germ+cells+lack+a+subpopulation+of+phosphorylated+RNA+polymerase+II+in+early+embryos+of+Caenorhabditis+elegans+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster.</a> Development. 124, 2191-2201 (1997).</li>
</ol>

המחברים הצהירו כי אין אינטרסים מתחרים.

ERK Active (dpERK) כדלקמן דפוס לוקליזציה מרחבית ודינמי סטריאוטיפית של ג germline elegans. דפוס מרחבי שבלונות dpERK זה (איור 5), משרעת ב מבוגר ג בלוטת המין elegans, יכול להיות מתואמים באופן יעיל עם תהליכים ביולוגיים רבים ERK מסדיר. לדוגמה, חוסר יכולת להפעיל ERK ב Zone 2 תוצאות מעצר ביציות ב prophase של המיוזה, פנוטיפ שנצפתה germlines נקבה שלא צוין הזרע, ובכך לא תפעיל ERK ב ביציות בוגרות (איור 5). הזדווגות עם התוצאות של הזכרים בצבירת יעיל של dpERK אזור 2 germlines נקבת 11,13, בשילוב עם הופעת התבגרות ביוץ ביצית. לכן ניתוח של דפוסים מרחביים והפעלה זמנית של dpERK על הפרעות גנטיות מסוימות (כגון איון גן בתיווך התערבות RNA) או טיפולים כימיים מאפשר זיהוי של גורמי reguאיתות ERK מאוחר ולכן תהליכים ביולוגיים ERK תלויים. ניתוחים כאלה גם לאפשר גילוי אינטראקציות גנטיות רומן בין מסלולי איתות. צוואר בקבוק קריטי עבור כל ניתוח מבוסס הדמיה הוא הזמינות של חומרים כימיים פונקציונליים, כגון נוגדנים ספציפיים ליישום. אם ריאגנט כזה אז שיטות כגון זה המתואר לעיל ניתן להתאים בקלות לניתוח דפוס לוקליזציה עבור כל חלבון של עניין. היישום ובכך הוא מוגבל על ידי הזמינות של נוגדני תפקוד. בנוסף, כיוון שאמצעי מתאר דיסקציה מכתים בכל פעם התפתחותי נתון, זה רק מאפשר לכידה של מידע במסגרת אחת זמן, ואינו לשפוך אור על הדינמיקה או תקנה חלבון בזמן אמת או שיעור מחזור חלבון. השיטה המתוארת לעיל מותאמת אל פרנסיס et. 23, והוא שונה מן מ סידו ו דאןethod 24 לשחול בלוטת המין מכתים נוגדן. השיטה המבוססת על פרנסיס et al. תיקרא &quot;שיטת ההשעיה&quot; ושיטת סידיו ו דאן נקראה &quot;שיטת פיצוח להקפיא&quot; להשוואה. שיטת ההשעיה הייתה יעילה מאוד בידינו לקבלת דפוסי לוקליזציה לשחזור של מולקולות איתות כגון dpERK, כי מטבעם רגישים יותר לתנאי טיפול קשים. במקרה של לוקליזציה dpERK שעל פי ניסיוננו, אות אזור 1 היא כמעט בלתי ניתנת לגילוי באמצעות שיטת פיצוח ההקפאה. בנוסף, ייבוש מדגם, אשר לעתים קרובות יכול להתרחש עם שיטת פיצוח ההקפאה, תוצאות אותות נוגדן מזויפים. שיטת ההשעיה ממזערת ייבוש מדגם, מאז בלוטות המין מושעות בתוך נוזל לאורך כל התהליך. כמו כן, אנו מוצאים כי שיטת ההשעיה שימושית הדמית גנוטיפים שונים מרובים בשקופית אחת. לדוגמה, אם שני גנוטיפים, כגון הרמפרודיטים vsהנקבות כדי להשוות ישירות ללוקליזציה dpERK, שני גנוטיפים ניתן לערבב יחד ומעובד. זה אפשרי מכיוון פנוטיפים הם ברורים ניתן להבחין באמצעות מורפולוגיה DAPI. מכתים באותו צינור ואחריו הדמיה באותו שקופיות מאפשר השוואה ישירה בין בלוטות המין מן גנוטיפים שונים. לחלופין, אם מורפולוגיה DAPI אינן שונות, אז מכתים נוגדן שני שלבים יכולים להיות מאומץ. ראשית כל גנוטיפ פרט מטופל עם שני נוגדנים שונים, נוגדן A עבור WT ו נוגדן B עבור מוטציה (שני הנוגדנים שיועלו לארח נבדלת נוגדן dpERK). לאחר שני גנוטיפים כבר מוכתם עם הנוגדן הראשוני, ורחצו, הם יכולים להיות מעורבים יחד צינור אחד ועכשיו מוכתם נוגדן dpERK, ואחריו טיפול נוגדנים משני לדמיין את כל הנוגדנים בצינור. יכולת להשוות גנוטיפים שונים בשקופית אחת, במיוחד כאשר דeductions של דפוסי הפעלה נעשה מבטיח פרשנויות מדויקות לא שנפגעו ממחלות או מכתים ברורה. בעוד יתרון, ישנם צעדים רבים ברחבי שיטת ההשעיה הדורשים מניפולציה זהירה. זה קריטי, כי והניתוחים להתרחש בתוך זמן בצורה יעילה; חשוב, והניתוחים לא צריכים לקחת יותר מ -5 דקות. פעמים לנתיחה עוד ליצירת אות dpERK משתנית, אשר לעתים קרובות יכול להיות שלא כהלכה כשינויים מוסדרים הפעלת ERK, ולא תקלות טכניות כמו. זה חיוני כדי להתחיל עם למעלה מ 100 - 150 חיות עבור כל לנתיחה משום שבמהלך לשטוף השונה צעדי בלוטות המין יכול ללכת לאיבוד בקלות מן הצינורות בגלל שגיאות pipetting. הפסד של בלוטות המין, ניתן להפחית באמצעות לנתח בקבוצות קטנות מרובות (כגון שלוש קבוצות של 50 חיות כל) כי ניתן לשלב, או על ידי לנתח אצווה אחת גדולה של 150. אתגר נוסף הוא מקבל את בלוטות המין לשכב באר כמרווח היווצרותניתן הדמיה בשקופית כך בלוטת המין דיסטלי כולו. כדי לאפשר זאת, השתמש עפעף על גפרור או טפטפת משך לחלל את בלוטות המין. עם זאת, יש להיזהר כדי לא לפגוע בלוטות המין במהלך תהליך זה. לעתים קרובות עם טכניקות אלה שנדרש ניסיונות מרובים להשתלט על והניתוחים וכן הסדרים של בלוטות המין על השקופיות. לאחר הטכניקה הזו כבר שולטת, היא משמשת שיטה חזקה ניתוחים ביולוגיים מגוונים, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד יותר מסתם רמות dpERK. לדוגמה שיטה זו יכולה לשמש כדי לחזות רמות p38 פעילות, או רמות CDK פעילות, או כל חלבון עבורו מגיב נוגדן קיים. בנוסף, השיטה יכולה להיות בשילוב עם מסך עיכוב כימי בחיות כולו assay למעכבי רומן או activators של המסלול, באמצעות assaying עבור רמות dpERK. זה יאפשר שהוקרא ממחשב in vivo של שניהם התגובה ורגישה לכל מעכבים שעשויים interact עם מסלול איתות RTK-RAS-ERK. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש בצירופי נוגדן עם יציאות איתות רבות שיכולים לשמש כל ו מדמיינים בבת אחת. באמצעות מספר נוגדנים מאפשר קורלציה בין מסלולים, מצב ההפעלה שלהם, ותוצאות כל זאת במסגרת של אותה הרקמה, המאפשר הבנה טובה יותר של האינטראקציות הללו. אלה הם רק כמה דוגמאות של יישומים נוספים של שיטה זו, אך מערכת זו יכולה להיות שונה כדי ללמוד תחומי מחקר מרובים.

טירוזין קינאז קולטן (RTK) סרקומה -RAt (RAS) אות -Extracellular מוסדרים קינאז (ERK) מסלול ומשדר אותות תאיים דרך מפל קינאז משומר שתוצאתו זירחון והפעלה של ERK 1-3. חלבונים ERK הם חברי MAP סרין / תראונין פרולין מכוונת משומר (חלבון הופעל mitogen) המשפחה קינאז, ושמופעלים ישירות על ידי MEK באמצעות זירחון כפול על תראונין (T) ו טירוזין (Y) של מוטיב טיי משומר. ERK Active (המכונה diphosphorylated ERK, או dpERK) אז מסדיר תהליכים תאיים והתפתחותיות רבים באמצעות זירחון של סוללה של מצעים במורד 1-3. לפיכך פעילות ERK חריגה מובילה סלולארי רבים ופגמים התפתחותיים 4-7. רגולצית מחמירות פעילות ERK היא קריטית להתפתחות נורמלית: במערכות יונקות יותר מדי פעילות ERK מובילה מוביל תרבות תאים מופרזתלצמיחה בשעור; מעט מדי פעילות מוביל מוות של תאים 4,6. בנוסף, שינויי משך פעילות ERK גם יכולים להוביל לתוצאות ברורות: בתאי PC12, הפעלת ERK למשך 30 דקות או פחות פרוליפרציה תא, אך הפעלת ERK למשך 60 דקות או יותר גורם בידול עצבי 8,9. רגולציה הדוקה של פעילות ERK כן חיונית בבירור לפיתוח הומאוסטזיס נורמלי. סי אלגנס הוא מערכת מודל עצמה, וגנטי נזילה לנתח את הפונקציה ורגולציה של ומסלול RTK-RAS-ERK איתות 3,10-15. יחסית למערכות יונקות, אשר מכילות מספר רב של גנים עבור ראס ERK, ג elegans מכיל גן אחד RAS (לתת-60) ואת גן ERK אחד (MPK - 1), מה שהופך אותו מערכת קלילה גנטי יותר שבו לנתח את הפונקציה של מסלול זה 3,10-14. ג germline elegans הוא למעשה צינור שמורכב mitoticתאי גזע בסופת דיסטלי ו ביציות בוגרות בקצה הפרוקסימלי שלו (איור 1) 16. תאי נבט ליזום המיוזה רק הפרוקסימלי לאזור mitotic דיסטלי, והתקדמות דרך prophase meiotic המורחבת (pachytene), לאחר מכן הם מתחילים להיווצר ביציות באזור לולאה, ולבסוף עוברת הבשלת הביצית באזור הפרוקסימלי 16. מחקרים גנטיים ממעבדות מרובות, כולל משלנו, הראו כי ומסלול RTK-RAS-ERK חיוני להתפתחות germline ב C. elegans 12,13,15,17-19. באופן ספציפי, מצאנו כי בקרות ERK ומתאם לפחות תשעה תהליכים ביולוגיים ברורים במהלך ההתפתחות germline, החל מתגים התפתחותיים כגון אפופטוזיס תאי נבט לתא תהליכים ביולוגיים כגון 11,18 צמיחה הביצית. בדומה במערכות יונקות, יותר מדי פעילות ERK ב ג elegans תוצאות germline בייצור ביציות קטנות מרובות, בעוד מדי liתוצאות פעילות ttle ב ביצית אחד גדולה 11. לפיכך רגולציה הדוקה של dpERK חיונית להתפתחות germline נורמלית. הצורה הפעילה של ERK, דמיין כפי נוגדן ספציפי dpERK, מציגה דפוס לוקליזציה סטריאוטיפי, דינמי, bimodal: dpERK הוא גבוה במהלך אמצע pachytene (1 אזור, איור 1), נמוך באזור הלולאה וגבוה שוב בוגר ביציות (2 Zone, איור 1). לאחרונה, מצאנו כי תזונה פועלת באמצעות פקטור הגדילה דמוי האינסולין לרצפטור 1 (DAF-2) כדי להפעיל ERK אזור 1 12; עבודות קודמות הראו כי האות הזרע (באמצעות טירוזין קינאז קולטן Ephrin) מפעיל ERK אזור 2 13. בהתחשב בכך פונקציות ERK כהיותו רֵיאוֹסטָט ב germline להסדיר צמיחת ביצית, לוקליזציה במרחב ובזמן, כמו גם משרעת של dpERK, הוא מפתח להבנת תוצאת האיתות הרגילה שלו. באמצעות השיטה המתוארת כאן, שינוייםלוקליזציה סטריאוטיפית של dpERK ניתן לנטר בקלות תחזיות נגזרו על ההשפעה של ההפרעות הסביבתיות או גנטיות על פעילות ERK ובכך פונקציה. לכן, מנסה לאמוד עבור dpERK מאפשר הבנה מקיפה של התפקיד שלו בעת פיתוח germline.

<table><tbody><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא בע"מ</td><td>A9539</td><td>ממיסים 2 גרם ב-100 מ"ל כדי ליצור את התמיסה של 2%</td></tr><tr><td>צלחת שעון זכוכית תחתונה שטוחה</td><td>Agar Scientific</td><td>AGL4161</td><td>אנו משתמשים בזכוכית מכיוון שבלוטות מין מנותחות נדבקות לעתים קרובות למחטי פלסטיק</td></tr><tr><td>25 גרם BD</td><td>PrecisionGlide</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים (יכולים להיות 1 או 5 מ"ל)</td> <td>מזרקי BD</td><td>1 מ"ל: שקופיות BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ (25 x 75 x 1.0 מ"מ)</td> <td>Fisherbrand</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים (24 x 50 מ"מ)</td> <td>קורנינג</td><td>2935-245</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור חרוטי מזכוכית</td><td>קורנינג</td><td>8060-5</td><td></td></tr><tr><td>9 אינץ' חד פעמי פסטר</td><td>פיפטה פישרברנד</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td>עליונה ספסל קליני</tr><tr><td>זכוכית&nbsp; צינורות (6 x 50 מ"מ)</td> פתרון <td>פישרברנד</td><td>14-958-A</td><td></td></tr><tr><td>*M9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>17500</td><td>מתקבל כתמיסה של 16% באמפולות, ומדולל ל-3% במאגר אשלגן פוספט</td></tr><tr><td>1x PBS-T</td><td>1x PBS עם 0.1% Tween 20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>מתנול</td><td>18510</td><td></td></tr><tr><td>עז רגילה סרום (NGS)</td><td>איתות תאים</td><td>5425</td><td>מדולל ל-30% בנוגדני 1x PBS-T</td></tr><tr><td>MAPKYT (dpERK)&nbsp;</td><td>סיגמא בע"מ</td><td>דילול M9692</td><td>1:400 ב-30% NGS</td></tr><tr><td>נוגדן משני</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>דילול 1:500 ב-30% NGS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>*M9 מתכון</td><td></td><td></td> חיץ <td>3 גרם KH2PO4, 6 גרם Na2HPO4, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל 1 מ' MgSO<תת>4, H2O עד 1 L.&nbsp;</td></tr><tr><td>**PBS (1x)</td><td></td><td></td><td>8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2PO4, 0.133 גרם CaCl2, 0.10 גרם MgCl2, H2O עד 1 ליטר</td></tr><tr><td>מדיום גידול נמטודות (NGM)</td><td></td><td></td><td>3 גרם NaCl, 17 גרם אגר, 2.5 גרם פפטון, 975 מ"ל מים בבקבוק ארלנמאייר 2 ליטר. חיטוי למשך 50 דקות. מצננים, ומוסיפים 1 מ"ל של 1 מ"ל CaCl<תת>2, 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול, 1 מ"ל של 1 מ"ל MgSO<תת>4 ו-25 מ"ל של 1 מ"ל KPO4.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ניתוח במרחב ובזמן של erk פעיל<em&gt; c. elegans</em&gt; germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

האות התאי השמור באבולוציה transducing ומסלול RTK-RAS-ERK הוא קינאז-איתות חשוב מפל השולט תהליכים תאיים ו התפתחותיים מרובים בעיקר באמצעות הפעלה של ERK, קינאז המסוף של המסלול. רגולציה הדוקה של פעילות ERK חיונית להתפתחות נורמלית הומאוסטזיס; תוצאות פעילות ERK יתר על מידת תרבות תאים מופרזת, תוך תת ERK גורמת מוות של תאים. ג elegans היא מערכת מודל רב עוצמה סייעה לאפיין את הפונקציה ורגולציה של מסלול איתות RTK-RAS-ERK במהלך הפיתוח. בפרט, ומסלול RTK-RAS-ERK חיוני ג elegans פיתוח germline, המהווה את המוקד של שיטה זו. באמצעות נוגדנים ספציפיים הצורה הפעילה, diphosphorylated של ERK (dpERK), דפוס הלוקליזציה הסטריאוטיפי ניתן דמיין בתוך germline. בגלל דפוס זה הוא במרחב ובזמן בשליטהed, היכולת assay dpERK reproducibly שימושית כדי לזהות הרגולטורים של מסלול המשפיעים משך אות dpERK משרעת ובכך פיתוח germline. כאן אנו מדגימים כיצד לנתח בהצלחה, כתם, ותמונה dpERK בתוך ג בלוטת מין elegans. שיטה זו יכולה להיות מותאמת עבור לוקליזציה המרחבי של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, ובלבד נוגדן תואם immunofluorescence זמין.

אצל בעלי חיים hermaphroditic מבוגר WT, dpERK הוא מדמיין בדרך כלל באזור אמצע pachytene, 1 אזור, ובסופו של ביציות בוגרות ביותר מ -1 דרך -4 או -5 (אזור 2). הפרעות בדפוס הפעלה זה לשקף שינויים מסלול איתות. Germlines נקבה לא תציין זרע, ובכך אינו מוצגת הפעלה של ERK ב Zone 2, עם הפעלת התורפה היחידה Zone 1. אלו מיוצגות באיור 5. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" /> איור 1: ג elegans germline מורפולוגיה. התערבות הפרש לעומת זאת (DIC) תמונה של אנדרוגינוס מבוגר עם אחד בצורת U בלוטת מין זרוע התווה עם הקו הלבן. בלוטת המין למבוגרים hermaphroditic מכיל תאים mitotic בקצה הדיסטלי. התאים mitotic להיכנס המיוזה והתקדמות דרך prophase meiotic (pachytene) מלהתפתח מטורביציות דואר ב בלוטת המין הפרוקסימלי. אזור 1 ו Zone 2 סימן לוקליזציה סטריאוטיפית של dpERK בתוך בלוטת המין למבוגרים hermaphroditic. סולם:. 20 מיקרומטר <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" /> איור 2: הפגנה של פוזיציות מחט במהלך וניתוחי שמאל:. תצלום של דיסקציה בתהליך. מימין:. מחט עמדות תוך התייחסות התולעת <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" /> איור 3: הפגנה של שקופיות Agarose כנות. (א) מניחים קלטת lengthwisדואר ברחבי 2 שקופיות מיקרוסקופ נקיות. מקום שקופית מיקרוסקופ נקי טרי בין שתי השקופיות עם הקלטת כמוצג. השלוש השקופיות הן אחד ליד לאורכו אחר. (ב) הוספה נמס agarose לשקופית במרכז. (C) מקום שקופית מיקרוסקופ טרי בניצב, ועל גבי, השקופית באמצע, נושא את טיפת agarose. ( D) אפשר agarose כדי לחזק. (E) להסיר את השקופית העליונה והותיר אחריו כרית agarose הקרושה. השתמש שקופיות התחתונות עם כרית agarose להרכבת גזור ומוכתמת germlines. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" /> איור 4: הדמיה השקופית כמו Montage Montage של germline סוג בר עם DAPI (t.op) ו dpERK (ערוץ תחתון). תמונות שצולמו ב 63X עם גבולות חופפים, תיבות לבנות עבור פנל ו- B ותיבות ירוקות עבור לוח ב &#39;ו-ג DAPI ו dpERK תמונות עבור כל לוח נלקחו בו זמנית בשני ערוצים שונים. התמונה התאספה מוצגת איור 5 א. סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" /> איור 5: Dynamic Temporal / מרחבית הפעלת ERK. (AC) WT (N2) מבוגר (24 השעות האחרונות אמצע L4 שלב הפיתוח) אנדרוגינוס germlines מוכתם עבור DNA (B, DAPI, לבן) dpERK (C, אדום). אות dpERK אזור 1, באזור pachytene, ואת האזור 2, הביציות הבשלות מודגשת. (DF)ערפל-2 (oz40) germlines נקבה (ב 8 שעות האחרונות אמצע L4 שלב הפיתוח) מוכתם עבור DNA (E, DAPI) ו dpERK (F). germlines נקבה צעירה להציג dpERK החלש אזור 1, וב ביצית יחידה באופן זרע עצמאי. אזור 2 הוא זרע תלוי, ובכך נעדר germline הנשי. סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מציגים שיטת immunofluorescence מבוסס הדמיה ללוקליזציה במרחב ובזמן של ERK הפעיל הגזור ג בלוטת מין elegans. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים להדמיה של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, סיפק מגיב נוגדן מתאים זמין.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבחון את רמות ה-ERK הפעיל in vivo בגונאדות של C.elegans. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי השליחון של ERK ותאי הנבט, כגון השפעותיהם של טיפולים תרופתיים או הפרעות גנטיות על מסלול ה-RAS-ERK, ובכך על התפתחות תאי הנבט. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לכמת את תבנית עוצמת אות ה-ERK ב-in vivo.בחרו 100 עד 150 תולעים בשלב ההתפתחותי הרצוי ואספו אותן לפרועת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 milliliters המכילה 100 microliters של M9 buffer. לאחר מכן, מלאו את פרועת המיקרוצנטריפוגה ב-900 microliters נוספים של M9 buffer וסובבו אותה בצנטריפוגה במהירות של 1000 times g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסירו בעדינות 900 microliters של M9 buffer.לאחר מכן, חזרו על השטיפה פעמיים נוספות כדי להסיר את מרבית החיידקים ההדבקים. לאחר מכן, באמצעות טיפ של מיקרופיפ smak ל-200 microliter בעל פיה רחבה, העבירו את התולעים ב-100 microliters של M9 buffer לכלי זכוכית שטוח (watch dish). לאחר מכן, הוסיפו לכלי בין 1 ל-3 microliters של Levamisole בריכוז 0.1 molar וסובבו אותו בעדינות.כעת, חברו שני מחטים במידה של 25-gauge לשתי מזרקים כדי ליצור כלי ניתוח עבור כל יד. תחת מיקרוסקופ ניתוח, מקמו כל מחט מתחת ומעל לכל תולעת ובצעו חיתוך עדין בכל תולעת סמוך לנורה הלועית השנייה, תוך שימוש בתנועה דמוית מספריים. חתכו את כל בעלי החיים לפחות פעם אחת, וזאת בתוך חמש דקות, כדי שה-Levamisole יישאר יעיל.חשוב מאוד להשלים את נתיצת בעלי החיים בצלחית בתוך פחות מחמש דקות. במקרה שגונד ( gonad) בולט אינו נראה, פשוט דלגו על אותו בעל חיים. גונדים בולטים ותקינים נראים כאן.לאחר השלמת הנתיחה, תחת מכסה עשן, הוסיפו שני מיליליטר של 3% paraformaldehyde ישירות אל צלחת השעון מזכוכית וכסו אותה ב-Parafilm. לאחר מכן, המתינו עשר דקות. לאחר מכן, באמצעות פיפט פסטור מזכוכית באורך תשעה אינץ', הוסיפו שלושה מיליליטר של PBS-T לצלוחית השעון וערבבו את התמיסה באמצעות הפיפט.לאחר מכן, באמצעות פיפטה מזכוכית חדשה, שאבו את חמשת המיליליטרים של הנוזל המכיל את התולעים והעבירו אותם למבחנה קונית חדשה מזכוכית בנפח חמישה מיליליטרים. לאחר מכן, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה קלינית במשך 30 שניות במהירות של 1000 g. כעת, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסירו והשליכו את supernatant מבלי להפריע לרקמות המנותחות.לאחר מכן, בעזרת מנות של 5 mL של PBS-T, חזרו על שלב השטיפה פעמיים נוספות וסיימו כאשר התולעים נמצאות בנפח קטן של תמיסה. לאחר מכן, בעזרת פיפטת זכוכית, הוסיפו 2 mL של 100% Methanol וערבבו בעדינות את הרקמות על ידי שאיבה למעלה ולמטה עם פיפטת פסטור נקייה. כעת, דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 20- °C למשך שעה אחת לפחות.לאחר הטיפול במתנול, בצעו שלושה שטיפות ב-PBS-T וסיימו עם כ-500 microliters של PBS-T. כעת, בעזרת פיפט פסטור חדשה, העבירו את הרקמות למבחנה זכוכית חדשה בנפח של one milliliter והמתינו עד שיהיו שקועות בעקבות כוח הגרוואיטציה. לאחר חמישה עד 10 דקות, השתמשו בפיפט חדשה ובעזרת מיקרוסקופ כדי להסיר מהמבחנה כמה שיותר מתמיס השטיפה, מבלי להפריע לרקמות.כדי להתחיל את החסימה, הוסיפו 100 µL של normal goat serum בריכוז 30%, המשמש כבופר החסימה. לאחר מכן, כסו את המבחנה ב-Parafilm והשאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שעה, הסִירו בעזרת מיקרוסקופ כמה שיותר נוזל באמצעות פפטה חדשה.בשלב הבא, הכין 100 µL של נוגדן MAPKYT המדולל ביחס של 1:400 ב-30% NGS והוסף אותו לרקמות. לאחר מכן, אטום את הפפלה באמצעות Parafilm והדגר אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, חמם את הפפלות לטמפרטורת החדר והוסף 800 µL של PBS-T.לאחר מכן, שאבו את הדגימה לפיפטית זכוכית נקייה ושחררו אותה בעדינות כדי ליצור סספנסיה אחידה. לאחר שהרקמות שקעו לתחתית, הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) וחזרו על השטיפה שלוש פעמים בסך הכל, תוך שימוש בפיפטית נקייה בכל פעם ומבלי להשתמש בוורטקס. את הנוגדן המשני מחילים בדומה לנוגדן הראשוני, אך יש להקפיד להחזיק את הרקמות בחשיכה מהשלב זה ועד לצילומן.לאחר הדגרה עם הנוגדן המשני, הוסף 800 µL של תמיסת DAPI מדוללה לרקמות ברגע שהשטיפה האחרונה הוסרה. כסה את פיית המבחנה ב-Parafilm והדג אותה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר כמה שיותר מתמיסת ה-DAPI באמצעות פ pipette חדשה.לאחר הסרת הצבע או השטיפה האחרונים, הוסיפו טיפה אחת של תמיסת קיבוע למבחנות. כעת, הכינו שקופית קיבוע עם פד אגרוז. הוסיפו טיפה של 2% agarose מומס לשקופית זכוכית נקייה והניחו במהירות שקופית נקייה שנייה בניצב ועליה.לבסוף, הסירו בעדינות רבה את זכוכית המקרה העליונה. כעת, העבירו את בעלי החיים שנוסחו אל הרפידה והסירו את כל הנוזל העודף מהרפידה בעזרת מיקרוסקופ. לסיום, הניחו זכוכית כיסוי בגודל 24 על 50 מילימטר ללא יצירת בועות אוויר.לאחר הנחת זכוכית הכיסוי, אין להפעיל לחץ נוסף. פעולה זו מובילה לעיתים קרובות לאובדן האות. תמונות מייצגות של בעלי חיים הרמאפרודיטים בוגרים מסוג wild type חשפו כי הצורה הפעילה הדי-פוספורילטית של ERK נראית בדרך כלל באזור ה-mid-Pachytene, באזור 1, ובאוקיציטים הבשלים ביותר באזור 2.הפרעות בדפוס הפעלה זה משקפות שינויים במסלול השליח. קווי נבט נקביים אינם מייצרים תאי זרע ולכן אינם מראים הפעלה של ERK באזור 2 (Zone 2), ורק הפעלה חלשה באזור 1 (Zone 1). לאחר רכישת המיומנות, טכניקה זו עשויה לארוך לכל היותר יומיים, כאשר היום הראשון דורש את מרבית הזמן, כשעה אחת בביצוע נכון.בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון RNA fish, כדי לכמת מדדים כגון רמת תעתוק ה-RNA, בנוסף למידע על שפע החלבון. לאחר פיתוחה בשנת 1995, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום התפתחות תאי הנבט לבחון רמות שפע של חלבונים in vivo ולעקוב אחר מורפולוגיית הכרומוזומים ב-C.elegans.

spatial-and-temporal-analysis-of-active-erk-in-the-c-elegans-germline

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

ניתוח microarray נערך כדי לקבוע פרופילים של ביטוי...

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

סרטון זה מתאר שיטה לניתוח גונדות מהרמפרודיטים בוגרים של C. elegans, וכתוצאה מכך רקמות המתאימות להדבקה חיסונית והדמיה פלואורסצנטית.

ג. אלגנס שחול גונאד: טכניקת דיסקציה מהירה

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

שעון הסגמנטציה מניע ביטוי גנים תנודתי על פני המזודרם הקדם-סומיטי (PSM). פעילות חריץ דינמית היא המפתח לתהליך זה. אנו משתמשים בהדמיה וניתוחים חישוביים כדי לחלץ דינמיקה זמנית מנתוני ביטוי מרחבי כדי להוכיח שביטוי ליגנד דלתא וקולטן Notch מתנדנד ב-PSM של בעלי חוליות.

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

שיטה מבוססת הדמיה מתואר כי ניתן להשתמש כדי לזהות שלב S ולנתח מחזור התא דינמיקה ב germline אנדרוגינוס C. elegans באמצעות של תימידין אדו אנלוגי. שיטה זו דורשת לא transgenes והוא תואם עם immunofluorescent מכתים.

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

חקור אימונופלואורסצנציה לזיהוי ERK פעיל בגונדה של C. elegans. שיטה זו מאפשרת כימות תבניות אותות ועוצמת אותות בחיים, ומסייעת להבנת פיתוח תאי גרעין ומסלולי איתות.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל

גלה סרטונים נוספים