פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע כוחות על המקשר של שלד הציטו נוקלאוסקלטון, או קומפלקס LINC, באמצעות מיקרוסקופ FRET בתאים חיים באמצעות חיישן ביולוגי המיועד לחלבון קומפלקס LINC, nesprin-2G. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטרנסדוקציה המכנית, כגון הכוחות המופעלים על חלבונים בגרעין התאים החיים, וכיצד כוחות אלה משתנים בתנאים משתנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יכולתה למדוד רמות קטנות מאוד של כוח על חלבונים ותאים חיים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בצילום תמונות. קשה לייעל את עוצמת הלייזר והרווח של המיקרוסקופ כדי לקבל אות טוב בין כל קבוצות הניסוי. כדי להתחיל, גדל תאי פיצוץ סיבים NIH 3T3 למפגש בין 70% ל-90% בצלחת תרבית תאים בת שש בארות בחממת תרבית תאים סטנדרטית עם ויסות טמפרטורה ו-CO2.

במכסה המנוע של תרבית תאים, הסר את המדיום ושטוף כל באר עם כ-1 מיליליטר של מדיום תאי סרום מופחת. הוסף 800 מיקרוליטר של מדיום תאי סרום מופחת לכל באר, והנח את תא שש הבארות בחממה. לאחר מכן, פיפטה 700 מיקרוליטר של מדיום תאי סרום מופחת לתוך שפופרת של 1.5 מיליליטר המסומנת L עם 35 מיקרוליטר של תמיסת נשא שומנים ליצירת תערובת הליפו.

מערבבים את המתלה על ידי פיפטינג. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר ממדיום תאי הסרום המופחת לכל אחת משש שפופרות של 1.5 מיליליטר המסומנות אחת עד שש. פיפטה את ה-DNA של הפלזמה עבור חיישן מתח נספרין, בקרת כוח אפס ללא ראש של נספרין, mTFP1 וונוס לצינורות 1 עד 6, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

אין לעשות שימוש חוזר בקצות פיפטה בעת פיפטינג סוגים שונים של DNA. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר מתערובת הליפו מצינור L לכל צינור מסומן, וערבב על ידי פיפטה חוזרת, באמצעות פיפטה נקייה לכל צינור. דגרו את המתלה למשך 10 עד 20 דקות.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר מכל צינור מסומן לבאר של תא שש הבארות המוכן המכיל תאים. סמן את החלק העליון של כל באר עם ה-DNA המתאים. לאחר מכן, הניחו את תא שש הבארות באינקובטור למשך ארבע עד שש שעות.

לאחר הדגירה, שאפו את המדיום והוסיפו מיליליטר עד שניים של מדיום תאי סרום מצומצם לשטיפה. שאפו את מדיום תאי הסרום המצומצם, והוסיפו שני מיליליטר טריפסין לכל באר לפני שמניחים את צלחת שש הבארות באינקובטור למשך חמש עד 15 דקות. בזמן שהתאים מתנתקים באינקובטור, מצפים שש צלחות צפייה בתחתית זכוכית בשכבה של פיברונקטין בריכוז של 20 מיקרוגרם למיליליטר מומס במי מלח עם פוספט.

אפשר לכלים לצפות את פני השטח במכסה המנוע של תרבית התאים. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת שני מיליליטר של DMEM לאחר ניתוק התאים. לאחר מכן, העבירו את תכולת כל באר לצינור צנטריפוגה מסומן של 15 מיליליטר וסובבו מטה ב-90 פעמים גרם למשך חמש דקות בצנטריפוגת רוטור מתנדנדת.

שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש כל כדור תא ב-1,000 מיקרוליטר של DMEM באמצעות פיפטה. שואבים את תערובת הפיברונקטין מכלי הזכוכית ופיפטה 1,000 מיקרוליטר מכל תרחיף תאים על הכלים. לאחר שהתאים מתיישבים בתחתית כלי הזכוכית, הוסיפו עוד מיליליטר מדיה לכל באר.

אפשר לתאים להתחבר ולבטא חיישן בחממת התאים למשך 18 עד 24 שעות לפחות. כדי לאמת את יעילות הטרנספקציה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בתדר עירור קרוב ל-462 ננומטר עבור mTFP1, או 525 ננומטר עבור נוגה. השתמש במסנן פליטה שמרכזו קרוב ל-492 ננומטר עבור mTFP1, או 525 ננומטר עבור נוגה.

בערך 18 עד 24 שעות לאחר השלמת הטרנספקציה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לבחון את יעילות הטרנספקציה על ידי השוואת מספר התאים הפלואורסצנטיים למספר הכולל של התאים הנראים. אם לא ניתן לדמות תאים חיים תוך 48 שעות לאחר הטרנספקציה, תקן את התאים ב-4% פרפורמלדהיד למשך חמש דקות. אפשר לתאים לבטא חיישן במשך 24 עד 48 שעות לפני הקיבוע.

אחסן את התאים ב- PBS והצג לאחר 48 שעות. במכסה המנוע של תרבית תאים, החלף את מדיום התא במדיום הדמיה בתוספת סרום בקר עוברי של 10%. הנח את כלי הצפייה במיקרוסקופ קונפוקלי מבוקר טמפרטורה.

הנח את צלחת הזכוכית עם תאים מועברים mTFP1 מעל מטרת השמן בהגדלה של פי 60 עם צמצם מספרי של 1.4. אתר תאים המבטאים mTFP1 במצב פלואורסצנטי בשדה רחב. עם תא פלואורסצנטי בשדה הראייה, בחר את מצב הזיהוי הספקטרלי וצלם את התמונה הספקטרלית.

כלול את כל התדרים מעבר ל-458 ננומטר במרווחים של 10 ננומטר. בחר אזור פלואורסצנטי בהיר בתא. הוסף את ממוצע ההחזר על ההשקעה הפלואורסצנטי כעוצמה המנורמלת למסד הנתונים הספקטרלי על-ידי לחיצה על שמור ספקטרום במסד נתונים.

בצע אופטימיזציה של עוצמת הלייזר והרווח כך שיושג יחס אות לרעש טוב. ההגדרות ישתנו עבור ציוד שונה. חזור על התהליך עבור תאים המבטאים את ונוס והישאר במצב ספקטרלי.

השתמש בתדר עירור של 488 ננומטר במקום 458 ננומטר. כוונן את הגדרות צריכת החשמל לפי הצורך, אך אל תשנה את תדרי הפליטה. בחר החזר השקעה פלואורסצנטי בהיר ברדיוס של כ-20 פיקסלים.

הוסף את ממוצע ההחזר על ההשקעה הפלואורסצנטי כעוצמה המנורמלת למסד הנתונים הספקטרלי, על-ידי לחיצה על שמור ספקטרום במסד נתונים. כדי ללכוד את התמונות הלא מעורבבות, העבירו תחילה את מצב הלכידה לביטול ערבוב ספקטרלי. הוסף את טביעות האצבע הספקטרליות של נוגה ו-mTFP1 לערוצי הערבוב.

החזר את לייזר העירור למקור ארגון של 458 ננומטר. הנח את חיישן המתח של nesprin viewצלחת מעל מטרת השמן 60X. לאחר התמקדות בתא פלורסנט עם ביטוי בהיר מספיק, כוונן את הרווח ואת עוצמת הלייזר כדי לייעל את יחס האות לרעש.

צלם מינימום של 15 עד 20 תמונות של תאי חיישן מתח של nesprin עם בהירות דומה יחסית והימנע מרוויית פיקסלים מוגזמת. חזור על תהליך לכידת התמונה עם תאים חסרי ראש של nesprin באמצעות פרמטרי הדמיה זהים. תמונה מוגדלת מייצגת פי 10 של פיברובלסטים 3T3 שהועברו עם חיישן מתח נספרין באמצעות נשא מתווך שומנים מוצגת כאן.

בדרך כלל, רק חלק קטן מהתאים עוברים טרנספטציה בשדה ראייה נתון. מוצג כאן זוג מייצג של שני גרעיני 3T3 המבטאים nesprin-TS בערוצי ונוס ו-mTFP הלא מעורבבים ספקטרלית. תמונה צבעונית ממוזגת של שני הערוצים מוצגת בחלונית הימנית הרחוקה.

להלן דגימה מייצגת של גרעינים מוסווים של nesprin-TS מתאי MDCK בעלי ביטוי יציב על מצעים מעוצבים וחסרי תבנית. תמונות יחס מוגדרות כיחס של ערוץ ונוס חלקי ערוץ mTFP וניתן להשתמש בהן כדי לבצע השוואות כוח כמויות יחסיות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתייג בזהירות צינורות DNA במהלך הטרנספקציה, ולשמור על פרמטרי ההדמיה קבועים תוך לכידת תמונות תוצאה ספקטרלית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר תאים עם חיישן המתח של nesprin וללכוד תמונות שנפתרו ספקטרלית לאינדקס FRET ממוחשב המתאם עם כוח על חיישן המתח. למרות שבמקרה זה, חיישן FRET משמש עבור נספרין, ניתן ליישם אותו גם על חלבונים אחרים בתא שבהם רצוי כוח מדידה.