מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר תאי גידול ישירות לכבד העכברים לצורך מידול ניסיוני של גרורות בכבד סרטן השד. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את השלבים המאוחרים יותר של המפל הגרורתי בכבד העכבר. כולל אקסטרוואזציה של תאי סרטן השד, זריעה, מוות, התפשטות והחלטות תרדמה, כמו גם צמיחה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מעבירה תאי גידול ישירות לכבד ללא הסרת הטחול או גרורות מרובות איברים במקביל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הזרקת וריד הפורטל דורשת מניפולציות מדויקות המסתמכות על מעקב אנטומי ישיר. תסייע לי בהליך זה אלכסנדרה קווקנבוש, סטודנטית לתואר שני במעבדתו של פפרסאדין.

לפני תחילת ההליך, נגב את כל משטחי אזור הניתוח עם 10% אקונומיקה. שעה לפני הזריקות, טפלו בעכברים נקבות בנות שמונה עד 15 שבועות עם 100 מיקרוליטר של משככי כאבים תת עוריים לטיפול בכאב. מרחו משחה על עיני החיה.

לאחר מכן, הניחו את העכברים במצב שכיבה ואשרו את רמת ההרגעה המתאימה על ידי צביטת הבוהן. לאחר מכן, יש לחטא את אזורי הניתוח והסביבה של החיה, כולל הזנב, עם שלושה מגבונים סטריליים לסירוגין ספוגים בגזה 2%, ושני מגבונים להכנת אלכוהול. לאחר ניגוב הכלורהקסידין האחרון, השתמש באזמל סטרילי כדי לבצע חתך של סנטימטר אחד בעור בין המישור החציוני והמישור הסגיטלי בצד שמאל של העכבר, החל ממש מתחת לצלעות ומסתיים מעל פטמת בלוטת החלב המפשעתית הרביעית, ואחריו חתך דומה של סנטימטר אחד דרך הצפק.

כעת פיפטה את תאי הגידול למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להשהות מחדש את תמיסת התאים, וטען מזרק מחט נשלף של 25 מיקרוליטר, המצויד במחט בגודל 32, עם 10 מיקרוליטר מהתאים. לחץ על הבוכנה עד שהתאים נמצאים בקצה המחט, והבוכנה נמצאת בנפח המתאים להזרקה. נגב את החלק החיצוני של המחט הטעונה עם כרית אלכוהול סטרילית כדי להסיר תאי גידול חיצוניים, תוך הקפדה על הימנעות ממקלות מחט.

לאחר מכן, החזיקו את העור ואת רירית הצפק של הצד החציוני של החתך בעזרת המלקחיים, השתמשו בצמר גפן סטרילי כדי להעביר בזהירות את המעי הגס והדק על גזה סטרילית, ספוגה במי מלח סטריליים. מכסים את האיברים הפנימיים בגזה ספוגה במי מלח כדי לשמור על הלחות והסטריליות הפנימית. כאשר וריד הפורטל גלוי, בקש מעוזר להחזיק בעדינות את המעיים כדי לחשוף את וריד הפורטל בעזרת צמר גפן סטרילי ולהכניס את המחט שלושה עד חמישה מילימטרים לווריד הפורטל, כ -10 מילימטרים מתחת לכבד, בזווית של פחות מ -5 מעלות, צד משופע כלפי מעלה.

הזרקו לאט את הנפח המלא של תאי הגידול, ואפשרו לדם לזרום מעבר לראש המחט למשך מספר שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של תאי הגידול החוצה מהווריד. מכיוון שההדמיה, הגישה וההזרקה הנכונה לווריד הפורטלי היא חיונית, קח את הזמן כדי להבטיח שהמיקום של וריד הפורטל, ביחס למחט, משביע רצון לפני ניסיון ההזרקה. לאחר הזרקת כל התאים, הסר את המחט ובמקביל הפעלת לחץ עדין על הווריד בעזרת אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה.

לאחר מכן השתמש באפליקטור סטרילי חדש עם קצה כותנה כדי להחזיק חתיכה של 0.5 עד סנטימטר מרובע של גזה המוסטטית מעל אתר ההזרקה. לאחר חמש דקות, הרם בזהירות את הגזה כדי להעריך את סגירת הווריד. כאשר זרימת הדם נעצרה לחלוטין, הסר את הגזה והחזיר את המעיים לחלל הבטן.

בעזרת דפוס תפר רציף או קטוע פשוט, סגור את רירית הצפק עם תפר סטרילי ארבע אפס ויקריל ומתחדד. לאחר סגירת העור באותו אופן, יש להזריק 100 מיקרוליטר של חומר הרדמה מקומי לאורך מקום החתך, ואחריו אספקה תת עורית של 0.5 מיליליטר מי מלח סטריליים. ניתן לאשר את הזיהוי האנטומי המדויק של וריד הפורטל והזרקה תוך-פורטלית מוצלחת על ידי תרגול פרוטוקול ההזרקה עם דיו הודי או צבע דומה.

בהזרקה נכונה דרך וריד הפורטל, וכתוצאה מכך הדיו מועבר באופן מיידי וספציפי לכבד מבלי להתפשט לריאות. באמצעות תאי גידול זיכרון של עכברים המתויגים ב-GFP, פיזור תאי הגידול ברחבי הכבד ניכר 90 דקות לאחר ההזרקה, מה שמאשר אספקה מוצלחת של וריד הפורטל לכבד. תאי הגידול נמצאים בתוך הסינוסואידים כמו גם בתוך פרנכימת הכבד בסמיכות לשלשות הפורטל, שם דם וריד הפורטל נכנס לכבד, מה שמרמז על כך שאקסטרוואזציה פעילה של תאי גידול מתרחשת בשלב זה.

כפי שמודגם על ידי עקומות הישרדות אלה, העברת וריד הפורטל המאמצת של קווי תאי גידול חלב אגרסיביים מביאה לשיעורי הישרדות קצרים יותר ללא גרורות בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם קו תאי גידול פחות אגרסיבי. ניתן לאשר גרורות מבעלי חיים אלה על ידי חתך דרך הכבד ברמות של 250 מיקרון ולאחר מכן ניתוח H&E של הדגימות. יתר על כן, ניתוח אימונופלואורסצנטי שימושי לניתוחי נגעים גרורתיים מיקרו ומקרו של קווים סינגניים לא מתויגים כגון קו הגידול D2A1, שהם CD45 שלילי, Heppar-1 שלילי ו-CK18 חיובי כפי שמודגם בתמונות מייצגות אלה.

לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 12-14 דקות לכל עכבר, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להקדיש את הזמן הדרוש כדי לדמיין כראוי ולגשת לווריד הפורטל לפני ניסיון ההזרקה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיה תוך-חיונית לאחר הזרקת תאי גידול כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו תאי הגידול מתקשרים עם סביבת הלוברמיקרו.

עם פיתוחה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הגרורות לחקור שלבים מאוחרים יותר של המפל הגרורתי של סוגי סרטן שונים בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב היכן לבצע את החתך הכירורגי, כיצד להזיז בעדינות את האיברים הפנימיים כדי לגשת לווריד הפורטל וכיצד לבצע את ההזרקה התוך-פורטלית. אל תשכח, עבודה עם מזרקים עמוסים בתאי גידול עלולה להיות מסוכנת, וכי יש לנקוט באמצעי זהירות כדי להימנע מדקירות מחט בזמן ביצוע הליך זה.