Name: מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: חקור הזרקת תאי גידול לוריד הפורטל בעכברים לחקר גרורות כבד בסרטן השד. שיטה זו מאפשרת מחקר שלבים מאוחרים במטסטזיס בכבד תוך שמירה על מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לאלכסנדרה קווקנבוש על הסיוע בהליכים כירורגיים במהלך צילום פרוטוקול הווידאו, להדלי הולדן על התמיכה ההיסטולוגית, לסונאלי ג'ינדאל על הקלט על הגידול והפתולוגיה של הכבד במהלך פיתוח השיטה, ולבריאנה קארוסו על הסקירה הביקורתית של כתב היד. תאי גידול החלב D2A1 ו-D2.OR היו מתנה מד"ר אן צ'יימברס, תאי הגידול D2A1-GFP היו מתנה מד"ר ג'פרי גרין, ותאי הגידול 4T1 היו מתנה מד"ר היידה פורד. ליבת מיקרוסקופיית האור המתקדמת של OHSU במרכז יונגרס שימשה להדמיה. העבודה הכלולה בכתב יד זה כוללת מימון מ-NIH/NCI NRSA F31CA186524 (ל-ETG) ו-NIH/NCI 5R01CA169175 (ל-PS).

למחברים אין מה לחשוף והם אינם מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מודל ההזרקה לוריד פורטל עכבר Balb / c מתיר המחקר של נגעי סרטן שד בכבד בהיעדר גרורות רב-איבר מבלבלים וב שורה מוסמכת חיסונית באופן מלא. הפרוטוקול שלנו הוא קידום של הליכים כירורגיים שפורסמו בעבר המאפשרים גישת וריד השער עבור הזרקה של תאים סרטניים באופן ישיר לתוך הכבד 16,55,56. קידום אחת עשינו הוא להפחית את מספר התאים סרטניים מוזרקים באופן משמעותי מן ≥ 1 x 10 5 תאים / הזרקה 16,55,56 עד ≤ 10,000 תאים סרטניים / הזרקה. יש לנו גם הרחיב את המודל לחקר גרורות סרטן השד אל הכבד. שימוש בפרוטוקול זה, שתי שורות תאי סרטן שד עם פוטנציאל גרורתי ידוע לפתח גרורות בכבד עם חביון קצר יותר מאשר קו תאים סרטניים חלב שלו יותר. יתר על כן, בנקודות זמן מוקדמות, תאים סרטניים מופצים ברחבי parenchyma הכבד כקבוצות יחידות או קטנות של ce היחידLLS לאחר הזרקת תאים סרטניים. המודל צפוי במטרה לענות על שאלות של יעילות גרורתי כולל extravasation תאים סרטניים, הישרדות התא, תרדמת, ושגשוגם - כל פנוטיפים שתורמים להתפתחות של מחלה גרורתית מיקרו גרורתי וגלויה בכבד. חשוב לשקול היבטים רבים של פרוטוקול הזרקה לווריד פורטל לפני ייזום מחקרים. בזהירות להחליט על שורות תאים, ריכוז תא, מספר תאים הכולל, נקודות קצה עניין על בסיס מחקרי גישוש קטנים מומלץ בחום. יתר על כן, שימוש מארחים מוסמכים חיסוניים שורות תאי syngeneic הוא בעל חשיבות עליונה להבנת אינטראקציות תא מארח-גידול. חדש שפותח &quot;הראש זוהר&quot; עכבר מבטא eGFP ו בלוציפראז מבלוטת יותרת המוח הקדמית הוא כלי חשוב עבור ביטול תגובות לארח אקסוגניים eGFP ו בלוציפראז, חלבונים משמשים לעתים קרובות כדי לתייג קווי חלב גידול 75 </sup&gt;. שימוש בעכבר &quot;הראש זוהר&quot; ו syngeneic מתויג תאים סרטניים יקלו זיהוי קל של תאים מופצים יחיד מוקדי micrometastatic ידי IHC ללא החשש של תגובות דלקתיות כדי eGFP או בלוציפראז. בדומה לכך, בחירת אסטרטגיות ניהול כאב בקפידה כדי להבטיח אנטי מינימאליים או השפעה פרו-גידול מן משטר הטיפול התרופתי מומלצת בחום. צעדים קריטיים בפרוטוקול זה הנם עמיד בתנאים סטריליים ברחבי ניתוחים על מנת להבטיח הידבקות דבר זה אינו קורה, כמו זה יהיה לבלבל כל תוצאות. כמו כן, חשוב כי המחט ממוקמת כראוי וריד הפורטל על מנת להבטיח כי תאים סרטניים מועברים אל הכבד. תרגול הפרוטוקול עם צבעים כגון דיו הודו יעזור עם בעיה זו. צמיחת גידול באתר עור החתך היא האינדיקטור הטוב ביותר כי מיקום מחט פסול התרחש. לבסוף, זה קריטי, כי איבוד דם מעורק הפורטל נשלט כראוי וחדל לפני לחלוטין suturing החיה. שימוש גזה עוצרת דמום מאוד מפחית את הסיכון של איבוד דם בלתי מבוקר מעורק הפורטל לאחר הזרקה. בידיים שלנו, תמותה הקשורים פרוצדורליים בשל איבוד דם מן הזריקה הבאה וריד שער הופחת מ -30% ל 2% של עכברים עם השימוש גזה עוצר דמום. חשוב לציין כי מודל הזרקה לווריד פורטל לא לשכפל את מפל גרורתי מלא, אך הוא מוגבל לחקר extravasation תאים סרטניים, אינטראקציות נישה תאים סרטניים הבאים extravasation והתפתחות הגידול. מודלים במדויק לשכפל את מפל גרורה המלא אל הכבד, כגון מתרחש בחולים, יש צורך דחוף. מגבלה נוספת של המודל הזרקה לווריד פורטל היא שזה בתוהו בשל השפעת הניתוח על המארח, בריפוי פצעים ידוע להשפיע התקדמות המחלה 76,77. מודל ההזרקה לוריד הפורטל מהווה שיפור על הזרקה אחרתמודלים ללמוד גרורות בכבד, כולל intracardiac ומודלים intrasplenic. באופן ספציפי, מודל הזרקה לווריד הפורטל מאפשר לחקר מגוון גדול של התקדמות המחלה מאשר הדגם intracardiac, אשר מוגבל לעתים קרובות על ידי גרורות במקביל ברקמות אחרות. יתר על כן, מודל וריד השער לא מסובך על ידי הסרת הטחול, כפי שנעשה במודל intrasplenic. מודל ההזרקה לוריד פורטל עשוי להוכיח כלי שימושי לחקר גרור בכבד בכלל. גרורות בכבד הוא האתר השכיח ביותר של גרורות אדנוקרצינומה הכוללת, עם צמיחה גבוהה במיוחד נרשמה סרטן הלבלב (85% בגרורות הם אל הכבד), המעי הגס אדנוקרצינומה של הרקטום (&gt; 70%), כמו גם הקיבה הוושט (&gt; 30 %) 1. למרות מודלי גידול ספונטניים orthotopic העיקריים של אדנוקרצינומה לבלב ומעי גס יותר בקלות גרורה בכבד 78,79, מודל ההזרקה לוריד הפורטל עשוי provדואר שימושי להבנת התהליך גרורתי של הסרטן אלה כפי במסירה מבוקרת של תאים סרטניים מאפשר הערכות ביוכימיים, מולקולריות היסטולוגית בזמנים מוגדרים לאחר הגעת תאים סרטניים. לסיכום, מודל ההזרקה לוריד הפורטל מהווה שיפור חשוב על מודלים גרורים בכבד זמין של סרטן השד, ויכול גם להיות ישים בתחום הגרור בכבד בכלל.

סרטן שד גרור אל הכבד הכבד הוא אתר משותף של גרורות סרטן השד, יחד עם עצם וריאות 1-3. גרורה בכבד בחולי סרטן השד הוא גורם פרוגנוסטי בלתי תלוי לתוצאות עניות מאוד 4,5, כמו חציון הישרדות של חולות סרטן השד עם גרורות טווחי כבד מפני 4.8 עד 15 חודשים 6-9. לעומת זאת, חולות סרטן שד עם ריאות או גרורות בעצמות בעלי סיכויי הישרדות חציוני של 9 עד 27.4 חודשים 8,9 ו 16.3 כדי 56 חודשים 8,10-12, בהתאמה. גרורה היא תהליך רב שלבים, המכונה מפל גרורתי, אשר מתחיל עם הפצת תאים סרטניים ב הגידול הראשוני ונגמר תמותה חולה בשל זריעת התולדה של מחזורי גידול תאים בתוך איבר רחוק 13-15. במודלים של מכרסמים של גרורות חשפו כי המפל גרורתי הוא יעיל להפליא, עם אך ורק 0.02 - 10%תאים סרטניים במחזור הקמת גרורות גלויות 16,17. אחת צוואר בקבוק עיקרי של יעילות גרורתי מוכתב על ידי microenvironments הרקמה הייחודי אתרים משניים, בשם נישות גרורתי 18, המדגיש את החשיבות של גרורות אתר ספציפי הבנה. הנישה גרורתי הוא ייחודי באתר להישנות, והוא, בין היתר, המאופיינת בתצהיר של חלבונים תאי מטריקס ברורים 19,20, חדירה של אוכלוסיות תאים חיסוניים שונים 21-23, הומאוסטזיס רקמות שינו כולל ייצור dysregulated של ציטוקינים רבים, כמוקינים, ואת גורמי גדילה 15,18,24,25. לכן, הבנה של הנישה גרורתי הרקמות הספציפית מקדימה הבנה של איך למקד מחלה גרורתית. עם זאת, מודלים חזקים של גרורות בכבד חסרים. יתר על כן, מודלים משופרים של גרורות בכבד יהיו חיוניים לזיהוי מטרות רומן וטיפולים יעילים עבור wi חולות סרטן השדגרורות בכבד ה. הוקם מודלים לחקר סרטן שד גרור אל הכבד כיום דגמים זמינים ללמוד הופעת גרורות סרטן השד אל הכבד כולל xenografts תאים סרטניים האנושי בעכברים נפגעים חיסוניים. מודלים אלה משתמשים בדרך כלל שורות תאי סרטן שד אנושיים-למד היטב כגון MCF-7 ו מד&quot;א- MB-231 ו עירום, Rag1 - / -, או המארחים murine נפגעת SCID החיסונית 26-29. מודלי xenograft לספק את היתרון של מעורבי שורות תאים אנושיים שמקורם הסרטן, עם זאת, בהתחשב הייסוף האחרון עבור תאים חיסוניים גרור 30-32 ובהתנגדות טיפולית 33-35, בחקר גרורות שורה מוסמכת חיסונית מלא הוא בעל חשיבות עליון. מודלים ללמוד גרורות סרטן שד בכבד מארחים מוסמכים חיסוניים כוללים הזרקת orthotopic של תאים סרטניים syngeneic (למשל, 4T1 שורות תאי D2A1) לתוך כרית שומן החלב, עם או בלי כירורגיתכריתה של הגידול הראשוני, והערכה הבאה של גרורות 36-38. מן ראוי לציין כי שיעור גרורות בכבד ממודלי השתלת orthotopic הוא נמוך מאוד או לא קיים בהשוואה לאתרים גרורתי אחרים כגון ריאות 39,40, או מתרחש לאחר גרורות ריאות היא הוקמו, שמסבך בחקר הגרור בכבד ספציפי 37,39 . explants הגידול ממודלים סרטן השד ספונטנית מהונדסים גנטית ניתן מחדש מוזרק לתוך רפידות שומן החלב של המארחים תמימים תאים סרטניים syngeneic. לדוגמא, נמסר לאחרונה כי גידולים ספונטניים מעכברי K14 Cre ECad f / f P53 f / f, איזה דגם פולשני סרטן השד לובולרי, לפתח גידולים כאשר הוא מוזרק orthotopically לתוך מארחי wildtype. בעקבות כריתה כירורגית של גידולים אלה ברגע שהם מגיעים 15 מ&quot;מ 2, 18% מהעכברים התקדמו כבד גרור 40,41. גישה שלישית מודל שימושים גרורות בכבדגרורות ספונטניות בעכברים מהונדסים גנטי. עד כה, דיווחים של מודלים בעכברים ספונטניים של גרורות סרטן שד שהתפשטו בקלות אל הכבד אינם שכיחים. יוצאים מן הכלל הן H19-IGF2, את p53 FP / FP MMTV-Cre Wap-Cre, ואת P53 K14 Cre ECad f / f f / f במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, שבו גרורות בכבד מפתחת אצל אחוז נמוך של עכברים 38,41- 43. וכך, בעוד מודלי עכברים מהונדסים גנטי להקל על המחקר של כל השלבים של המפל גרורתי, מתן מודלי עצמה רלוונטיים קליני, הם מוגבלים בשל שיעורים נמוכים של גרורות בכבד 38. מודלים גרורים כמה לעקוף את השלבים הראשוניים של מפל גרורתי לרבות הפצת תאים סרטניים מהגידול הראשוני ו intravasation. מודלים אלה מאפשרים חקירת השלבים המאוחרים של המפל גרורתי, מן extravasation להקמת גידולים באתרים משניים. intמודל הזרקת racardiac מספק תאים סרטניים לתוך החדר השמאלי, אשר מפיץ תאים סרטניים לתוך מערכת הדם באמצעות האאורטה. הזרקת intracardiac דורש הדמיה אולטרסאונד מונחה של הזריקה או שיטות הדמיה אחרות כגון פליטת אור בלוציפראז מתויג תאים כדי לאשר זריקה מוצלחת. הזרקת תאים סרטנית באמצעות החדר השמאלי עלולה לגרום עצם, מוח, ריאות, ו / או גרורה בכבד, בקרב גופים אחרים 44-48. בגלל גרורות רבות-איבר, עכברים אלה זקוקים לעתים קרובות כדי להיות מורדמים לפני ההתפתחות גרורה בכבד גלוי, שלילת היכולת לחקור צמיחת גרורתי מלאה בתוך הכבד. גישה חלופית באופן משמעותי מצמצמת את ההתפתחות גרורה רב באתר היא מודל הזרקת intrasplenic. הזרקת Intrasplenic מספק תאים סרטניים דרך וריד הטחול המתחבר עם וריד מצע המעי העליון להפוך את וריד שער 49,50. ניתן לנטר בעלי חיים עבור outgrowth של גרורות בכבד בגלל היווצרות של גרורות באתרים אחרים היא נדירה, וכתוצאה מכך, את הבריאות הכללית של החיה נשמרת 49,50. עם זאת, חשוב לציין כי המודל intrasplenic דורש כריתת טחול להימנע גידולים הטחול 49,50, הליך אשר משפיע תפקוד מערכת החיסון. לדוגמא, פגיעת reperfusion איסכמיה לבבית מאופיינת חדיר תת מונוציטים Ly6C + שמקורן הטחול אחראי phagocytic ופעילות פרוטאוליטים במהלך ריפוי הפצע הבא איסכמיה 51,52. עם כריתת טחול, קיימת ירידה שנצפתה אוכלוסיות מונוציטים המסייעים איחוי פצעים 52. יתר על כן, כריתת טחול הוכח להפחית את צמיחת הגידול הראשוני וגרורות ריאות במודל סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים, במיוחד באמצעות צמצום מספר מחזורי התוך הגידול CCR2 + CD11b + Ly6C + myelo monocyticid תאים 53. בנוסף, כריתת טחול לאחר ההזרקה intrasplenic של תאי סרטן המעי הגס הביא רמות נמוכות של תאי הרג טבעיים אנטי סרטניים בבלוטות הלימפה mesenteric ו -54 גרורות בכבד גבוהות. לסיכום, ממצאים אלה מראים כי כריתת טחול פוגעת התפקיד של מערכת החיסון עם השלכות מאוחרות גורל תא גרורתי. פורטל וריד דגם הזרקה של כבד גרור כדי לחקור גרורות סרטן שד בכבד שורה מוסמכת חיסונית באופן מלא, בתנאי שבה עכברים אינם נמצאים בסיכון עקב גרורות רבות-איבר, מודל הזרקה לוריד פורטל פותחתה. מודלי הזרקת Intraportal שמשו בעבר כדי ללמוד גרורות בכבד של שורות תאי המעי גס 55,56 ומלנומה 16; כאן אנו מתארים יישום של זריקת intraportal מודל גרורות תאים סרטניים חלב syngeneic. ניתן להשתמש במודל זה כדי ללמודבשלבים מאוחרים יותר של מפל גרורתי כולל extravasation תאי סרטן השד וזריעה, החלטות גורל תאים סרטניים לגבי מוות / התפשטות / תרדמת, ואת תולדה לתוך נגעים גלוי. במודל זה, שורות תאים סרטניים חלב syngeneic מוזרקות דרך וריד הפורטל של עכברות חיסוניות מוסמכות Balb / c, שיטה המספק תאים סרטניים ראשית וישירות אל הכבד ללא הסרת הטחול. כדי לפתח מודל זה, השימוש של שורות תאים סרטניים ארבעה החלב כי טווח יכולת גרורתי שלהם מהנמוך לגבוה הועסקו: D2.OR, D2A1, ו 4T1, ו מועסקים D2A1 מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (D2A1-GFP) כדי לחקור מוקדם בזמן נקודות לאחר הזרקת תאים סרטניים. 4T1 היא שורת תאים גרורתי מאוד נגזר הגידול 410.4 שהתעוררו ספונטני עכבר MMTV + Balb / c נקבה 36,37 גרורות אל הריאות, הכבד, המוח, ואת עצם גידולים ראשוניים כרית שומן החלב 39,57,58. D2A1 תאים סרטניים werהדואר גם במקור נגזר גידול חלב ספונטני לארח Balb / c לאחר ההשתלה של תאי גולת המכתשית hyperplastic D2, והם אשרו להיות גרורתי מן הגידול הראשוני אל הריאות 59,60. D2.OR תאים סרטניים הם קו אחותו הלא-גרורתי לקו D2A1, ואף שהם לברוח הגידול הראשוני ומגיעים אתרים משניים, שהם כמעט ולא להקים גרורות מרוחקות 60,61. בנוסף, חשוב להימנע שימוש בתרופות לטיפול בכאב מועסק בדרך כלל כולל תרופות סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) במהלך או לאחר ההליך הכירורגי. יש NSAIDs פעילות אנטי גידולית בסרטן השד מסוימים 62-65, וכמה סוגים של NSAIDs מעלה את הסיכון לרעילות כבדית 66,67, פוטנציאל להתפשר בחקר גרורות בכבד ואת נישה גרורתי בכבד. יתר על כן, מחקרים מראים כי NSAIDs משפיע ישירות על המיקרו-סביבת הרקמות, הפחתת שלוחה פרו-גרורתיחלבונים מטריצה racellular tenascin-C 68 ו קולגן סיבי 62,65. לחלופין, את השימוש של נגזר אופיואידים, עצירות, שימש בגלל יעילותו בניהול מכרסם כאב 69 ובשל חוסר ראיות שיש אופיואידים פעילות אנטי גידולית 70. מודל הזרקת פורטל וריד זו הוטב כרכי הזרקה קטנים של 5 - 10 μl כדי למנוע ניזק מיותר אל הכבד. המודל היה מותאם גם לכלול מחטים עם קוטר קטן יותר (≥ 32 מד) ושימוש גזה עוצר דמום מיד לאחר ההזרקה כדי להקטין את איבוד הדם במהלך ההליך. בניגוד פרמטרי הזרקה המותאם אלה, מספרים סלולריים צריכים להיקבע על בסיס פרטני, מבוססים על פוטנציאל tumorigenic של הקו הסלולרי. עם זאת, החל מ ≤ 10,000 תאים / הזרקה עבור מחקרים ארוך טווח מומלץ. עבור נקודות קצה קצרות (למשל, 24 שעות לאחר הזרקה) הרבה יותר תאים סרטניים (למשל,1 x 10 5 - 1 x 10 6) ניתן להשתמש אם מוצדק. לסיכום, מודל ההזרקה לוריד פורטל המפורט כאן מהווה כלי שימושי לחקר גרורות סרטן השד בכבד עוקף מספר המגבלות של מודלים גרורים בכבד אחרים. מודל זה הופך לפשוט מחקר של extravasation תאים סרטניים, זריעה, החלטות גורל מוקדמות של הישרדות, התפשטות, תרדמת, ואת תולדה גרורתית מארחי murine מוסמכות חיסוניים.

<table><tbody><tr><td>מזרק 1 מ"ל עם מזרק BD מחט 26 מד</td><td></td><td></td><td>309597 להזרקת בופרנורפין תת עורית; היזהר</td>כי</tr><tr><td>רפידות הכנה לאלכוהול</td> חדות <td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-669-62</td><td>לניקוי הבטן לפני חתך כירורגי</td></tr><tr><td>ספוגים לכל מטרה,</td><td>קנדל</td> סטרילי <td>8044</td><td>4 אינץ' x 4 אינץ', השתמש במי מלח סטריליים כדי לשמור על המעי הגס והדק מוגן ולחות במהלך ניתוח</td></tr><tr><td>דמעות מלאכותיות</td><td>רוגבי</td><td>370114</td><td>שמן מינרלי 15%, וזלין לבן 83%; לשימוש להגנה על העיניים במהלך ניתוח</td></tr><tr><td>בופרנורפין הידרוכלוריד, 0.3 מ"ג/מ"ל</td><td>Mfg. מאת רקיט בנקיזר</td><td>NDC-12496-0757-1</td><td>שימוש ב-0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף, 1-2 פעמים ביום למשך 72 שעות, בהזרקה תת עורית</td></tr><tr><td>Bupivacaine HCl, 0.5% (5 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Mfg. על ידי Humira Inc</td><td>NDC-04091163-01</td><td>יש להשתמש ב-0.5%, 1x מיד לאחר הניתוח, 10 &mu; l הזרקה תת עורית במקום החתך&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן נגד CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td>שימוש באימונופלואורסצנציה מרובה כדי להוציא לויקוציטים בזיהוי מוקדים גרורתיים</td></tr><tr><td>Celox&trade; גזה המוסטטית מהירה</td><td>מוצרי Medtrade בע"מ</td><td>FG08839011</td><td>חתוך ל-5 מ"מ ו-2 חתיכות, השתמש כדי לעצור את זרימת הדם מווריד הפורטל בלחץ לאחר הזרקה</td></tr><tr><td>אפילטורי</td><td></td><td></td> כימי <td>השתמש להסרת שיער מאזור הניתוח; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>כלורהקסידין, תמיסה 2%</td><td>וטרינר אחד</td><td>1CHL008</td><td>היזהר אל תקבל כלורהקסידין בריריות או באוזניים של נוגדן</td></tr><tr><td>העכבר נגד CK18</td><td>Abcam</td><td>ab53118</td><td>השתמש באימונופלואורסצנציה מרובה לזיהוי מוקדים גרורתיים</td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה, סטרילי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-114</td><td>6 אינץ' פיר עץ 2 יח'/מעטפה</td></tr><tr>DMEM, בסיס מדיה לתרבית <td>תאים HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>בעל גלוקוז גבוה</td><td>לשימוש עם קווי תאי גידול חלב D2A1, D2.OR ו-4T1</td></tr><tr><td>מעקר</td><td></td><td></td> <td>חרוזי זכוכית יבשההשתמש בין ניתוחים לעיקור כלי נירוסטה, השתמש בזהירות, חם במיוחד; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>אתנול, תמיסה</td><td></td><td></td> של 70% <td>השתמש בזהירות דליק; השתמש לניקוי אזור כירורגי לפי הצורך; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td>תוסף מדיה לתרבית תאים לשימוש עם קווי תאי גידול חלב D2A1, D2.OR ו-4T1, שימוש ב-10% בגזה גבוהה של גלוקוז DMEM</td></tr><tr>, <td>קנדל</td><td>סטרילי</td><td>2146</td><td>2 אינץ' x 2 אינץ', השתמש טבול בתמיסה כלורהקסידין 2% לניקוי הבטן לפני חתך כירורגי</td></tr><tr><td>נוגדן חלבון פלואורסצנטי אנטי ירוק</td><td>וקטור מעבדות</td><td>BA0702</td><td>השתמש לצביעה עבור GFP מתויג D2A1 או קווי תאי גידול חלב אחרים</td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)</td> <td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>תוסף מדיה לתרבית תאים לשימוש עם קווי תאי גידול חלב D2A1, D2.OR ו-4T1, שימוש ב-2 מ"מ (1x) בכרית חימום DMEM עם גלוקוז גבוה</td></tr><tr><td>, x 2 - 3</td><td></td><td></td><td>השתמש לשמירה על חום הגוף במהלך ניתוח והתאוששות; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td>לשימוש בתרבית תאים לספירת תאים</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td> המוסטטיים <td>נירוסטה; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>נוגדן נגד Heppar-1</td><td>Dako</td><td>M7158</td><td>שימוש באימונופלואורסצנציה מולטיפלקס כדי לא לכלול הפטוציטים בזיהוי מוקדים גרורתיים</td></tr><tr><td>מזרק אינסולין, 0.3 מ"ל, BD</td><td>&nbsp מד 29; &nbsp;</td><td>324702</td><td>להזרקת בופיבקאין באתר התפר; היזהר בזהירות, חד</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>פיראמל</td><td>NDC-66794-017-25</td><td>ניתן ב-2.5%</td></tr> <tr><td>וופורייזר איזופלורן</td><td>VetEquip 911103</td><td></td><td>השתמש בזהירות, מאדה גזי הרדמה</td></tr><tr>מקור<td>אור</td><td></td><td></td><td>שימוש להדמיית השדה הכירורגי; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>פורמלין ניטרלי חוצץ, 10%</td> <td>Anatech בע"מ.</td><td>135</td><td>השתמש בזהירות, רעיל; השתמש כמקבע רקמות לנקודות קצה של גרורות והערכת עומס גרורתי על ידי היסטולוגיה</td></tr><tr><td>Opal&trade; ערכת fIHC ב-4 צבעים</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL794001KT</td><td>השתמש עבור אימונופלואורסצנציה מרובה של Heppar-1 / CD45 / CK18 לאיתור גרורות בכבד עכברים</td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td> הפעלה <td>נירוסטה; השתמש בזהירות, חד; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>תוסף מדיה לתרבית תאים לשימוש עם קווי תאי גידול חלב D2A1, D2.OR ו-4T1, השתמש ב-1x ב-DMEM גלוקוז גבוה</td></tr><tr><td>גלוקוז פוספט מלוח-מלח</td><td></td><td></td><td>השתמש ב-1x להשעיית תאי גידול לפני ההזרקה, מספר ספקים</td></tr><tr><td>מזרק מחט נשלף, 25 &mu; l, דגם 1702</td><td>המילטון</td><td>7654-01</td><td>להזרקת וריד פורטל; היזהר באופן חלקי בזמן עבודה עם מחטים עמוסות בתאי גידול, חד כאשר המחט מחוברת</td></tr><tr><td>ידית</td><td></td><td></td> אזמל <td>נירוסטה; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>להב אזמל, #15</td><td></td><td></td><td>פלדת פחמן, סטרילי, גודל 15; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>מחטים נשלפות רכזת קטנה, 32 מד</td><td>המילטון</td><td>7803-04</td><td>להזרקת וריד פורטל, אורך 1 אינץ', סגנון נקודה 4, 12 מעלות; ניתן להשתמש גם במחטים רב פעמיות זווית, 33 עד 34; השתמש בזהירות, באופן חלקי תוך כדי עבודה עם מחטים טעונות תאי גידול, נתרן</td></tr><tr><td>היפוכלוריט</td><td></td><td></td> חד <td>השתמש בזהירות, קורוזיבי; השתמש ב 10% לחיטוי סביבת עבודה ומשטחים, ספקים מרובים</td></tr><tr><td>Sterile Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>0.9% NaCl תמיסה; לחלופין, יכול להיות כפפות כירורגיות מסוננות תוצרת בית וסטרילית</td></tr><tr><td>, סטרילי</td><td></td><td></td><td>ספקים</td></tr> <tr><td>מרוביםתפרים, סטריליים&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 27 אינץ' מצופה ויקריל עם 22 מ"מ 1/2c מחט אתסגסוגת מתחדדת; השתמש בזהירות,</td></tr><tr><td>מכונת הרדמה ניידת לשולחן</td> חד <td>VetEquip</td><td>901801</td><td>השתמש עם וופורייזר איזופלורן להרדמת עכבר</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td> חבישת אגודל <td>נירוסטה, משונן, קהה; ספקים מרובים</td></tr><tr><td>וילונות מגבת, סטרילי&nbsp;</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>18 אינץ' x 26 אינץ', לכיסוי כרית חימום ולספק סביבת עבודה סטרילית במהלך הניתוח</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>לשימוש בתרבית תאים להערכת כדאיות, השתמש 1:1 עם תאים ב-1x PBS</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0.05% (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>שימוש בתרבית תאים לניתוק תאי גידול מלוחות תרבית רקמות</td></tr></tbody></table>

מודל הזרקת portal vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה מסרטן בנשים ברחבי העולם. גרורות בכבד מעורב למעלה מ 30% מהמקרים עם גרורות סרטן השד, וכתוצאה מכך תוצאות העניים עם שיעורי ההישרדות החציוני של רק 4.8 - 15 חודשים. במודלים של מכרסמים הנוכחיים של גרורות סרטן השד, כולל xenograft תא גידול הראשוני ומודלי גידול ספונטניים, לעתים רחוקות גרורים בכבד. Intracardiac ומודלים הזרקת intrasplenic אל לגרום גרורות בכבד, אולם ניתן מבולבל מודלים אלה על ידי גרורות המשני באתר במקביל, או על ידי חסינות נפגעת כתוצאה הסרת הטחול להימנע צמיחת גידולים באזור הזריקה. כדי לענות על הצורך של מודלים גרורים בכבד השתפרו, שיטת הזרקת murine פורטל וריד המספקת תאים סרטניים ראשית וישירות אל כבד פותחתה. מודל זה מספק תאים סרטניים בכבד ללא סיבוכים של גרורות בו-זמניות באיברים אחרים או הסרה של הטחול. ההצטרפותפרוטוקול פורטל וריד imized מעסיק כרכי הזרקה קטנים של 5 - 10 μl, ≥ 32 מחטי מד, ו גזה עוצר דמום באזור הזריקה לשלוט על אובדן דם. גישת ההזרקה לוריד פורטל Balb / c עכברות באמצעות שלוש שורות גידול חלב syngeneic משתנה פוטנציאל גרורתי נבדק; תאי 4T1 גבוהים גרורתי, מתון-גרורתי תאי D2A1, ותאי D2.OR נמוכים גרורתי. ריכוזי ≤ 10,000 תאים / תוצאות ההזרקה חביון של ~ 20 - 40 ימים לפיתוח של גרורות בכבד עם קווי גרורתי 4T1 ו D2A1 גבוה, ו&gt; 55 ימים עבור הקו D2.OR פחות אגרסיבי. מודל זה מייצג כלי חשוב ללמוד גרורות סרטן השד אל הכבד, ועשויים לחול על סוגי סרטן אחרים כי גרורות לעיתים קרובות אל הכבד כולל המעי הגס וסרטן הלבלב אדנוקרצינומה.

מודל ההזרקה לוריד פורטל, שבו תאים סרטניים מועברים ישירות אל הכבד באמצעות הליך כירורגי, מאפשר הזרקה של תאי גידול לתוך וריד השער. בתנאי חיטוי, ב עכבר הרדים, מצוין ~ חתך ניתוחי 1 אינץ נעשה בצד השמאלי של העכבר בין המטוסים החציוני ועל sagittal, החל רק מעל למישור של הפטמה בלוטת חלב מפשעתי הרביעית וכלה בדיוק מתחת לצלעות . המעיים גדולים וקטנים הם משכו בעדינות דרך חתך לספק הדמיה של וריד השער (איור 1 א). זיהוי אנטומי מדויק של וריד פורטל הזרקה תוך-פורטל מוצלח יכול להיות מאושר על ידי תרגול פרוטוקול הזרקת בדיו או צבע דומה. הזרקת נכון דרך וריד הפורטל תגרום הדיו מועבר מיד ובאופן ספציפי אל הכבד, ולא לגרום התפשטות דיו הודו אל הריאות (figuמחדש 1B). יתר על כן, באמצעות העכבר D2A1 תאים החלב הגידול מתויג עם GFP, פיזור של תאים סרטניים בתוך הכבד ניכר בגיל תשעים דקות לאחר ההזרקה, המאשר משלוח הזרקה לווריד פורטל אל הכבד (תרשים 1C). בהגדלה גבוהה יותר מתברר כי ב 90 דקות לאחר ההזרקה, תאים סרטניים נמצאים בתוך sinusoids, כמו גם בתוך parenchyma הכבד בסמיכות השלשות פורטל, שם הדם פורטל וריד נכנס הכבד (תרשים 1C). נתונים אלה מראים כי extravasation גידול התא הפעיל מתרחש ב 90 דקות הזרקת תא שלאחר הגידול. יחדיו, נתונים אלה מאשרים כי מודל ההזרקה לוריד פורטל מספק את עוצמת הזריקה ישירות אל הכבד, עם תאי דיו או גידול פזור הכבדה אין תחבורה ניכרת של נפח הזרקה אל הריאות. כדי להעריך חוסנו של המודל הזרקה לווריד פורטל, שלושה separאכול שורות תאים סרטניים חלב עכבר syngeneic נבדקו בעכברי Balb / c נקבה בוגרת. קווי גידול חלב אלה נבחרו על סמך ההתנהגות המאופיינת שלהם במודלי כרית שומן חלב וכוללים את קו 4T1 תאים אגרסיווי גרורתי מאוד, קו D2A1 גרורתי פחות אגרסיווי, וקו D2.OR הנמוך / לא גרורתי 37,61,73 , 74. 2,000 ו -10,000 תאים לכל הזרקה נבדקו ללא הבדלים בולטים בזמן להתפתחות גרורה גלוי עם ריכוזי תא הנמוכים אלה. עבור מחקרים אלה סמנים פונדקאיים של גרורות שמשו כגון חוסר טיפוח, חיוורון, וירידה במשקל כדי להצדיק necropsy, שעליו קיומו או אי קיומו של גרורות בכבד אושר על ידי הערכה חזותית של הכבד ואיברים אחרים כדי לאשר משלוח תוך-פורטל . נתונים אלה מאשרים דיווחים קודמים כי שורות תאי 4T1 ו D2A1 לייצג קווי גידול חלב אגרסיביים יותר, שיעורי הישרדות ללא גרורות קצרות הם נצפו לעומת עכברים שהוזרקועם קו D2.OR פחות אגרסיבי (איור 2 א). עכברים הוזרקו תאים סרטניים 4T1 או D2A1 פיתח גרורות בכבד גלויה על ידי ~ 30 - 40 ימים לאחר ההזרקה, וכמה פיתח גרורות מוקדם ככל 18 ימים לאחר ההזרקה (איור 2 א), ואילו רק עכבר אחד הוזרקו תאים D2.OR היה גרורה בכבד גלוי מפותח עד סוף המחקר, אשר היה 60 - 65 ימי הזרקת תא שלאחר גידול. גרורות לאחר מכן אושרו על ידי חתך דרך הכבד ב 250 מיקרומטר רמות וניתוח hematoxylin ו eosin (H &amp; E) סעיפים מוכתם (תרשים 2B-D). בנוסף לגילוי גרור גלוי בכבד העכבר, מודל וריד שער יכול גם להיות מנוצל ללימוד אירועים קודמים במפל גרורתי כולל זיהוי של תאים בודדים / צבירי תאים הבאים extravasation, היווצרות של נגעי מייקרו גרורתי. immunofluorescence מכתים Multiplex שמשכדי לזהות 4T1, D2A1, ותאי הגידול החלב D2.OR בכבד כשהם נוכחים כמו תאים בודדים או נגעים מיקרו-גרורות, כמו H &amp; E אינה מספיקה כדי לאשר את קיומו של נגעים קטנים. 3A איור מראה Balb / c עכבר כבד נציג עם מוקדים המשוערת micrometastatic של תאי D2A1 גידול כי הם חיוביים עבור CK18 קרטין אפיתל, שליליים על CD45 סמן הפאן החיסוני, ושליליים עבור סמן hepatocyte Heppar-1. Hepatocytes גם להכתים חיובי עבור CK18, הדבר מחייב שימוש Heppar-1 בלוח מכתים זה. הערה חשובה אחת היא שתא מרת צינור אפיתל וכבד ובתאים להכתים חיובי עבור CK18, מחייב אפליה זהירה בין תאים סרטניים ודרכי מרה, במיוחד כאשר מעריכים אזורי periportal (איור 3 א). חלופה זמנית immunofluorescence לזהות תאים בודדים יופצו מוקדי micrometastatic היא לנצל קווי גידול חלב syngeneic מתויגים עם פלואורסצנטי ירוק משופרחלבון (eGFP) ו / או בלוציפראז ולבצע IHC עבור התג (תרשים 1C). בשל החיסוני של eGFP, בלוציפראז, וחלבונים אחרים, זה חיוני כדי להשתמש במודלים של עכברים אשר tolerized לחלבונים אלה, כגון עכבר "זוהר הראש" מוסמכות החיסונית רומן מבטא eGFP ו בלוציפראז בבלוטת יותרת המוח הקדמית 75. עבור זיהוי נגעים macrometastatic קווי syngeneic מתויגות כגון קו הגידול D2A1, את immunofluorescence זמנית CK18 / Heppar-1 / CD45 הוא אידיאלי (איור 3 ב). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig1.jpg"> איור 1: הזרקת Portal Vein מספקת תאים סרטניים ישירות אל הכבד. א) הזרקה לווריד פורטל; החתך הוא עשה בין החציון ומטוסי sagittal שמאל, מלמעלה המטוס של הפטמה בלוטת חלב מפשעתי הרביעית וכלה ממש מתחת רי כלוב ב. B) Balb / c כבד עם הזרקת PBS (משמאל). בעקבות הזרקת דיו הודו דרך וריד הפורטל, הכבד (באמצע) אבל לא הריאה (מימין) תופס דיו. C) תמונות בסעיף נציג דקה של תאים סרטניים החלב עכבר D2A1 מתויג עם GFP בתוך הכבד עכבר Balb / c ב 90 דקות לאחר ההזרקה של 1 x 10 6 תאים סרטניים דרך וריד הפורטל. כבדי תוקנו בפורמלין, פרפין מוטבע, מחולק, ומוכתמת עם נוגדן אנטי- GFP לגילוי תאים סרטניים. פנל עליון מראה תאים סרטניים צבועים בחום כהה (חיצים) המפוזרים בתוך הכבד, כוכבית מציינת מכתים hepatocyte הלא ספציפית סביב ורידים מרכזיים; סרגל = 300 מיקרומטר. פנלים תחתונים מראים תמונות נציג של תאים סרטניים ב 90 דקות לאחר ההזרקה עדיין קשורה קשר הדוק עם כלי דם; סרגל = 50 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig2.jpg"> איור 2: תולדה של שורות תאים סרטניים עכבר חלב בכבד בעקבות הזרקת Portal Vein. א) עקום Kaplan-Meier מראים שיעורי הישרדות ללא-גרורות עכברים שהוזרק עם 2,000-10,000 4T1, D2A1, או תאים סרטניים חלב עכבר D2.OR. עכברים הוזרקו תאים סרטניים וכן פיקוח על סימנים של גרורות כולל חוסר הטיפוח, עיניו בהירות, שינויים במשקל. גרורה אושרה בשעת necropsy ועל ידי H &amp; E על סעיפים היסטולוגית של הכבדים. N = 2 4T1 2,000 תאים; 2 4T1 10,000 תאים. N = 2 D2A1 2,000 תאים; 3 D2A1 10,000 תאים. N = 3 D2.OR 2,000 תאים; 3 D2.OR 10,000 תאים. נציג H &amp; E תמונות של B) 4T1 נגעים ב 21 ימים לאחר ההזרקה של 10,000 תאים, C) נגעים D2A1 ב 26 ימים לאחר ההזרקה של 10,000 תאים סרטניים, ו- D) D2.OR נגעים ב59 ימים לאחר הזרקה של 10,000 תאים; סולם ברים = 75 מיקרומטר. נגעים דומים נצפו כאשר 2,000 4T1 או D2A1 תאים סרטניים הוזרקו. אין נגעים התגלו עם 2,000 תאים D2.OR. אין ראיות של גרורות באיברים אחרים או החתך באתר כירורגית באו לידי ביטוי בכל עכבר על מחקרים אלה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig3.jpg"> איור 3: איתור של תאים בודדים גרורתי נגעים בכבד העכבר באמצעות Multiplex Immunofluorescence. א) immunofluorescence זמנית נציג של תאים סרטניים D2A1 בתוך הכבד עכבר Balb / c ב 90 דקות לאחר ההזרקה באמצעות מודל הזרקה לווריד פורטל. המכתים נעשה באמצעות ערכה זמנית. משמאל לימין תערוכות DAPI; CD45 לציון לויקוציטים; Heppar-1 עד מרץk hepatocytes; ו CK18 לסמן תאים סרטניים, hepatocytes, אפיתל צינור המרה. תמונה ממוזגת מציגה מקבץ משוער של CK18 + Heppar-1 - CD45 - התאים סרטניים D2A1 קשר הדוק עם שלישיית פורטל. חץ = תאים סרטניים D2A1, כוכבית = האפיתל מר צינור; סרגל = 25 מיקרומטר. ב) נגע גרורתי נציג הגלוי D2A1 באמצעות אותה חלונית מכתימה כמו תאים סרטניים א הם CK18 + ואילו hepatocytes סמוך CK18 + Heppar-1 +; סרגל = 25 מיקרומטר. תמונות נתפסו על מיקרוסקופ עם 20 x 0.8, 40 x 1.3, ו -60 x 1.4 מטרות מצלמת CCD, באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

פותח הליך כירורגי להעברת תאי גידול חלב לכבד העכברים באמצעות הזרקת וריד פורטלי. מודל זה מאפשר לחקור שלבים מאוחרים של גרורות בכבד במארח בעל יכולת חיסונית מלאה, כולל אקסטרוואזציה של תאי גידול, זריעה, הישרדות וצמיחה גרורתית בכבד.

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר תאי גידול ישירות לכבד העכברים לצורך מידול ניסיוני של גרורות בכבד סרטן השד. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את השלבים המאוחרים יותר של המפל הגרורתי בכבד העכבר. כולל אקסטרוואזציה של תאי סרטן השד, זריעה, מוות, התפשטות והחלטות תרדמה, כמו גם צמיחה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מעבירה תאי גידול ישירות לכבד ללא הסרת הטחול או גרורות מרובות איברים במקביל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הזרקת וריד הפורטל דורשת מניפולציות מדויקות המסתמכות על מעקב אנטומי ישיר. תסייע לי בהליך זה אלכסנדרה קווקנבוש, סטודנטית לתואר שני במעבדתו של פפרסאדין.לפני תחילת ההליך, נגב את כל משטחי אזור הניתוח עם 10% אקונומיקה. שעה לפני הזריקות, טפלו בעכברים נקבות בנות שמונה עד 15 שבועות עם 100 מיקרוליטר של משככי כאבים תת עוריים לטיפול בכאב. מרחו משחה על עיני החיה.לאחר מכן, הניחו את העכברים במצב שכיבה ואשרו את רמת ההרגעה המתאימה על ידי צביטת הבוהן. לאחר מכן, יש לחטא את אזורי הניתוח והסביבה של החיה, כולל הזנב, עם שלושה מגבונים סטריליים לסירוגין ספוגים בגזה 2%, ושני מגבונים להכנת אלכוהול. לאחר ניגוב הכלורהקסידין האחרון, השתמש באזמל סטרילי כדי לבצע חתך של סנטימטר אחד בעור בין המישור החציוני והמישור הסגיטלי בצד שמאל של העכבר, החל ממש מתחת לצלעות ומסתיים מעל פטמת בלוטת החלב המפשעתית הרביעית, ואחריו חתך דומה של סנטימטר אחד דרך הצפק.כעת פיפטה את תאי הגידול למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להשהות מחדש את תמיסת התאים, וטען מזרק מחט נשלף של 25 מיקרוליטר, המצויד במחט בגודל 32, עם 10 מיקרוליטר מהתאים. לחץ על הבוכנה עד שהתאים נמצאים בקצה המחט, והבוכנה נמצאת בנפח המתאים להזרקה. נגב את החלק החיצוני של המחט הטעונה עם כרית אלכוהול סטרילית כדי להסיר תאי גידול חיצוניים, תוך הקפדה על הימנעות ממקלות מחט.לאחר מכן, החזיקו את העור ואת רירית הצפק של הצד החציוני של החתך בעזרת המלקחיים, השתמשו בצמר גפן סטרילי כדי להעביר בזהירות את המעי הגס והדק על גזה סטרילית, ספוגה במי מלח סטריליים. מכסים את האיברים הפנימיים בגזה ספוגה במי מלח כדי לשמור על הלחות והסטריליות הפנימית. כאשר וריד הפורטל גלוי, בקש מעוזר להחזיק בעדינות את המעיים כדי לחשוף את וריד הפורטל בעזרת צמר גפן סטרילי ולהכניס את המחט שלושה עד חמישה מילימטרים לווריד הפורטל, כ -10 מילימטרים מתחת לכבד, בזווית של פחות מ -5 מעלות, צד משופע כלפי מעלה.הזרקו לאט את הנפח המלא של תאי הגידול, ואפשרו לדם לזרום מעבר לראש המחט למשך מספר שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של תאי הגידול החוצה מהווריד. מכיוון שההדמיה, הגישה וההזרקה הנכונה לווריד הפורטלי היא חיונית, קח את הזמן כדי להבטיח שהמיקום של וריד הפורטל, ביחס למחט, משביע רצון לפני ניסיון ההזרקה. לאחר הזרקת כל התאים, הסר את המחט ובמקביל הפעלת לחץ עדין על הווריד בעזרת אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה.לאחר מכן השתמש באפליקטור סטרילי חדש עם קצה כותנה כדי להחזיק חתיכה של 0.5 עד סנטימטר מרובע של גזה המוסטטית מעל אתר ההזרקה. לאחר חמש דקות, הרם בזהירות את הגזה כדי להעריך את סגירת הווריד. כאשר זרימת הדם נעצרה לחלוטין, הסר את הגזה והחזיר את המעיים לחלל הבטן.בעזרת דפוס תפר רציף או קטוע פשוט, סגור את רירית הצפק עם תפר סטרילי ארבע אפס ויקריל ומתחדד. לאחר סגירת העור באותו אופן, יש להזריק 100 מיקרוליטר של חומר הרדמה מקומי לאורך מקום החתך, ואחריו אספקה תת עורית של 0.5 מיליליטר מי מלח סטריליים. ניתן לאשר את הזיהוי האנטומי המדויק של וריד הפורטל והזרקה תוך-פורטלית מוצלחת על ידי תרגול פרוטוקול ההזרקה עם דיו הודי או צבע דומה.בהזרקה נכונה דרך וריד הפורטל, וכתוצאה מכך הדיו מועבר באופן מיידי וספציפי לכבד מבלי להתפשט לריאות. באמצעות תאי גידול זיכרון של עכברים המתויגים ב-GFP, פיזור תאי הגידול ברחבי הכבד ניכר 90 דקות לאחר ההזרקה, מה שמאשר אספקה מוצלחת של וריד הפורטל לכבד. תאי הגידול נמצאים בתוך הסינוסואידים כמו גם בתוך פרנכימת הכבד בסמיכות לשלשות הפורטל, שם דם וריד הפורטל נכנס לכבד, מה שמרמז על כך שאקסטרוואזציה פעילה של תאי גידול מתרחשת בשלב זה.כפי שמודגם על ידי עקומות הישרדות אלה, העברת וריד הפורטל המאמצת של קווי תאי גידול חלב אגרסיביים מביאה לשיעורי הישרדות קצרים יותר ללא גרורות בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם קו תאי גידול פחות אגרסיבי. ניתן לאשר גרורות מבעלי חיים אלה על ידי חתך דרך הכבד ברמות של 250 מיקרון ולאחר מכן ניתוח H&E של הדגימות. יתר על כן, ניתוח אימונופלואורסצנטי שימושי לניתוחי נגעים גרורתיים מיקרו ומקרו של קווים סינגניים לא מתויגים כגון קו הגידול D2A1, שהם CD45 שלילי, Heppar-1 שלילי ו-CK18 חיובי כפי שמודגם בתמונות מייצגות אלה.לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 12-14 דקות לכל עכבר, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להקדיש את הזמן הדרוש כדי לדמיין כראוי ולגשת לווריד הפורטל לפני ניסיון ההזרקה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיה תוך-חיונית לאחר הזרקת תאי גידול כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו תאי הגידול מתקשרים עם סביבת הלוברמיקרו.עם פיתוחה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הגרורות לחקור שלבים מאוחרים יותר של המפל הגרורתי של סוגי סרטן שונים בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב היכן לבצע את החתך הכירורגי, כיצד להזיז בעדינות את האיברים הפנימיים כדי לגשת לווריד הפורטל וכיצד לבצע את ההזרקה התוך-פורטלית. אל תשכח, עבודה עם מזרקים עמוסים בתאי גידול עלולה להיות מסוכנת, וכי יש לנקוט באמצעי זהירות כדי להימנע מדקירות מחט בזמן ביצוע הליך זה.

a-portal-vein-injection-model-to-study-liver-metastasis-breast

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מאמר זה מתאר את הליך הגיוס של orthotopic גידולים בכבד bioluminescent בעכברים, ניתוח בדיעבד של הגידול מוגבל בכבד באמצעות הארה חיים שלמים הדמיה הגוף.

Tumour Murine Bioluminescent כבדית דגם

סרטון זה מתאר הליך כירורגי להעברת תאי גידול בחלב לכבד המורין באמצעות הזרקת ורידים פורטליים. מודל זה מאפשר לחקור שלבים מאוחרים של גרורות בכבד.

הזרקת ורידים פורטליים: שיטה לחקר גרורות סרטניות לכבד

סרטון זה מתאר טכניקה של הזרקת תאים סרטניים מסומנים באמצעות הזרקת ורידים בזנב למודל עכבר. אנו עוקבים גם אחר היווצרות גרורות וגדילה של סרטן השד באמצעות הדמיית בעלי חיים חיים בזמן אמת in vivo.

הזרקת ורידים בזנב: שיטה למתן תאים סרטניים למחקרים גרורתיים במודל עכבר

מודל פרה קליני, עכברי של גרורות בכבד מבוצע באמצעות טכניקת הזרקת hemispleen.

דגם Murine פרה של גרורות כבדית

היכולת של שיבוטים גרורתיים ליישב אתרים מרוחקים תלויה ביכולת ההתפשטות שלהם ו/או ביכולתם לשרוד במיקרו-סביבה המארחת ללא התפשטות משמעותית. כאן, אנו מציגים מודל של בעלי חיים המאפשר הדמיה כמותית של שני סוגי ההתיישבות בכבד על ידי שיבוטים גרורתיים.

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

אנו מתארים בפירוט קלינית המעי הגס הרלבנטי סרטן הכבד גרורות (CRLM) הגידול מודל ההשפעה של איסכמיה של הכבד reperfusion (I/R) גידול גרורות. מודל זה יכול לעזור להבין טוב יותר את המנגנונים בבסיס קידום הניתוח המושרה של צמיחה גרורתית הכבד.

מודל מורנה של גידולים גרורות בכבד בהגדרה של איסכמיה Reperfusion פציעה

עבודה זו מוגדרות מראש פרוטוקול מתקדם כדי להעריך במדויק את טעינת הגידול על ידי זיהוי של חלבון פלורסנט ירוק אותות biלומינסנציה, כמו גם שילוב של טכניקת גילוי מולקולרי כמותי.

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

אנו מתארים מודל עכבר xenograft של גרורות במוח של סרטן השד שנוצרו באמצעות הזרקת ורידים בזנב של קו תאי סרטן שד דלקתי מוגבר אנדוגניים HER2.

מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים מסרטן המעי הגס (CRC) יוצרת גרורות כבד עשירות בסטרומה. מודל עכבר זה של גרורות כבד CRC מייצג כלי שימושי לחקר אינטראקציות בין גידול לסטרומה ולפיתוח טיפולים חדשניים המכוונים לסטרומה כגון טיפולים גנטיים בתיווך וירוסים הקשורים לאדנו.

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים לסרטן המעי הגס לחקר סטרומה גרורות בכבד

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

חקור הזרקת תאי גידול לוריד הפורטל בעכברים לחקר גרורות כבד בסרטן השד. שיטה זו מאפשרת מחקר שלבים מאוחרים במטסטזיס בכבד תוך שמירה על מערכת החיסון.

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

גלה סרטונים נוספים