2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

הקבוצה שלנו עובדת על האינטראקציה בין תא למטריצה חוץ-תאית. תאים יכולים לייצר אך גם יכולים לפגוע באלמנט המטריצה החוץ-תאית. פירוק המטריצה יכול להתרחש במהלך תהליכים פיזיולוגיים אך גם בתהליכים פתולוגיים, כגון נוירודגנזה ופלישה לגידול תאי.

ברמה התאית אנו יכולים להבחין בנוכחות של מבנה מבוסס אקטין המעורב בפירוק המטריצה. והמבנים האלה נקראים פולשים. Invadosome, זהו מונח כללי הכולל פודוזומים בתאים נורמליים ו-invadopodia בתאים סרטניים.

השפלה של פולש זה יכולה להיות מאורגנת בעצמה בצורות, נקודות, אגרגטים ורוזטות שונות. והפעילות של פולש זה מונעת על ידי מטאלופרוטאינאזות, כגון MMP2 ו-MT1-MMP. זה לא מזמן שהזוג, MMP2, MT1-MMP מופעל על ידי סיבי קולגן מסוג 1.

כדי לחקור את פעילותם של פולשים, נעשה שימוש בבדיקת זימוגרפיה קלאסית באתר. אבל כדי לחקור את התפקיד וההשפעה של סיבי קולגן מסוג 1 בפולשים, החלטנו ליצור בדיקה חדשה. כדי לעשות זאת, יצרנו מטריצה מעורבת המורכבת מג'לטין וסיבי קולגן מסוג 1.

בסרט זה בחלק הראשון, אלויד הנרייט תראה לכם כיצד אנו מייצרים מטריצה מסוג זה. בחלק השני, זכריה אזוח'רי יראה לכם כיצד אנו מסוגלים למדוד את ההשפעה של סיבי קולגן מסוג 1 במורפולוגיה, היווצרות והפעלה של הפולשים. ובחלק האחרון, ג'ולי די מרינו תראה לכם כיצד אנו מתאימים בדיקת פלישת קולגן תלת מימדית.

אני אראה לך כיצד להכין מטריצה מעורבת המורכבת מג'לטין וסיבי קולגן מסוג 1. אני אעשה שני סוגים של מטריצה מעורבת. אחד לעשות את בדיקת הזימוגרפיה באתרה עם ג'לטין פלואורסצאין וקולגן מסוג 1 שאינו פלואורסצאין.

ועוד אחד שמאפשר לנו לדמיין את סיבי הקולגן עם ג'לטין שאינו פלואורסצאין וסיבי קולגן מסומנים. להכנת מטריצת הג'לטין, יש למנות 20 טיפות מיקרוליטר ג'לטין על פיסת פרפילם. מכסים כל טיפה בכיסוי זכוכית חיטוי.

יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ולהגן מפני אור. לקיבוע ג'לטין, יש ליטול 40 טיפות מיקרוליטר של 0.5% גלוטראלדהיד ב-PBS. בעזרת מלקחיים, העבירו כיסויים מצופים ג'לטין לכל טיפת גלוטרלדהיד.

יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות ולהגן מפני אור. קח צלחת תרבית תאים מרובת בארות ומלא כל באר ב -500 מיקרוליטר של PBS סטרילי 1X. בתום תקופת הדגירה, הניחו כל כיסוי, צד הג'לטין כלפי מעלה לכל באר.

שטפו את הכיסויים פעמיים ב-1X PBS למשך חמש דקות כל אחד. בשלב זה ניתן להשתמש בכיסויים לניסויים או לאחסן לשימוש מאוחר יותר. פיפטה 0.4 מ"ג למ"ל קולגן אחד לתוך צינור.

מוסיפים את הצבע הפלואורסצנטי לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למ"ל. מערבבים את התמיסה בצינור ודוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור. מדללים לנפח הסופי עם 1x DPBS ומוסיפים 500 מיקרוליטר מהתמיסה על גבי כיסויים מצופים ג'לטין בצלחת מרובת בארות.

דגירה במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפילמור קולגן. לאחר הדגירה הסר את עודפי הקולגן. הוסף תאים לנפח סופי של 500 מיקרוליטר ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס לפני הקיבוע.

ניתן לשנות סוג זה של מטריצות עם אלמנטים מטריציוניים אחרים כגון פיברונקטין, ויטרונקטין או קולגן מסוג IV. מצדי, אני אראה לך כיצד לבצע אימונופלואורסצנציה באמצעות Tks5, סמן של פולשים, וכיצד לכמת פולשים ליניאריים על כיסויים מצופים קולגן מסוג 1. אנו יכולים להציג את התוצאות לפי מספר התאים הקיימים בפולשים ליניאריים, אך גם אנו יכולים להציג את מספר המבנים בכל תא.

תקן את הכיסויים למשך 10 דקות ב -500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ב- PBS. שטפו פעמיים עם 1x PBS וחודרו את התאים עם 0.2% Triton X-100 ב-1x PBS למשך 10 דקות. Aliquot 50 טיפות מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית ב-4% BSA ב-1x PBS על פיסת פרפילם.

הניחו כל כיסוי על טיפה. דגירה למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני האור. שטפו את הכיסויים פעמיים עם 1x PBS ודגרו על כיסויים בנוגדנים משניים, קולואידין וצבע Hoechst למשך 30 דקות מוגנים מפני אור.

לאחר הדגירה יש לשטוף פעמיים עם 1x PBS, ולאחר מכן מים מזוקקים להסרת מלחים. הרכיב כיסויים על מגלשת זכוכית עם מדיום הרכבה מפולימר. הניחו לשקופית להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה.

לניתוח התמונה רכשו תמונה של אקטין ו-Tks5 ברצף באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כדי לכמת את הגודל והמספר של פולשים ליניאריים לתא, השתמש בתוכנת ImageJ ובמאקרו המצורף. תחילה הפעל את המאקרו ב-ImageJ ופתח את תמונת האקטין.

לאחר מכן, פתח את תמונת Tks5. הגדר את הסף והחל את המאקרו. התוצאות המנותחות יופיעו בשתי טבלאות.

מספר הפולשים הליניאריים לתא ומידע אחר כגון השטח באחוזים המשמשים פולשים ליניאריים בתא יופיעו בטבלת הסיכום. גודלו של כל פולש ליניארי יופיע בטבלת התוצאות. לאחר כימות התמונות, אנו יכולים להציג את התוצאות על ידי הצגת מספר המבנים לתא.

לכן, מצדי, אנו מאמצים שיטה כדי להדגים את נוכחותם של פולשים ליניאריים בממד השלישי. הבנו שהג'ל מורכב רק מסיבי קולגן אחד ובדיקה זו משמשת להערכת פלישת התאים בהקשר של קולגן אחד. הכן תמיסת קולגן מסוג 1 על קרח בריכוז סופי של שני מ"ג למ"ל.

הוסף את הצבע הפלואורסצנטי בריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. מערבבים את התמיסה ודוגרים על קרח למשך חמש דקות מוגנים מאור. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של 10x PBS קר כקרח.

לאחר מכן מוסיפים 6.25 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד קר כקרח. מוסיפים מים סטריליים כדי להשיג את הריכוז הנכון ומערבבים את התמיסה. הנח את תא Boyden מוסיף לתוך צלחת תרבית תאים מרובת בארות.

הוסף 100 מיקרוליטר קולגן תמיסה אחת לכל תוספת. כדי לפלמר את ג'ל הקולגן, דגרו את המנה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. הוסף מדיום תרבית תאים מועשר בסרום לכל באר והניח את התוספות במדיה.

זרע 30,000 תאים בחומר נטול סרום על גבי ג'ל הקולגן. כדי לתקן את התאים, הוסף תמיסת 4% פרפורמלדהיד לבאר ריקה. הסר את מדיום התא מהתוספת מבלי לגעת בג'ל הקולגן.

יש להניח את התוסף בבארות עם תמיסת 4% פרפורמלדהיד ולהוסיף תמיסת 4% פרפורמלדהיד נוספת על גבי ג'ל הקולגן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הקיבוע, הסר את תמיסת הפרפורמלדהיד 4% ושטוף עם 1x PBS.

לאחר הכביסה, ג'ל הקולגן צריך להיות שקוף. כעת התוספות מוכנות לאימונופלואורסצנטיות. ראשית מסננים את התוספות.

לאחר מכן הניחו את התוספות לבארות חדשות של צלחת הרב-בארות. כדי לחלחל לתאים, הוסף תמיסה של 0.2% Triton X-100 ב-1X PBS על גבי ג'ל הקולגן למשך 30 דקות. מסננים את התוספות.

יש לשטוף עם PBS 1X ולהוסיף תמיסת נוגדנים ראשונית על גבי ג'ל הקולגן למשך שעה אחת מוגנת מאור. יש להסיר את תמיסת הנוגדנים הראשונית, לשטוף עם 1X PBS ולדגור את ג'ל הקולגן בתמיסת הנוגדנים המשנית למשך 1.5 שעות מוגן מאור. שטפו את תמיסת הנוגדנים המשנית עם 1X PBS.

להכנת ג'ל הקולגן להרכבה, חותכים את קרום ההכנסה בעזרת אזמל. מניחים את ג'ל הקולגן המחובר לקרום בכלי תחתית זכוכית. חשוב שהחלק העליון של הג'ל יהיה במגע עם תחתית המנה.

הוסף מדיית הרכבה וכיסוי למעלה לתצפית מיקרוסקופית. בעזרת בדיקה זו, הדגמנו את תפקיד המפתח של קולטן DDR1 בפלישת התאים בג'ל קולגן אחד. בדיקה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך את ההשפעה של תרופות על פלישת תאים.

במחקר השונה שלנו, הראינו שרק הוספת אלמנט חדש של מטריצה חוץ-תאית באישור הפיזיולוגי שלה, כאן סיבי קולגן מסוג 1, יכולה לשנות את המורפולוגיה, את ההרכב המולקולרי ואת הפעילות של הפולשים. אז באמצעות המבחנים השונים שתוארו בסרט הזה, הדגמנו את קיומם של מבנים חדשים, ארגון חדש של פולשים שקראנו לו פולשים ליניאריים. אנו יוצרים מטריצות מורכבות ופיזיולוגיות יותר, ומאפשרים זיהוי של מסלולים חדשים הכוללים הוספת תאים, נדידה ופלישה.