פרוטוקול אופטימיזציה כדי לנתח הגליקוליזה מיטוכונדריאלי הנשימה לימפוציטים

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד במדויק גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בלימפוציטים באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאי (extracellular flux assay). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונו-מטבוליזם, כגון אילו שינויים מטבוליים חלים בתאי מערכת החיסון בעת הפעלה, דיפרנציאציה או במהלך מחלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח יעיל ובזמן אמת של פרופילים מטבוליים עבור למעלה מ-90 דגימות בו-זמנית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מטבוליזם של לימפוציטים, ניתן להחיל אותה גם על תאים אחרים, כולל תאים שאינם דבקים, הדורשים הוספה לפלטה עם הפרעה מינימלית לתפקודם. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו עשויים להתקשות מכיוון שלימפוציטים הם שבירים, ודורשים טיפול עדין כדי לשמר את תפקודם וחיוניותם. ביום שלפני הניסוי, הרימו את מחסנית החיישנים של מנתח הזרימה החוץ-תאית (extracellular flux analyzer) ומלאו כל באר בפלטת העזר ב-200 microliters של תמיסת כיול.

בשלב הבא, הורידו את המחסנית אל הפלטה, כך שהחיישנים יהיו טבולים בתמיסת הכיול, והדגירו את המחסנית באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ללא פחמן דו-חמצני או חנקן למשך הלילה. למחרת בבוקר, צפו כל באר בלוחית בדיקה בעלת 96 בארות ב-25 µL של תמיסת דבק והדגירו את הלוחית בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. בסיום ההדגרה, שאבו את הדבק ושטפו כל באר פעמיים עם 200 µL של מים סטריליים.

בזמן שהפלטה מתייבשת באוויר, הניחו מסננת תאים של 70 מיקרון מעל מבחנה קונית של 50 מיליליטר והעבירו את האיברים שנאספו אל המסננת. בעזרת הבוכנה של מזרק סטרילי של שלושה מיליליטר, מעכו את הרקמה דרך המסננת תוך שמירה על רטיבות המסנן והאיברים לאורך תהליך הריסוק על ידי הוספת MS buffer לפי הצורך. לאחר מכן, שטפו את המסננת עם 5 עד 10 מיליליטר של MS buffer, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגציה של תגלי היתרי התאים.

שחזר את המשקע ב-five milliliters של ACK red blood cell lysis buffer. לאחר חמישה דקות על קרח, 희דל את התמיסה עם 10 to 20 milliliters של MS buffer וסבב את התאים שוב בצנטריפוגה. בסיום הסבוב, הנח מסננת תאים של 30 micron מעל מבחנה קונית של 15 milliliter והרטב את המסננת עם one milliliter של MS buffer.

השHו את התאים ב-five milliliters של MS buffer טרי וסננו את תגלי התאים דרך המסננת כדי להסיר את צברי תאי הדם האדומים שעברו ליזיס. הוסיפו four milliliters של MS buffer טרי כדי לשטוף את מבחנת הליזיס הריקה והעבירו את השטיפה דרך המסננת. ספרו את התאים והקצו כמות מתאימה של splenocytes עבור בדיקת ה-extracellular flux.

לאחר מכן, השקיעו את שני סטים של התאים, כאשר דגימת הספלינוציטים עבור בדיקת ה-extracellular flux תוחזר לסuspended בחמישה מיליליטר של מצע RF 10 על קרח. החזירו לסuspended את התאים עבור בידוד באמצעות חרוזים (beads) בנפחים המתאימים של תערובת נוגדני ביוטין, מיקרו-חרוזי אנטי-ביוטין ו-MS buffer למשכי הדגירה המצוינים בטמפרטורה של 2 עד 8 °C. בסוף הדגירה השנייה, אספו את התאים באמצעות צנטריפוגציה והחזירו לסuspended את המשקע ב-500 microliters של MS buffer טרי עבור כל 1×10⁸ תאים.

לאחר מכן, העמיסו את העמודה המתאימה על מגנט ההפרדה, והשקו את העמודה בשלושה מיליליטר של MS buffer, תוך השלכת נוזל המעבר. הניחו מבחנה קונית סטרילית בנפח 15 מיליליטר מתחת לעמודה והעמיסו לעמודה את כל נפח דגימת התאים. לאחר מכן, שטפו את מבחנת דגירת התאים בשלושה מיליליטר של MS buffer טרי, ואספו את השטיפה אל המבחנה הקונית.

לאחר איסוף האלוציה האחרונה, מלאו את המבחנה לנפח סופי של 15 milliliters של MS buffer וסבבו במערכת צנטריפוגה את התאים שבודדו באופן שלילי. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע ב-5 milliliters של RF 10 medium טרי על קרח. לא יותר משלוש שעות לאחר הבידוד, סבבו בצנטריפוגה את כל דגימות התאים, והשעיקו מחדש את המשקעים ב-5 milliliters של מדיום הבדיקה המתאים לצנטריפוגה נוספת.

לאחר הצנטריפוגציה השנייה, השביחו מחדש את המשקעים בריכוז הניסויי המתאים כדי להגיע לנפח סופי של 180 microliters של תאים לכל באר במצע בדיקה רענן, והעבירו 180 microliters של תאים לכל באר בלוחית. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 25 דקות. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגציה ללוחית כדי להדביק את התאים באופן יציב לתחתית הבארה, והחזירו את הלוחית לאינקובטור.

לאחר 30 דקות, השתמש במיקרו-פיפט כדי להטעין את התרכובות הנחקרות, שהוכנו טריים בטמפרטורה של 37 degree Celsius, לתוך פתחי ההזרקה המתאימים של מחסנית החיישן של מנתח הזרימה החוץ-תאית (extracellular flux analyzer), והטען את פתחי הביקורת והפתחים שאינם חלק מהניסוי במצע בלבד. החזר את המחסנית הטעונה לאינקובטור והגדר את תוכנית בדיקת הזרימה החוץ-תאית. לאחר מכן, הטען את המחסית והפעל את התוכנית, והחלף את פלטת הכיול בפלטת הבדיקה לאחר סיום הכיול, כפי שיתבקש.

לאחר בדיקת השטף החוץ-תאי (extracellular flux assay), המשיכו למדידות תכולת החלבון. מעל 90% מכל אוכלוסיות התאים הם חיוניים, כאשר עבור הלימפוציטים נצפתה טהרה של 98 עד 99%. רמת ההתמזגות (confluence) של כל סוג תא תואמת לצפיפות הזריעה הראשונית.

ריכוזי החלבון בליסאט נמצאים במתאם ליניארי עם צפיפויות הזריעה, מה שמאשר שניתן להשתמש בריכוזי חלבון לצורך נורמליזציה מדויקת של נתוני שטף חוץ-תאי. מספר תאים גבוה יותר נמצא במתאם עם קצב צריכת חמצן נמדד גבוה יותר, וכן עם תגובות דרמטיות יותר למעכבי מיטוכונדריה. צפיפויות זריעה גבוהות יותר מובילות למדידות דומות של קצב צריכת חמצן מנורמל בתאי T ובספלנוציטים, בעוד ש-5 ו-1.25 כפול $10^5$ תאים לבאר מובילים למדידות דומות של קצב צריכת חמצן מנורמל בתאי B.

מדדי הנשימה המיטוכונדריאלית נמצאים גם הם במתאם לינארי עם צפיפויות הזריעה. בנוסף, דליפה נמוכה של פרוטונים מעידה על כך שמרבית הנשימה הבסיסית מוקדשת לסינתזת ATP. צפיפויות זריעה גבוהות יותר מובילות לקצבי חמצocene חוץ-תאיים גבוהים יותר ותגובות חזקות יותר למעכבי מיטוכונדריה.

פרמטרי הגליקוליזה נמצאים במתאם ליניארי עם צפיפויות זריעת התאים, כאשר צפיפות זריעה גבוהה נקבעה כאופטימלית ביותר לבדיקת עקה (stress assay) של גליקוליזה מוצלחת. גלוקוז מעורר קלות את הנשימה המיטוכונדריאלית, אשר נבלמת על ידי oligomycin, בעוד ש-2-DG אינו משפיע באופן משמעותי על צריכת החמצן. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בשישה עד שמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשאיר את התאים על קרח לפני ניתוח ה-extracellular flux, ולספור ולהעביר את התאיים לפלטה באופן מדויק. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מדידת הפוטנציאל המיטוכונדריאלי וספיגת גלוקוז, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע למצב המטבולי של התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן בידוד הלימפוציטים וביצוע בדיקת extracellular flux assay.